Name: Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a quantificar metilação de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear em amostras biológicas. Este método simples auxilia na estratificação de pacientes e avaliação de risco em pesquisa oncológica.

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O trabalho foi apoiado pelas subvenções P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (Flagship project DYNIMO), Austrian Research Promotion Agency (FFG) grants 864690 e 870454, o Integrative Metabolism Research Center Graz; Programa Austríaco de Infraestrutura 2016/2017, o Governo da Estíria (Zukunftsfonds) e o Fundo de Inicialização para Talentos de Alto Nível da Fujian Medical University (XRCZX2021020). Agradecemos ao Centro de Pesquisa Médica pelo acesso às instalações de cultura de células. F.Z. foi treinado no âmbito do programa de doutorado em Medicina Molecular da Universidade Médica de Graz. Q.Z. foi treinado no âmbito do programa de doutorado Doenças Metabólicas e Cardiovasculares da Universidade Médica de Graz.

Hidrolisados de proteínas de levedura foram utilizados como amostras para os resultados representativos deste trabalho. Todo o protocolo está resumido na Figura 1.
1. Preparação de materiais e reagentes
<ol><li>Metanol/água: preparar uma mistura de duas partes de metanol a 99% (MeOH) e uma parte de H 2 O, designada como MeOH/H 2 O.Armazenar MeOH puro e MeOH/H2O a -20 °C para minimizar a evaporação do álcool e aumentar a estabilidade da amostra.</li>
	<li>Ácido clorídrico (HCl): dilui 9 mol/L a partir de HCl concentrado (12,0 mol/L ou 37%), bem como 0,1 mol/L de HCl. A solução mais concentrada (9 mol/L) é usada para hidrólise de proteínas, enquanto a solução mais concentrada (0,1 mol/L) é usada para extração em fase sólida. CUIDADO: Trabalhe dentro do exaustor.</li>
	<li>Preparar uma solução de substituição para SPE contendo 10% de uma solução saturada de amônia (estoque: 30% p/m de amônia), 50% de metanol e 40% de água (v/v).</li>
	<li>Tampão RMN: Dissolver 5,56 g de hidrogenofosfato dissódico (Na 2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sal de sódio (TSP, 5 mmol/L) de ácido propiônico 3-(trimetilsilil) 2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) de azida sódica (NaN3) em 500 mL de dióxido de deutério (D2O) e ajustar ao pH7,4 (usando HCl ou NaOH, respectivamente) (ver Tabela de Materiais). Verifique a pureza de cada novo lote tampão por espectroscopia de RMN. NOTA: A quantidade de quaisquer contaminantes (por exemplo, etanol) deve ser a mais baixa possível.</li>
	<li>Encha os tubos de polpação com esferas de óxido de zircônio (tubos de 2 mL e contas de 1,4 mm são adequados para a maioria das aplicações, mas diferentes variantes estão disponíveis) (consulte Tabela de Materiais). Encha cerca de 10-20 contas à mão ou compre tubos pré-cheios, que também estão disponíveis.</li>
	<li>Mantenha as pipetas e as respectivas pontas prontas na faixa de 10-1.000 μL. NOTA: Água altamente pura, designada como H 2O, definida por uma alta resistência de ≥18,2 MΩ·cm-1, foi utilizada durante todo o trabalho. Corresponde à água duplamente destilada.</li>
</ol>2. Recolha e armazenamento de amostras
<ol><li>Congelar rapidamente as amostras líquidas (soro/plasma, sobrenadante de cultura celular, etc.) com azoto líquido e armazená-las a -80 °C até à sua utilização.</li>
	<li>Prepare os materiais sólidos conforme mencionado abaixo.<ol><li>Coletar as células de culturas celulares (3-5 milhões de células), seja coletando células aderentes, após lavagem com solução salina tamponada com fosfato frio, raspagem e centrifugação, ou centrifugação direta de células cultivadas em suspensão.</li>
