Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear
16 de dezembro de 2021
O presente protocolo descreve a preparação e a medição quantitativa de arginina e metil-argininas livres e ligadas a proteínas por espectroscopia de 1RMN-H.
Este protocolo permite quantificar os níveis e a dinâmica da metilação da arginina. Essa modificação desempenha importantes papéis regulatórios e pode servir como um biomarcador para a doença. A vantagem deste método é que ele fornece um fluxo de trabalho simples para um número quase ilimitado de matrizes que vão desde células, meios até tecidos e biofluidos.
A metilação da arginina é elevada em muitos tipos de câncer humanos e os primeiros inibidores das transferases do método da arginina são testados em ensaios clínicos. Esse método poderia ajudar na estratificação dos pacientes e na avaliação de riscos. Demonstrando o procedimento estará Hansjorg Habisch, um técnico de pesquisa do meu laboratório.
Para amostras líquidas, adicione 400 microlitros de metanol gelado a 200 microlitros da amostra, seguido de incubação por 30 minutos a menos 20 graus Celsius. Centrifugar esta amostra a 10.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Mova o sobrenadante e recolha o pellet em tubos de 1,5 mililitros.
Para materiais sólidos, adicione 600 microlitros de água a 66% de metanol em tubos de polpação contendo 30 a 60 miligramas de tecido ou pellets celulares. Homogeneizar o tecido mole uma vez por 20 segundos e o tecido rígido duas vezes por 20 segundos com um intervalo de cinco minutos entre eles. Coloque imediatamente a amostra no gelo e transfira todo o lisado para um novo tubo de 1,5 mililitro, seguido de incubação.
Em seguida, centrifugar a amostra a 10.000 G por 30 minutos. A quatro graus Celsius, selecione o sobrenadante em tubos de 1,5 mililitros e prossiga com a hidrólise de proteínas usando este sobrenadante. Truncar as tampas de cada tubo.
Em seguida, adicione 500 microlitros de nove molares de ácido clorídrico a cada amostra. Finalmente, coloque os tubos em tubos de vidro. Feche-os com tampas firmemente, garantindo a vedação adequada, e coloque esses tubos em um copo de vidro parcialmente cheio de areia.
Hidrolisar as amostras por 16 horas a 110 graus Celsius em uma câmara de secagem. Resfrie as amostras e liofilize-as durante a noite usando uma centrífuga de alto vácuo. No dia seguinte, dissolver os pellets completamente secos em um mililitro de ácido clorídrico 0,1 molar.
Adicione 50 microlitros de clorofórmio a cada tubo e dissolva completamente o pellet usando uma pipeta de 1.000 microlitros. Transfira o volume completo para um novo tubo e centrifugar as amostras por 10 minutos. Recolha cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico num novo tubo.
Use tubos de plástico para tubos manuais ou de vidro para extração robótica em fase sólida. Para a extração manual em fase sólida, pré-condicione os cartuchos em cada execução, seguido de uma centrifugação de um minuto. Depois disso, carregue a amostra em cartuchos SPE e centrifuja-os a 600 G por dois minutos à temperatura ambiente.
Lave os cartuchos com um mililitro de água três vezes, cada lavagem seguida de centrifugação por um minuto. Em seguida, lave cinco vezes com um mililitro de ácido clorídrico 0,1 molar, seguido de centrifugação por um minuto a 800 G à temperatura ambiente. Lave os cartuchos duas vezes com um mililitro de metanol seguido de centrifugação por um minuto.
Elute arginina e seus derivados em um único tubo de 15 mililitros, adicionando um mililitro de três soluções de substituição X e centrifugando duas vezes por um minuto. Para a extração robótica em fase sólida, coloque os tubos para coleta de eluídos e os tubos de vidro contendo a fase superior do líquido bifásico na respectiva posição do robô. Use um aplicativo ou método no software com base nas etapas descritas para o SPE manual.
Liofilizar as amostras durante a noite para secar completamente para se livrar de amônia e água. Dissolva cada amostra em 500 microlitros de tampão RMN até que se torne homogênea. Em seguida, transfira uma quantidade igual de amostra homogênea para cada tubo de RMN.
Os espectros J-RES de hidrolisados de proteínas de levedura purificados usando o protocolo SPE são mostrados aqui. Diferentes mudanças químicas características podem discriminar L-arginina e ADMA em 3,25 e 3,02 partes por milhão. Ambas as substâncias podem ser separadas e quantificadas em uma matriz celular.
Com base no número de prótons do grupo metilo ou metileno específico no respectivo deslocamento químico, uma espectroscopia de ressonância magnética nuclear H permite uma quantificação precisa. Usando essa abordagem, os deslocamentos químicos de ressonância magnética nuclear de um H de SDMA e MMA podem ser separados e quantificados por deslocamentos químicos característicos em 2,76 partes por milhão de SDMA e 2,74 partes por milhão de MMA. Ao executar este protocolo, colete cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico contendo a fração solúvel em água com uma pipeta e transfira-a para novos tubos.
