Name: Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a criar modelos 3D de distribuição de metabolitos durante infecção por tripanosomatídeos usando cartografia química. Este método permite mapear metabolicamente a relação entre parasita e tecido.

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Laura-Isobel McCall, PhD, é investigadora do Prêmio Patogênese de Doenças Infecciosas do Burroughs Wellcome Fund. Os autores ainda desejam reconhecer o apoio do número de prêmio NIH R21AI148886, uma bolsa piloto do Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) sob o número do prêmio NIH P20GM103648, e fundos de start-up da Universidade de Oklahoma (para LIM). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos financiadores. Os autores também desejam agradecer aos desenvolvedores das ferramentas utilizadas neste protocolo. Todas as publicações relevantes foram citadas, quando aplicável.

Não há conflitos de interesse para relatar.

Entender infecções por tripanosomatidas é essencial para orientar novas abordagens de desenvolvimento e tratamento de medicamentos. Este método de cartografia química está exclusivamente preparado para fornecer insights acionáveis sobre a relação entre o metabolismo e a patogênese da doença trypanosomatida, abordando assim essa necessidade translacional.
Apenas solventes de grau LC-MS são recomendados durante a extração metabólito e análises de MS, para diminuir a contaminação de fundo. A contaminação polimérica35, comumente derivada de filme de parafina e/ou outros plásticos36,37,38, deve ser evitada sempre que possível. O parafilme, em particular, nunca deve ser usado. Esses aspectos são cruciais, uma vez que a qualidade dos dados da LC-MS depende dos materiais utilizados durante a preparação da amostra e a extração metabólica. A qualidade dos dados deve ser garantida antes de gerar 'ili parcelas. Além disso, a geração desses mapas abrangentes de metabolômica espacial requer a coleta de todas as amostras de tecido adjacentes e extração metabólica de todas as amostras coletadas para evitar lacunas nesses mapas. Os procedimentos de coleta, a logística de extração metabólica e a análise da LC-MS, e os custos devem, portanto, ser considerados e planejados em conformidade.
Este protocolo pode ser modificado para atender às necessidades do usuário de várias maneiras. Por exemplo, a polaridade e solubilidade dos solventes usados durante a extração metabólito influenciará o que os metabólitos são detectados39. Para maximizar a diversidade de características metabólicas detectadas para análises de cartografia química não-diretas, recomenda-se a combinação de múltiplas etapas de extração e solventes. Por exemplo, este método utiliza diclorometano, metanol e água como solventes de extração porque permitem a detecção precisa de moléculas não polares20,40. No entanto, esses solventes não são universalmente adequados para cada experimento de ESM, e os pesquisadores devem selecionar solventes de extração com base nos objetivos de seu projeto. Da mesma forma, podem ser utilizadas diferentes condições de LC-MS/MS, como a substituição da cromatografia de fase inversa por cromatografia de fase normal. Colunas alternativas também podem ser usadas para coleta de dados em fase inversa em vez de cromatografia C8, embora empiricamente, a cromatografia C8 é mais robusta aos lipídios teciduais e tem menor frequência de entupimento. Conceitualmente, esses protocolos também podem ser aplicados a outros métodos de espectrometria de massa, como espectrometria de massa cromatografia gasosa, etc.
Uma abordagem alternativa é a imagem de espectrometria em massa. De fato, ao contrário das abordagens de imagem de espectrometria de massa de massa, a espectrometria de massa cromatografia líquida não preserva inerentemente informações espaciais10. A cartografia química aborda a ponte, incluindo a localização amostral no momento da conceituação do projeto, nos metadados amostrais e nas etapas de processamento de dados. Uma força dessa abordagem de cartografia química, ao contrário da imagem de espectrometria de massa, é a capacidade de fornecer anotações confiantes (Metabolomics Standards Initiative nível 1 ou nível 2 de anotação de confiança41), ao contrário da imagem de espectrometria de massa onde a maior parte das aplicações depende de massa precisa apenas para anotação. A imagem da espectrometria de massa permitirá o mapeamento espacial de grãos finos, às vezes até o nível de célula única, por exemplo, 42,43. Em contraste, as abordagens de cartografia química permitem o mapeamento em larga escala de distribuição de metabólitos sem exigir habilidades altamente especializadas de crioseção animal inteiro. A cartografia química fornece evidências complementares às muitas abordagens transcriômicas espaciais que estão sendo desenvolvidas, por exemplo, 44, com a vantagem de se concentrar na camada 'omics mais próxima do fenótipo'45. Métodos alternativos para quantificação da carga de parasitas incluem medir a bioluminescência no momento da coleta da amostra6. Segmentos finos também podem ser coletados para permitir microscopia confocal ou eletrônica para avaliar a carga de parasitas localizadas e danos teciduais. A homogeneização da água, que é usada para quantificação de citocinas neste protocolo e publicações anteriores13, também poderia ser usada para quantificar marcadores à base de proteínas de danos teciduais.