		<li>Remova os sobrenadantes celulares (que podem ser recolhidos para análise posterior, quer por medição directa consecutiva, ver passo 6, quer após precipitação de proteínas solúveis, ver passo 3.1) e, em seguida, congele rapidamente os pellets com azoto líquido e guarde a -80 °C. Para processamento adicional, consulte a etapa 3.2.</li>
		<li>Armazenar e recolher os tecidos de acordo com o objetivo do estudo. Para tecidos muito homogêneos, como o fígado ou o músculo, analise qualquer parte dele. Por exemplo, no caso de um cérebro de rato, determine a metilação global da arginina de todo o cérebro ou secções cerebrais. NOTA: O peso ideal dos tecidos a serem processados é de 30-60 mg. É aconselhável congelar e pulverizar todo o cérebro e usar alíquotas do mesmo. Alternativamente, partes específicas do cérebro (por exemplo, frontal, cerebelo, regiões occipitais ou um hemisfério, pesando ~250 mg) podem ser usadas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação preliminar da amostra
NOTA: Realizar o trabalho no gelo, mantendo o MeOH frio. As amostras também devem ser mantidas no gelo para evitar a degradação de proteínas.
<ol><li>Para as amostras líquidas, adicionar 400 μL de metanol gelado a 200 μL da amostra. Continue com a etapa 3.3. NOTA: Se houver menos amostra disponível, ajuste os volumes de acordo; A sensibilidade à RMN geralmente é alta o suficiente para quantidades menores de amostra, mas deve ser testada individualmente.</li>
	<li>No caso de materiais sólidos, preparar tubos suficientes de 1,5 mL para os lisados (uso para centrifugação após homogeneização).<ol><li>Cuidadosamente, mas completamente, ressuspenda os pellets celulares em 600 μL de MeOH/H2O e transfira toda a fase líquida para os tubos de polpa.</li>
		<li>Coloque os tecidos em tubos de polpação (você pode pesá-los diretamente nos tubos) e adicione 600 μL de MeOH / H2O (para 30-60 mg; ajuste se o peso diferir substancialmente).</li>
		<li>Coloque os tubos no homogeneizador de tecido (ver Tabela de Materiais) e homogeneize uma vez por 20 s com agitação pesada (para pellets celulares, tecidos moles) ou duas vezes por 20 s cada (ou mais, se necessário) com um intervalo de 5 minutos entre eles (para tecidos rígidos).</li>
		<li>Após a homogeneização, coloque imediatamente as amostras no gelo novamente e transfira todos os lisados para novos tubos de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservar as amostras durante, pelo menos, 30 minutos (até vários dias) a -20 °C antes de continuar a ser processado.</li>
	<li>Centrífuga a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Enquanto isso, prepare tubos suficientes de 1,5 mL para coletar os sobrenadantes. NOTA: Esse sobrenadante (designado "(1)" na Figura 1) pode ser descartado, liofilizado e processado diretamente para RMN (etapa 6) ou analisado de outra forma.</li>
	<li>Neste protocolo, o precipitado de MeOH (= pellet obtido após as etapas 3.1 ou 3.2.2, respectivamente) é usado para análises posteriores contendo, entre outras coisas, componentes como ácidos nucleicos e lipídios, proteínas metiladas com arginina. Continue com a hidrólise de proteínas ou armazene os pellets a -20 °C durante alguns dias.</li>
</ol>4. Hidrólise de proteínas
<ol><li>Adicionar 500 μL de 9 mol/L de HCl a cada amostra. Em seguida, truncar as tampas de cada tubo com uma tesoura e colocá-las nos tubos de cultura de vidro (Figura 2A). Cuidadosamente, mas com força, feche as tampas vermelhas (verificando assim a vedação). NOTA: Antes de usar, sempre verifique cada vedação (folha de PTFE cinza dentro das tampas de rosca vermelhas) para o aperto adequado e limpe-as regularmente com água.</li>