Use tubos de 1,5 mililitros para SPE manual ou vidro de classe para SPE robótico. Evite derramar clorofórmio e seu conteúdo. Os eluídos contendo arginina e as espécies de arginina metilada são analisados por espectroscopia de RMN.
Isso produz quantidades absolutas dessas espécies. Nossa tecnologia é atualmente usada em uma infinidade de projetos de pesquisa básica com o objetivo de dissecar o papel fisiopatológico da metilação da arginina. Além disso, estamos avaliando a metilação da proteína arginina como um candidato a biomarcador em várias doenças humanas.
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Visão Geral
Este protocolo permite a quantificação dos níveis de metilação da arginina, que são significativos em diversos processos regulatórios e podem atuar como biomarcadores de doenças. O método é versátil, aplicável a uma ampla variedade de matrizes biológicas, incluindo células, meios de cultura, tecidos e fluidos biológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Pesquisa Clínica
Antecedentes
- A metilação da arginina desempenha papéis regulatórios cruciais em processos celulares.
- Essa modificação está elevada em muitos cânceres humanos.
- Inibidores das metiltransferases de arginina estão atualmente sendo testados em ensaios clínicos.
- A quantificação da metilação da arginina pode auxiliar na estratificação de pacientes e na avaliação de risco.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para medir arginina livre e arginina ligada a proteínas, bem como as metil-argininas.
- Explorar a dinâmica da metilação da arginina em diversos contextos biológicos.
- Avaliar o potencial da metilação da arginina como biomarcador para doenças.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras biológicas.
- Medição quantitativa utilizando espectroscopia por 1 H-RMN.
- Aplicação em diferentes matrizes, incluindo células e biofluidos.
- Demonstração do procedimento por um técnico de pesquisa.
Resultados Principais
- O protocolo quantifica com sucesso os níveis de metilação de arginina.
- Aplicabilidade demonstrada em uma variedade de amostras biológicas.
- Implicações potenciais para a pesquisa em câncer e avaliação de pacientes.
- Um fluxo de trabalho simples aumenta a acessibilidade para pesquisadores.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem direta para o estudo da metilação da arginina.
- Ele apresenta potencial para avançar a pesquisa em câncer e outras doenças.
- Aplicações futuras podem melhorar os resultados clínicos por meio de uma estratificação mais eficaz dos pacientes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da dinâmica da metilação da arginina apoia a validação de alvos em oncologia e programas de descoberta de biomarcadores. Este método baseado em RMN permite a medição precisa de ADMA, SDMA, MMA e arginina em diversas matrizes biológicas, fornecendo desvio mecanicista para testes de hipóteses terapêuticas. O fluxo de trabalho aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao associar níveis de modificações pós-traducionais a estados patológicos e resposta ao medicamento.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar a metilação da arginina como mecanismo regulatório na função proteica e nas vias de sinalização.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho robusto para quantificar espécies de arginina metilada em amostras biológicas complexas.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao correlacionar níveis de metilação com fenótipos de câncer e resposta terapêutica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas por RMN para arginina e seus derivados, permitindo a padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Inclui etapa de purificação por SPE para remover interferentes, garantindo detecção reprodutível em matrizes celulares.
- Valor Operacional: Compatível com plataformas de SPE manuais e robóticas para processamento escalável de amostras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a avaliação de biomarcadores mediante a medição da dinâmica da metilação de arginina em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal de alterações na metilação em modelos pré-clínicos e amostras de pacientes.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com base no risco ao fornecer dados de biomarcadores para estratificação de pacientes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a qualificação do biomarcador, permitindo decisões baseadas em dados em cada etapa.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação da metilação de arginina em resposta a perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos prontos para ensaio das espécies de metil-arginina após purificação por extração em fase sólida (SPE) e análise por RMN.
- Análise: Permite a quantificação absoluta por meio da integração do deslocamento químico em RMN de 1H, possibilitando comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica por meio da medição de biomarcadores em modelos de doenças.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para análise do metiloma de arginina em diversos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da medição direta dos estados de modificação pós-traducional.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio da purificação por extração em fase sólida (SPE) e detecção baseada em RMN.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar ou não ao associar níveis de metilação de arginina a mecanismos de doenças e sensibilidade a fármacos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos com base em evidências de biomarcadores obtidas do perfil de metilação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em hidrólise de proteínas, técnicas de extração em fase sólida (SPE) e operação de espectroscopia por RMN.
- Exige acesso a espectrômetros de RMN de alto campo e instrumentação para SPE (manual ou robótica).
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de preparação de amostras e análise de dados.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos de amostras (células, tecidos, fluidos biológicos) durante a hidrólise e extração.
- Inclui limitações práticas, como saturação da SPE em altas concentrações de arginina (3 mmol/L) e limite de sensibilidade (~100 nmol/L para ADMA).
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:58
Preliminary Sample Preparation
2:12
Protein Hydrolysis
3:21
Manual Solid-Phase Extraction
4:21
Robotic Solid Phase Extraction for NMR Sample Preparation
4:59
Results: Measurement of Arginine Methylome by NMR Spectroscopy
5:55
Conclusion