Há também várias maneiras de obter modelos 3D adequados para traçar os dados LC-MS resultantes. Além do método sugerido aqui, os modelos podem ser adquiridos pré-fabricados de vários fornecedores online. Certifique-se de que os termos de uso correspondem ao uso pretendido, especialmente no que diz respeito à publicação. Modelos para órgãos grandes podem ser gerados de novo usando scanners 3D de acordo com as instruções do scanner. Alternativas como o MATLAB existem para gerar e visualizar modelos 3D para cartografia química46, mas foram implementadas principalmente antes do desenvolvimento do ili16. O MATLAB é um conjunto de ferramentas de análise e programação de dados que oferece uma grande variedade de aplicações em muitos campos. No entanto, o MATLAB não é gratuito nem de código aberto, e requer familiaridade com as interfaces MATLAB, especialmente considerando que o MATLAB não foi desenvolvido para o processamento de dados de espectrometria em massa. As alternativas deste método proposto, ou seja, SketchUp, Meshlab e 'ili, são livremente acessíveis, fáceis de usar e oferecem funções semelhantes como MATLAB para fins de cartografia química.
Este método é robusto no que diz respeito à preparação da amostra e à extração metabólica. A solução de problemas é mais frequentemente necessária na etapa de aquisição de dados LC-MS. Isso está além do escopo deste artigo. Os leitores são direcionados para excelentes publicações sobre a solução de problemas de aquisição de dados LC-MS, incluindo 20,47. Da mesma forma, as complexidades da anotação metabólito estão além do escopo do foco deste método na geração de modelos 3D. Referências úteis sobre este tema incluem24,25,48,49.
Embora este método explore efetivamente a patogênese da doença, há limitações para essa abordagem, algumas das quais são comuns em qualquer experimento metabolômico. Uma dessas limitações é a baixa taxa de anotação dos recursos do LC-MS50, que depende da disponibilidade e qualidade das bibliotecas espectrais de referência. Outra limitação é que este protocolo não preserva o mRNA devido à incompatibilidade de reagentes de preservação de RNA, como o RNAlater com a análise LC-MS/MS. No entanto, a qualidade da proteína é adequada para análises a jusante e, portanto, pode substituir análises baseadas em mRNA.
Uma abordagem de cartografia química para a patogênese da infecção reflete diretamente como infecções bacterianas, virais ou parasitárias se desenvolvem em sistemas de órgãos e causam doenças localizadas. Analisar essas subsampleções regionais e gerar modelos 3D finalmente transmite como os metabólitos funcionam através do espaço tridimensional, lançando luz sobre essas dimensões espaciais não reconhecidas anteriormente da biologia molecular. Usando este protocolo, por exemplo, a localização metabólica foi comparada com a carga de parasitas Trypanosoma cruzi. Os resultados esclareceram a relação entre o patógeno e o tecido hospedeiro e também demonstraram a dinâmica metabólica da progressão dos sintomas da doença de Chagas6. Métodos de cartografia química também têm sido aplicados a diversos temas, como a interação ambiente construída pelo homem51,52,53, a composição química de sistemas de órgãos como pele humana46 e pulmões54, e interações de metabolismo e ambiente vegetal55. Aplicações futuras podem envolver a avaliação da tolerância e resiliência localizadas da doença, ou a relação entre os níveis de metabólito local, tropismo patógeno e tropismo de doenças em modelos além da infecção por tripanosomatidas. Esta abordagem também deve ter ampla aplicabilidade para expandir os protocolos atuais de farmacocinética, para avaliar a relação entre os níveis de drogas de tecido local e o metabolismo de drogas versus contexto metabólico geral, danos teciduais e liberação de patógenos. No geral, a cartografia química permite explorações únicas de distribuições metabólitos em vários tipos de amostras, com aplicações incluindo patogênese de doenças, saúde humana, interações ambiente humano e dinâmica microbiana.