	<li>Quando terminar, colocar os tubos num copo parcialmente cheio de areia (para uma melhor transferência de calor) e hidrolisar as amostras durante cerca de 16 h a 110 °C numa câmara de secagem.</li>
	<li>Após a hidrólise, arrefecer as amostras (~1 h).</li>
	<li>Depois disso, liofilize durante a noite usando uma centrífuga com alto vácuo (abaixo de 100 Pa).</li>
	<li>Dissolva os pellets - se completamente secos (se não, continue a liofilização) - em 1 mL de HCl 0,1 mol/L e adicione 50 μL de clorofórmio (CHCl3) a cada tubo; dissolver completamente o pellet com uma pipeta de 1.000 μL, misturando assim os líquidos e, em seguida, transferir o volume completo para um novo tubo. CUIDADO: Sempre trabalhe com pequenas quantidades para minimizar a evaporação extensiva</li>
	<li>Em seguida, centrifugar a 8.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Recolher cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico que contém a fracção solúvel em água (Figura 2B, a fracção com a densidade inferior) com uma pipeta e enchê-la em novos tubos. Utilizar tubos de 1,5 ml para SPE manual (secção 5.2) ou frascos para injetáveis de vidro para SPE robótico (secção 5.3 e Figura 2D). Evitar transbordar sobre CHCl3 e seu conteúdo (Figura 2C).</li>
</ol>5. Extração em fase sólida (SPE)
<ol><li>Antes da primeira utilização, limpar os cartuchos SPE duas vezes com 1 ml da solução de substituição (passo 1.3) seguido de centrifugação a 800 x g durante 1 min à temperatura ambiente (colocados em tubos de 15 ml). Eles podem ser usados 10-20 vezes cada.</li>
	<li>Manual SPE<ol><li>Pré-condicione os cartuchos (ver Tabela de Materiais) em cada corrida com 1 mL de metanol puro e 2 x 1 mL de PBS, cada vez seguida de centrifugação a 800 x g por 1 min à temperatura ambiente (colocados em tubos de 15 mL).</li>
		<li>Depois disso, carregar as amostras (a partir da etapa 4.7) nos cartuchos SPE e centrifugar-as a 600 x g durante 2 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Em seguida, aplique um ciclo de lavagem como mencionado abaixo.<ol><li>Adicionar três vezes 1 mL de H2O (cada um seguido de centrifugação por 1 min a 800 x g à temperatura ambiente).</li>
			<li>Adicionar cinco vezes 1 mL de HCl 0,1 mol/L (cada um seguido de centrifugação por 1 min a 800 x g à temperatura ambiente).</li>
			<li>Adicionar duas vezes 1 mL de MeOH (cada uma seguida de centrifugação por 1 min a 800 x g à temperatura ambiente).</li>
		</ol></li>
		<li>Em seguida, eluir arginina e seus derivados com 3 x 1 mL de solução de reposição (seguida de centrifugação 1 min a 800 x g à temperatura ambiente) em um único tubo de 15 mL. NOTA: A solução de substituição serve como eluente para a arginina e derivados e também é utilizada para limpar os cartuchos (todas as substâncias são lavadas antes da eluição ou no valor de pH básico da solução de substituição). Ainda assim, para evitar a contaminação ao longo do tempo, a reutilização deve ser limitada (ver passo 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>SPE robótico NOTA: Aqui, um robô de pipetagem (a parte principal consiste em uma agulha de pipetagem, uma estação de lavagem para a agulha, um suprimento de reagente e posições para amostras e eluatos, consulte Tabela de Materiais) é fornecido com um suporte de cartucho para as colunas SPE. Para outros instrumentos, certifique-se de estar totalmente equipado com todas as coisas listadas.<ol><li>Encher o sobrenadante (a partir da etapa 4.7) diretamente em frascos de vidro com vedação de PTFE (Figura 2D), preparar reagentes suficientes (100 mL de cada, ou seja, solução de reposição, 99% de MeOH, PBS, H 2 O e 0,1 de mol/L HCl), tubos de 5 mL para eluição e solução de lavagem para a agulha do robô (geralmente H2O).</li>
		<li>Use um aplicativo ou método no software do robô com base precisamente nas etapas descritas para o SPE manual (etapa 5.2). NOTA: Os detalhes podem variar muito entre os fornecedores de instrumentos, por isso consulte o manual de software do respectivo robô para programação. Um robô de pipetagem geralmente funciona aplicando pressão de ar sobre os cartuchos em vez de centrifugação, que é a principal diferença. Se o protocolo for estabelecido e executado pela primeira vez, inclua controles (por exemplo, L-arginina de concentração conhecida) para verificar um fluxo de trabalho ideal.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparação final para a RMN
<ol><li>Liofilizar amostras durante a noite para completar a secura para se livrar de amônia e H2O.</li>
	<li>Dissolver cada amostra em 500 μL de tampão RMN (passo 1.4) e transferir para tubos de RMN. É importante ressaltar que o volume deve ser o mesmo em todos os tubos, e as amostras devem ser homogêneas (livres de resíduos e lipídios, que tendem a se agregar). NOTA: Os detalhes da espectroscopia de RMN vão além desta revisão do método e são descritos em mais detalhes em outro lugar27. Aqui, apenas os principais requisitos e etapas são explicados. A quantificação da arginina e dos seus metabolitos é realizada num espectrómetro de RMN de 600 MHz (ver Tabela de Materiais). Em princípio, qualquer outro espectrômetro de RMN/intensidades de campo de RMN pode ser usado, desde que os sinais de RMN de arginina e argininas metiladas possam ser detectados com sensibilidade suficiente e sem sobreposição de sinal. Qualquer cabeça de sonda com gradientes de eixo z capaz de registrar 1espectros H pode ser usada, desde que as sequências de pulso sejam configuradas de acordo.</li>
	<li>Grave um espectro 1D usando a sequência de pulsos CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 varreduras, tamanho do fid 73728, largura espectral de 11904,76 Hz em uma RMN de 600 MHz, atraso de reciclagem 4 s) com supressão do sinal de água usando pré-saturação.</li>
	<li>Nesses experimentos, remova os acoplamentos escalares de 1H por desacoplamento virtual, reduzindo a sobreposição de sinal. Registre adicional para questões específicas e/ou amostras ou matrizes complexas, por exemplo, 1espectro H-13C-heteronuclear de coerência quântica única (HSQC)27. NOTA: Para matrizes mais complexas nas quais sinais de RMN 1 H de argininas metiladas podem ser parcialmente sobrepostos com sinais de RMN 1H de outros metabólitos (por exemplo, lisina), são necessários espectros J-resolved homonucleares 1H (JRES)35.</li>
	<li>Realizar quantificação absoluta integrando as respectivas intensidades de pico de padrões de uma concentração conhecida, por exemplo, 100 μmol/arginina. NOTA: Rotineiramente, ADMA, SDMA e MMA (ver Tabela de Materiais) são relatados como uma proporção relativa à arginina. Isso tem uma vantagem significativa de que nenhuma normalização separada (por exemplo, número de células, massa tecidual, concentrações de proteínas) precisa ser realizada. Nesse caso, a arginina serve como um padrão interno, e a quantificação relativa é suficiente para obter informações biologicamente relevantes.</li>
	<li>Para diferenciação de SDMA e MMA, liofilizar as amostras novamente para se livrar de D2O (se já tiverem sido ressuspensas em tampão RMN antes), que é então substituído por dimetilsulfóxido deuterado (d 6-DMSO), possibilitando a resolução das ressonâncias metílicas27. Portanto, aspirar as amostras dos tubos de RMN com pipetas de Pasteur, liofilizar e dissolvê-las em 500 μL de d6-DMSO.</li>
</ol>