Os parasitas trypanosomatid consistem em espécies de Leishmania, tripanossomos africanos (Trypanosoma brucei) e trypanossoms americanos (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoário causa leishmaniose, que inclui auto-cura e leishmaniose cutânea localizada auto-limitada, leishmaniose mucocutânea na qual os tecidos mucosas da boca, nariz e garganta ficam danificados, e leishmaniose visceral com tropismo parasita aos órgãos viscerais causando febre e hepatosplenomegaly1,2. T. brucei causa tripanosomiase africana humana (HAT), também conhecida como doença do sono, relatada principalmente em países africanos3. Os sinais e sintomas clínicos incluem hepatosplenomegaly, febre, dor de cabeça, dores musculoesqueléticas, linfadenopatias e anemia no estágio hemo-linfático quando os parasitas se localizam na corrente sanguínea e linfáticas. Isso é seguido pelo estágio meningo-encefálico, onde os parasitas se localizam no sistema nervoso central e causam distúrbios do sono, alteração comportamental e, eventualmente, comas4 fatais. T. cruzi causa doença de Chagas, endêmica nas Américas. Indivíduos infectados experimentam um estágio agudo inicial, geralmente assintomático, com tropismo de parasitas amplos. Cerca de 10%-30% dos indivíduos infectados experimentam sintomas crônicos após décadas de infecção, caracterizados por megaófago, megacólon e complicações cardiovasculares5,6.
Metabolômica estuda pequenas espécies moleculares (50-1.500 Da), incluindo compostos biológicos do metabolismo primário ou secundário e compostos derivados externamente, como drogas ou moléculas derivadas de alimentos. No contexto das interações hospedeiro-patógeno, a metabolômica pode explorar o impacto da infecção em ambientes metabólitos hospedeiros, cruciais para acessar o efeito do patógeno no hospedeiro. Também pode avaliar adaptações patógenas ao ambiente nutricional e imunológico hospedeiro7,8,9. Espectrometria de massa (MS) e espectroscopia magnética nuclear (NMR) são ferramentas comuns de metabolômica usadas para identificar, quantificar e caracterizar metabólitos. Essa abordagem "omics" também pode ser aplicada à descoberta de biomarcadores e ao desenvolvimento de medicamentos10,11.
Dado o tropismo tecidual específico dos parasitas trypanosomatid, as análises de metabolômica espacial podem permitir uma visão significativa da patogênese das doenças que causam. O mapeamento da distribuição espacial dos metabólitos revelou metabólitos localmente afetados pela infecção crônica do Trypanosoma cruzi no tecido cardíaco do rato e infecção aguda e de longo prazo do Trypanosoma cruzi no trato gastrointestinal do camundongo6,12,13. Especificamente, a cartografia química 3D demonstrou uma desconexão entre persistência de parasitas e alterações metabólicas no tecido cardíaco de camundongos cronicamente infectados por Trypanosoma cruzi. O metabolismo foi mais perturbado em segmentos inferiores e apical do coração, combinando com locais de sintomas da doença de Chagas (aneurismas a apical cardíaco). As famílias metabólitos perturbadas pela infecção em locais cardíacos específicos e correlacionadas com a gravidade da doença incluem acircarnitinas e glicerofosforocolinas12,13,14. No trato gastrointestinal, alterações metabólicas persistentes concordaram com locais de sintomas da doença de Chagas: esôfago e cólon. Em contrapartida, o metabolismo é rees normalizado em locais não associados aos sintomas da doença de Chagas, como o intestino delgado. Metabólitos localmente perturbados pela infecção no trato gastrointestinal incluem acicicnitinas, glicerofosforos, kynurenine, triptofano e ácido cholico. Além disso, essas análises permitiram a identificação de um novo mecanismo metabólico de tolerância à doença de Chagas6. A aplicação desses métodos ao estudo da leishmaniose cutânea revelou perturbações metabólicas significativas no local da lesão, mas também alterações metabólicas específicas no tecido adjacente à lesão, macroscopicamente saudável. Por exemplo, a glutamina foi esgotada no local da lesão, enquanto as glicerofosforosforolinas no m/z (proporção massa para carga) 200-299, 400-499, 500-599 e 600-699 foram significativamente aumentadas no local da lesão. O PC (O-34:1) só foi aumentado em locais adjacentes à lesão15.