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<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Na seção a seguir, o foco principal está no próprio método; as implicações biológicas da metilação da arginina são descritas na seção Introdução.
Em primeiro lugar, tecidos de rigidez diferente podem precisar de ajuste da lise da amostra: células da cultura de células (incluindo bactérias, leveduras, etc.) e tecidos como cérebro, fígado jovem, músculo liso, etc., podem ser rapidamente homogeneizados. Para tecidos de alta rigidez (incluindo fígado de idosos, artérias, ossos, etc.), a homogeneiz...

Durante as últimas duas décadas, a metilação de resíduos de arginina tem sido reconhecida como uma modificação pós-translacional essencial de proteínas. Afeta processos biológicos fundamentais, como regulação da transcrição, transdução de sinal e muitos outros1. As principais proteínas envolvidas na regulação da metilação da arginina são as proteínas argininas metiltransferases (PRMTs)2. Os principais derivados da arginina são ω-(N G,N G)-dimetilarginina assimétrica (ADMA), dimetilarginina simétrica ω-(N G,N'G)-simétrica (SDMA) e ω-N G-monometilarginina (MMA)2.
Os PRMTs usam S-adenosil-l-metionina para transferir grupos metil para o grupo guanidino terminal (com dois grupos amino equivalentes) de arginina ligada a proteínas1. Duas enzimas principais podem ser distinguidas: ambas as enzimas tipo I e tipo II catalisam a primeira etapa de metilação para formar MMA (que, assim, perde sua simetria). Após essa etapa, as enzimas do tipo I (por exemplo, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) usam o MMA como substrato para formar o ADMA, enquanto as enzimas do tipo II (principalmente PRMT5 e PRMT9) produzem SDMA. A PRMT1 foi a primeira proteína arginina metiltransferase a ser isolada de células de mamíferos3. Ainda assim, os PRMTs foram conservados evolutivamente4 em outros animais, como vertebrados não mamíferos, cordados de invertebrados, equinodermos, artrópodes e nematoides cnidários5, plantas6 e protozoários, incluindo fungos como leveduras7. Em muitos casos, o knockout de um dos PRMTs leva à perda de viabilidade, revelando o papel essencial das espécies de arginina metilada envolvidas em processos celulares fundamentais como transcrição, tradução, transdução de sinal, apoptose e separação de fase líquido-líquido (o que significa a formação de organelas sem membrana, por exemplo, nucléolos), que envolve regularmente domínios ricos em arginina 8,9,10 . Por sua vez, isso influencia a fisiologia e os estados patológicos, incluindo câncer 11,12,13, mieloma múltiplo 14, doenças cardiovasculares 15, patogênese viral, atrofia muscular espinhal 16, diabetes mellitus 17 e envelhecimento1. Acredita-se que o aumento dos níveis de ADMA na corrente sanguínea, por exemplo, derivado do pulmão18 devido à quebra de proteínas, esteja relacionado à disfunção endotelial, doença pulmonar crônica19 e outras síndromes de doença cardiovascular20. Verificou-se que a superexpressão de PRMTs acelera a tumorigênese e está associada a um prognóstico desfavorável21,22. Além disso, a ablação de PRMT6 e PRMT7 desencadeia um fenótipo de senescência celular23. Diminuição significativa da ADMA e PRMT1 foram encontradas durante o envelhecimento dos fibroblastos WI-3824.
O desafio é entender como a metilação atua nos processos fisiopatológicos é identificar e quantificar a metilação da arginina proteica. A maioria das abordagens atuais usa anticorpos para detectar argininas metiladas. No entanto, esses anticorpos ainda são específicos do contexto e podem não reconhecer diferentes motivos de proteínas metiladas de arginina25,26. No protocolo descrito, todos os derivados de arginina mencionados anteriormente podem ser quantificados de forma confiável por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), ou seja, isoladamente, em combinação ou, como na maioria dos casos, dentro de matrizes biológicas complexas como células eucarióticas (por exemplo, de levedura, camundongo ou origem humana) e tecidos27, bem como soro28. Para proteínas e matrizes complexas, a hidrólisede proteínas 29 é um pré-requisito para gerar aminoácidos livres (modificados), como arginina, MMA, SDMA e ADMA. A extração em fase sólida (SPE)30 possibilita o enriquecimento dos compostos de interesse. Finalmente, 1espectroscopia de RMN-H permite a detecção paralela de arginina e todos os principais derivados metílicos da arginina. A espectroscopia de RMN traz a vantagem de ser genuinamente quantitativa, altamente reprodutível e uma técnica robusta31,32. As medições finais de RMN podem ser feitas depois, quando muitas amostras tiverem sido coletadas e preparadas. Finalmente, este protocolo se concentra principalmente na preparação da amostra, pois isso não requer um espectrômetro de RMN próprio. Pode ser realizado na maioria dos laboratórios bioquímicos. Ainda assim, algumas dicas sobre quais medições de espectroscopia de RMN devem ser feitas são fornecidas neste trabalho.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>ácido 3-(trimetilsilil) propiônico-2,2,3,3-d4 sal de sódio (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 5 mL, fundo redondo</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Solução de amônia 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Espectrômetro de RMN, equipado com uma cabeça de sonda TXI</td><td>Bruker</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga, refrigerada, por exemplo, 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio &ge; 99% a.a.</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>fluido de transferência de calor para sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Óxido de deutério (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Secagem</td><td>Aglutinante</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura DURAN, 13 x 100 mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Bomba de óleo de vácuo profundo RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>parte do sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de 1,5 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Robô de pipetagem Gilson GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td></td><td></td>26150008</tr><tr><td>L-arginina</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Metanol &ge; 99%</td> <td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q aparatus de água</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc / 30 mg, cartuchos de 1 mL</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr> solução <tr><td>salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogeneizador de tecidos</td><td>Bertin Instrumentos</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr> <tr><td>Tubos Precellys (tubos de polpação)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Esferas de óxido de zircónio Precellyse de 1,4 mm</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Módulos de aquecimento, agitação e evaporação Reacti-Therm/ReactiVap</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td></tr><tr><td>Rotor para tubos de 1,5 mL, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Refrigerated Cooling Trap</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>parte do Sistema SpeedVac</td></tr><tr><td>Concentrador de vácuo Savant SpeedVac SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>parte do Sistema SpeedVac; equipado com rotor para tubos de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Tampas de rosca para frascos de vidro com vedação de PTFE, DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro de rosca curta 1,5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker-https://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-dimetilarginina assimétrica (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monometilarginina (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-dimetilarginina simétrica (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

A arginina ligada a proteínas é comumente metilada em muitas proteínas e regula sua função alterando as propriedades físico-químicas, sua interação com outras moléculas, incluindo outras proteínas ou ácidos nucleicos. Este trabalho apresenta um protocolo de fácil implementação para quantificação da arginina e seus derivados, incluindo dimetilarginina assimétrica e simétrica (ADMA e SDMA, respectivamente) e monometilarginina (MMA). Após o isolamento proteico de fluidos corporais biológicos, tecidos ou lisatos celulares, um método simples para homogeneização, precipitação de proteínas e hidrólise de proteínas é descrito. Como os hidrolisados contêm muitos outros componentes, como outros aminoácidos, lipídios e ácidos nucleicos, uma etapa de purificação usando a extração em fase sólida (SPE) é essencial. O SPE pode ser realizado manualmente usando centrífugas ou um robô de pipetagem. A sensibilidade para ADMA usando o protocolo atual é de cerca de 100 nmol/L. O limite superior de detecção de arginina é de 3 mmol/L devido à saturação de SPE. Em resumo, este protocolo descreve um método robusto, que abrange desde a preparação biológica da amostra até a detecção baseada em RMN, fornecendo dicas e armadilhas valiosas para o trabalho bem-sucedido ao estudar o metiloma da arginina.