O objetivo deste manuscrito é demonstrar os passos necessários para gerar modelos 3D de distribuição metabólica ("cartografia química") aplicadas aos modelos de infecção por parasitas trypanosomatid (Figura 1). Essa abordagem baseia-se em vários avanços críticos no contexto do processamento de dados metabolômicos e metabolômicos, particularmente o desenvolvimento de software 'ili para traçar dados metabolômicos em modelos 3D facilmente16.

<table><tbody><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 mL</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>Frasco de 1 L, pirex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>Cilindro graduado de 1 L, pirex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf SafeLock de 2 mL</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>Use o modelo de tubo apropriado para o homogeneizador</td></tr> <tr><td>de tecido disponívelModelo 3D (de-novo gerado de acordo com as etapas do protocolo, ou adquirido)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>conforme apropriado para o sistema sob investigação</td></tr><tr><td>Conta de aço inoxidável de 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível; publicado em Piron, M. et al. Desenvolvimento de um ensaio de PCR em tempo real para detecção de Trypanosoma cruzi em amostras de sangue. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>balança analítica</td><td>NA NA</td><td></td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td><td>NA NA</td><td></td><td>qualquer marca, conforme disponível; publicado em Piron, M. et al. Desenvolvimento de um ensaio de PCR em tempo real para detecção de Trypanosoma cruzi em amostras de sangue. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>centrífuga de bancada com microcentrífuga, tubo falcon e capacidade de placa de 96 poços</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>cabine de biossegurança</td><td>NA</td><td>NA</td><td>classe II, tipo A2; qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível; publicado em Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantificação rápida de Trypanosoma cruzi em tecido hospedeiro por PCR em tempo real. Parasitologia molecular e bioquímica. 129 (1), 53&ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>câmera</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível. Uma câmera de celular é adequada para este protocolo</td></tr><tr><td>sistema de imagem com capacidade quimioluminescente</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer sistema, como disponíveis</td></tr><tr><td>bolas de algodão</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, como disponíveis</td></tr><tr><td>crioglove</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>substituir por qualquer marca, como disponível</td></tr><tr><td>tesoura de dissecção</td><td>NA NA</td><td></td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>gelo seco</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>pinça extra-comprimento</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>refrigerador de grau inflamável</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>caixas de armazenamento de freezer para tubos de microcentrífuga</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>capela de exaustão</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>massa de alta resolução espectrômetro</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível, como ThermoFisher Q-Exactive Plus (número de catálogo 0726030)</td></tr> <tr><td>balde de gelo</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>ili software</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>grande tupperware</td><td>NA NA</td><td></td><td>qualquer marca, conforme disponível; grande o suficiente para conter confortavelmente mouse, bola</td></tr><tr><td>de algodão LC-MS grau acetonitrila</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grau dicholorometano</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grau ácido fórmico</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grau metanol</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grau água</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>coluna de cromatografia líquida</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>pode ser alterada para outras marcas e modelos, conforme apropriado para os metabólitos de interesse cartucho de</td></tr><tr><td>proteção de coluna de cromatografia líquida</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>pode ser alterado para outras marcas e modelos, conforme apropriado para os metabólitos de interesse suporte de cartucho de</td></tr><tr><td>proteção de coluna de cromatografia líquida</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>pode ser alterado para outras marcas e modelos, conforme apropriado para os metabólitos de interesse</td></tr><tr><td>nitrogênio líquido</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Software MeshLab</td><td>https://www.meshlab.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Software Meshmixer</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS calibrante</td><td>NA</td><td>NA</td><td>apropriado para o instrumento disponível</td></tr> Software <tr><td>de processamento de dados MS</td><td>NA</td><td>NA</td><td>várias opções disponíveis; os autores recomendam o software MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>outros modelos nanodrop também são adequados</td></tr><tr><td>p1000 pontas de pipeta</td><td>NA</td><td>NA</td><td>use a marca apropriada para caber nos pipetadores disponíveis</td></tr><tr><td>p1000 pipetador</td><td>NA</td><td>NA qualquer</td><td>marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>p20 ponteiras de pipeta</td><td>NA</td><td>NA</td><td>use a marca apropriada para caber nos pipetadores</td></tr><tr><td>p20</td> disponíveis <td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>p200 ponteiras de pipeta</td><td>NA</td><td>NA</td><td>use a marca apropriada para caber nos pipetadores</td></tr><tr><td>p200 disponíveis pipetador</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>equipamento de proteção individual (luvas, jaleco, óculos/óculos de proteção; protetor facial)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>pode substituir por outros ensaios de citocinas à base de proteínas, como outros kits comerciais de citocinas Kit ELISA</td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Plus (200 preparações)</td><td>Zymo</td><td>D4069</td><td>substituir por qualquer marca de kit de extração de DNA de mamíferos, como disponível</td></tr><tr><td>termociclador em tempo real</td><td>NA</td><td>NA qualquer</td><td>marca, como disponível</td></tr><tr><td>saleiro ou infusor de chá</td><td>NA NA</td><td></td><td>qualquer marca; para conter bola de algodão embebido em isoflurano e evitar o contato com a pele do rato</td></tr><tr><td>Software SketchUp</td><td>https://www.sketchup.com/</td><td></td> NA <td></td></tr><tr><td>espécime fórceps</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>speedvac com tubo de microcentrífuga e capacidade de placa de 96 poços</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme o software de</td></tr><tr><td>planilha</td> disponível <td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td><td>pode substituir por outro software de gerenciamento de planilhas, conforme aplicável</td></tr><tr><td>sulfacloropiridazina</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>sulfadimetoxina</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr green qPCR reaction mix</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>pode substituir por outras misturas de reação Sybr green qPCR, conforme desejado</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer</td><td>NA NA</td><td></td><td>qualquer marca, conforme disponível; publicado em Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Quantificação rápida de Trypanosoma cruzi no tecido hospedeiro por PCR em tempo real. Parasitologia molecular e bioquímica. 129 (1), 53&ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>homogeneizador de tecidos</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível; por exemplo, Qiagen TissueLyser II, número de catálogo 85300, com conjunto de adaptadores TissueLyser (2 x 24), número de catálogo 69982</td></tr><tr><td>amostras de tecido</td><td>NA</td><td>NA</td><td>do modelo de infecção apropriado</td></tr><tr><td>Dispensador de esferas únicas TissueLyser</td><td>Qiagen</td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível, como ThermoFisher Vanquish (número de catálogo IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td></tr><tr><td>freezer de temperatura ultrabaixa (-80)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>banho ultrassônico</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer sistema, conforme disponível</td></tr><tr><td>gelo úmido</td><td>NA</td><td>NA</td><td>qualquer marca, conforme disponível</td></tr><tr><td>filme de vedação sem zona</td><td>VWR</td><td>&nbsp; Rolamento 490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

cartografia química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

O tropismo patógeno e o tropismo da doença referem-se aos locais de tecido seletivamente colonizados ou danificados por patógenos, levando a sintomas localizados da doença. Os parasitas trypanosomatid humanos incluem Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas; Trypanosoma brucei, o agente causador da doença do sono; e espécies leishmania, agentes causadores da leishmaniose. Em conjunto, afetam 20 milhões de pessoas em todo o mundo. Esses parasitas apresentam tropismo específico: coração, esôfago, cólon para T. cruzi, tecido adiposo, pâncreas, pele, sistema circulatório e sistema nervoso central para T. brucei, pele para cepas dermotropic Leishmania, e fígado, baço e medula óssea para cepas de Leishmania víscero. Uma perspectiva espacial é, portanto, essencial para entender a patogênese da doença trypanosomatida. A cartografia química gera visualizações 3D da abundância de pequenas moléculas geradas através da espectrometria de massa cromatografia líquida, em comparação aos parâmetros microbiológicos e imunológicos. Este protocolo demonstra como a cartografia química pode ser aplicada para estudar processos patogênicos durante a infecção por tripanosomatidas, a partir da amostragem sistemática de tecido e extração metabólica, seguida pela aquisição de dados de espectrometria de massa da cromatografia líquida-tandem, e concluindo com a geração de mapas 3D de distribuição metabólica. Este método pode ser usado para múltiplas questões de pesquisa, como requisitos de nutrientes para colonização tecidual por T. cruzi, T. brucei ou Leishmania, imunometabolismo em locais de infecção, e a relação entre perturbação metabólica do tecido local e sintomas de doenças clínicas, levando a uma visão abrangente da patogênese da doença trypanosomatid.