Rotineiramente, projeções 1H 1D de espectros de RMN 2D J-resolvidos (JRES), virtualmente desacoplados, são usadas para atribuições e quantificações de pico em nosso laboratório36. A Figura 3 mostra espectros JRES representativos de hidrolisados de proteínas de levedura purificados usando o presente protocolo SPE. Embora em concentrações muito diferentes, ambas as substâncias podem ser separadas e quantificadas em uma matriz celular. Com base no número de pr...

O presente protocolo descreve a preparação e a medição quantitativa de arginina e metil-argininas livres e ligadas a proteínas por espectroscopia de 1RMN-H.

Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Este protocolo permite quantificar os níveis e a dinâmica da metilação da arginina. Essa modificação desempenha importantes papéis regulatórios e pode servir como um biomarcador para a doença. A vantagem deste método é que ele fornece um fluxo de trabalho simples para um número quase ilimitado de matrizes que vão desde células, meios até tecidos e biofluidos.A metilação da arginina é elevada em muitos tipos de câncer humanos e os primeiros inibidores das transferases do método da arginina são testados em ensaios clínicos. Esse método poderia ajudar na estratificação dos pacientes e na avaliação de riscos. Demonstrando o procedimento estará Hansjorg Habisch, um técnico de pesquisa do meu laboratório.Para amostras líquidas, adicione 400 microlitros de metanol gelado a 200 microlitros da amostra, seguido de incubação por 30 minutos a menos 20 graus Celsius. Centrifugar esta amostra a 10.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Mova o sobrenadante e recolha o pellet em tubos de 1,5 mililitros.Para materiais sólidos, adicione 600 microlitros de água a 66% de metanol em tubos de polpação contendo 30 a 60 miligramas de tecido ou pellets celulares. Homogeneizar o tecido mole uma vez por 20 segundos e o tecido rígido duas vezes por 20 segundos com um intervalo de cinco minutos entre eles. Coloque imediatamente a amostra no gelo e transfira todo o lisado para um novo tubo de 1,5 mililitro, seguido de incubação.Em seguida, centrifugar a amostra a 10.000 G por 30 minutos. A quatro graus Celsius, selecione o sobrenadante em tubos de 1,5 mililitros e prossiga com a hidrólise de proteínas usando este sobrenadante. Truncar as tampas de cada tubo.Em seguida, adicione 500 microlitros de nove molares de ácido clorídrico a cada amostra. Finalmente, coloque os tubos em tubos de vidro. Feche-os com tampas firmemente, garantindo a vedação adequada, e coloque esses tubos em um copo de vidro parcialmente cheio de areia.Hidrolisar as amostras por 16 horas a 110 graus Celsius em uma câmara de secagem. Resfrie as amostras e liofilize-as durante a noite usando uma centrífuga de alto vácuo. No dia seguinte, dissolver os pellets completamente secos em um mililitro de ácido clorídrico 0,1 molar.Adicione 50 microlitros de clorofórmio a cada tubo e dissolva completamente o pellet usando uma pipeta de 1.000 microlitros. Transfira o volume completo para um novo tubo e centrifugar as amostras por 10 minutos. Recolha cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico num novo tubo.Use tubos de plástico para tubos manuais ou de vidro para extração robótica em fase sólida. Para a extração manual em fase sólida, pré-condicione os cartuchos em cada execução, seguido de uma centrifugação de um minuto. Depois disso, carregue a amostra em cartuchos SPE e centrifuja-os a 600 G por dois minutos à temperatura ambiente.Lave os cartuchos com um mililitro de água três vezes, cada lavagem seguida de centrifugação por um minuto. Em seguida, lave cinco vezes com um mililitro de ácido clorídrico 0,1 molar, seguido de centrifugação por um minuto a 800 G à temperatura ambiente. Lave os cartuchos duas vezes com um mililitro de metanol seguido de centrifugação por um minuto.Elute arginina e seus derivados em um único tubo de 15 mililitros, adicionando um mililitro de três soluções de substituição X e centrifugando duas vezes por um minuto. Para a extração robótica em fase sólida, coloque os tubos para coleta de eluídos e os tubos de vidro contendo a fase superior do líquido bifásico na respectiva posição do robô. Use um aplicativo ou método no software com base nas etapas descritas para o SPE manual.Liofilizar as amostras durante a noite para secar completamente para se livrar de amônia e água. Dissolva cada amostra em 500 microlitros de tampão RMN até que se torne homogênea. Em seguida, transfira uma quantidade igual de amostra homogênea para cada tubo de RMN.Os espectros J-RES de hidrolisados de proteínas de levedura purificados usando o protocolo SPE são mostrados aqui. Diferentes mudanças químicas características podem discriminar L-arginina e ADMA em 3,25 e 3,02 partes por milhão. Ambas as substâncias podem ser separadas e quantificadas em uma matriz celular.Com base no número de prótons do grupo metilo ou metileno específico no respectivo deslocamento químico, uma espectroscopia de ressonância magnética nuclear H permite uma quantificação precisa. Usando essa abordagem, os deslocamentos químicos de ressonância magnética nuclear de um H de SDMA e MMA podem ser separados e quantificados por deslocamentos químicos característicos em 2,76 partes por milhão de SDMA e 2,74 partes por milhão de MMA. Ao executar este protocolo, colete cuidadosamente a fase superior do líquido bifásico contendo a fração solúvel em água com uma pipeta e transfira-a para novos tubos.Use tubos de 1,5 mililitros para SPE manual ou vidro de classe para SPE robótico. Evite derramar clorofórmio e seu conteúdo. Os eluídos contendo arginina e as espécies de arginina metilada são analisados por espectroscopia de RMN.Isso produz quantidades absolutas dessas espécies. Nossa tecnologia é atualmente usada em uma infinidade de projetos de pesquisa básica com o objetivo de dissecar o papel fisiopatológico da metilação da arginina. Além disso, estamos avaliando a metilação da proteína arginina como um candidato a biomarcador em várias doenças humanas.

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Dois métodos para atribuir os sinais de ressonância magnética nuclear de α e ε-dimetilamina de uma lisina N-terminal 13C-metilada redutora são descritos. Um método utiliza a seletividade induzida pelo pH da reação de metilação redutiva e o outro usa aminopeptidase para remover seletivamente a lisina N-terminal.

Métodos para identificar as ressonâncias de RMN da amina N-terminal 13C-dimetil em proteínas metiladas redutivamente

Proteína arginina metilação, catalisada por uma classe de enzimas viz., Proteína arginina metil transferases (PRMTs), é o processo de adição enzimática do grupo (s) metilo para argininas dentro proteínas. O ensaio de metilação in vitro é a ferramenta mais confiável para avaliar o estado de metilação de substratos PRMT conhecidos ou novos.

A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação

As matrizes de peptídeos sintetizadas pelo método SPOT podem ser usadas para analisar a especificidade do substrato das proteínas lisina metiltransferases (PKMTs) e para definir o espectro de substrato das PKMTs para entender seu papel biológico. Este protocolo descreve como sintetizar matrizes de peptídeos, metilá-las com PKMTs e analisar os resultados.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

A metilação do DNA é capaz de manter níveis estáveis de expressão gênica, além de permitir mudanças dinâmicas na expressão gênica em resposta a uma variedade de estímulos. Detalhamos técnicas que permitem o estudo de alterações específicas de genes na metilação do DNA e o efeito dessas mudanças na expressão gênica.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

Esses protocolos fornecem a metodologia utilizada para avaliar a atividade enzimática de membros individuais da família de proteínas metiltransferase (PRMT) nas células. Diretrizes detalhadas sobre a avaliação da atividade prmt usando biomarcadores endógenos e exógenos, anticorpos de reconhecimento de metila-arginina e compostos de ferramentas inibidoras são descritos.

Métodos Quantitativos para Estudar Proteína Arginina Metiltransferase 1-9 Atividade em Células

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a aquisição, processamento e análise de uma série de experimentos de RMN destinados a caracterizar as interações proteína-glicano em solução. As metodologias mais comuns baseadas em ligantes e proteínas são descritas, o que, sem dúvida, contribui para os campos da glicobiologia estrutural e estudos de reconhecimento molecular.

Desembaraçando as interações glicano-proteína: ressonância magnética nuclear (RMN) para o resgate

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar semi-quantitativamente os níveis globais de m⁶A usando dot blot. O RNA total é extraído, desnaturado, manchado em uma membrana de náilon, sondado com anticorpo anti-m⁶A e visualizado por quimioluminescência. A intensidade do sinal, quantificada pela análise em escala de cinza ImageJ, reflete a abundância relativa de metilação, proporcionando um fluxo de trabalho reprodutível para pesquisas.

Ensaio Dot Blot para Detectar Níveis Globais de Modificação do RNAN 6-metiladenosina

A polarização nuclear dinâmica com subsequente dissolução da amostra permitiu estudos em tempo real do metabolismo em sistemas biológicos. O piruvato de [1-13C]hiperpolarizado foi usado para estudar a atividade da lactato desidrogenase em uma linhagem celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

Aprenda a quantificar metilação de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear em amostras biológicas. Este método simples auxilia na estratificação de pacientes e avaliação de risco em pesquisa oncológica.

Explorando o metiloma de arginina por espectroscopia de ressonância magnética nuclear

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