O número de características metabólicas obtidas depende do tipo de tecido analisado e dos parâmetros de processamento de dados. Por exemplo, este protocolo tem sido usado para analisar o impacto espacial da infecção por T. cruzi no metabolome do trato gastrointestinal em um modelo de camundongos da infecção por T. cruzi. Em trabalhos anteriores, c3H/HeJ masculino foram injetados intraperitonealmente com 1.000 CL + luc T. cruzi parasitas32,6. Os animais foram eutanizados 12 ou 89 dias após a infecção, e foi realizada uma análise de cartografia química de 13 segmentos contíguos do trato gastrointestinal, conforme descrito neste protocolo. Esta análise levou a uma tabela de recursos de 5.502 recursos, que foram então visualizados em 3D usando as etapas descritas neste protocolo. Esta abordagem permite a visualização de características metabólicas em animais individuais que são elevados no local de alta carga de parasitas (kynurenine, Figura 2B vs. carga de parasita, Figura 2A), de metabólitos com distribuição diferencial entre regiões teciduais (glutamina, Figura 2C) e características metabólicas que são encontradas em níveis comparáveis em intestinos pequenos e grandes (LPE 16:0 Figura 2D ). A kynurenine foi selecionada para visualização devido à sua relação conhecida com inflamação e publicações anteriores sobre a capacidade de metabólitos derivados de kynurenine para regular a carga T. cruzi33. Modelos aleatórios de aprendizado de máquina baseados em florestas já haviam revelado anteriormente uma associação entre os níveis de kynurenina e o status de infecção6. A glutamina foi selecionada para uma visualização com base em publicações anteriores demonstrando uma relação entre a disponibilidade in vitro de glutamina e a sensibilidade da droga T. cruzi34. A distribuição diferencial foi confirmada por meio de regressão logística, p &lt; 0,05. O LPE 16:0 foi selecionado após inspeção visual dos dados para descobrir características metabólicas encontradas em níveis comparáveis em locais de tecido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo. A ilustração foi criada com BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> Figura 2: Análise de cartografia química. Os camundongos C3H/HeJ machos foram injetados intraperitonealmente com 1.000 parasitas CL+luc T. cruzi32. Os animais foram eutanizados 12 ou 89 dias após a infecção, e o trato gastrointestinal foi coletado e seccionado sistematicamente (etapa 1)6. Os metabólitos foram extraídos como na etapa 2 e analisados pela LC-MS/MS.3D geração de modelos foi realizada utilizando o software SketchUp (etapa 5), e os dados foram plotados em 3D como na etapa 6. (A) Distribuição de parasitas em um camundongo específico, 12 dias após a infecção. (B) Distribuição de metabólito de kynurenina no mesmo rato, 12 dias após a infecção. (C) Distribuição média de glutamina entre camundongos infectados, 89 dias após a infecção. (D) Níveis comparáveis de m/z 454.292 tempo de retenção 2.929 min, anotado como 2-hexadecanoyl-sn-glicerio-3-fosfoetanolamina (LPE 16:0), no mesmo rato como em A e B no intestino delgado e cólon. Amostras e dados foram gerados em6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve os passos para gerar um modelo 3D de distribuição metabólica durante a infecção por triplosomatida, incluindo coleta de amostras, extração metabólica, uma visão geral da aquisição de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem, geração de modelo 3D e, finalmente, visualização de dados.

Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Este protocolo pode ser usado para construir modelos 3D de distribuição metabólito e parasita. Isso pode ajudar na compreensão da relação entre perturbação metabólica do tecido local, distribuição de parasitas e sintomas de doenças clínicas. A principal vantagem deste método é que ele permite o mapeamento entre órgãos em escala ao vivo da distribuição metabólito versus distribuição de patógenos e sua análise estatística.Teoricamente, a cartografia química pode explorar o desenvolvimento e o impacto da doença no hospedeiro examinando diretamente os metabólitos responsáveis pela patogênese e os efeitos do tratamento. Comece pesando e rotulando os tubos. Se se sectionia os tecidos sistematicamente com uma seção por tubo.Pese os tubos contendo amostras de tecido para determinar o peso da amostra e regissue o peso. Para realizar a homogeneização à base de água das amostras de tecido, adicione uma conta de aço inoxidável de cinco milímetros aos dois tubos de microcentrífuga mililitro contendo amostras de tecido. Faça um tubo em branco contendo água de grau LCMS.Coma o volume para 500 microlitres por 50 miligramas da amostra adicionando água de grau LCMS refrigerado e, em seguida, homogeneize amostras a 25 hertz por três minutos. As amostras devem ser completamente homogeneizadas. Coletar 1/10 do volume de homogeneização para extração de DNA e outras análises.Adicione o metanol de grau LCMS gelado cravado com quatro micromolar de sulfaclocloopyridazina ao homogeneizar. Homogeneize amostras em um homogeneizador de tecido a 25 hertz por três minutos, seguido de centrifugação por 10 minutos. Colete um volume igual de supernaspeso em uma placa de poço 96 e mantenha resíduos sólidos no gelo durante a coleta dos supernantes.Seque a extração aquosa sobrenatante completamente usando velocidade máxima e sem aquecimento. Realize a extração orgânica adicionando 1.000 microliters de metanol de diclorometano pré-refrigerado cravado com dois micromolar sulfachloropyridazine por 50 miligramas de amostra de resíduos sólidos. Homogeneize amostras a 25 hertz por cinco minutos, seguida de centrifugação por 10 minutos.Colete um volume igual de supernante em uma placa de 96 poços. Tire uma foto do órgão de interesse. Clique em Arquivo e, em seguida, importe no software SketchUp para importar uma imagem dos órgãos de interesse.Clique na ferramenta de linhas e selecione a opção à mão livre. Use a ferramenta lápis para traçar e desenhar os contornos dos órgãos de interesse. Selecione a ferramenta push/pull e puxe para cima na área sombreada para converter o desenho de 2D para 3D.Exporte o arquivo no formato dae clicando em Exportação de arquivos e, em seguida, modelo 3D. Para melhorar o realismo do modelo, importe o modelo para o software MeshLab selecionando File e, em seguida, clicando em Malha de Importação. Selecione Wireframe no menu superior e selecione Filtros, clique em Simplificação e Reconstrução de Remeshing e, em seguida, no Ponto Médio das Superfícies de Subdivisão.Deixe todos os valores como padrão e selecione Aplicar duas vezes. Exporte o modelo em formato sdl clicando em Arquivo e, em seguida, em Export Mesh As e, em seguida, selecionando O formato de arquivo SDL nos arquivos do menu suspenso do tipo. Salve isso e selecione OK no próximo menu pop-up.Abra o software Meshmixer e importe o arquivo sdl gerado na etapa anterior. Use a escultura, pincéis, escultura de dragão, pincéis, ferramentas de inflação para retirar as superfícies do modelo que precisam ser arredondadas. Salve-o no formato sdl uma vez que o modelo tenha a aparência desejada clicando em Arquivo e Exportação.Nomeie o arquivo conforme desejado, selecione o formato binário SDL e salve. Abra o modelo 3D no software MeshLab. Clique em OK na janela popup de processamento aberto do post.Obtenha coordenadas X, Y e Z para cada ponto de amostragem selecionando a ferramenta de pontos de escolha e, em seguida, clique com o botão direito do mouse em intervalos regularmente espaçados através da superfície do modelo 3D. Uma vez selecionadas todas as coordenadas desejadas, clique no botão Mais alto Salvar na janela pop-up do formulário. No software de planilha, abra o arquivo pp gerado na etapa anterior.Ajuste o visor de dados clicando em Texto de Dados para Colunas e, em seguida, Delimitado. Clique em Next e selecione Espaço e clique em Concluir. Reformat de modo que apenas valores numéricos permaneçam nas células de planilha selecionando Home Find e Select Replace.Na caixa de encontrar qual caixa, digite Y casaco igual e deixe a caixa de substituição vazia. Clique em Substituir tudo e, em seguida, em OK. Repita para x casaco igual e para z casaco igual e para corte de casaco maior do que. Na tabela de software de planilha, as linhas correspondem a cada posição e colunas aos dados.Cole a abundância de metadados e metabólitos apropriados nas colunas de planilha subsequentes. Na coluna raio, digite o tamanho desejado das manchas de amostragem a serem visualizadas no modelo. Determine os valores para o raio empiricamente e salve o arquivo no formato CSV.Navegue até o software ELI Plot, selecione o Surface e arraste e solte o modelo 3D criado na janela do navegador. Arraste e solte a tabela de recursos criada na mesma janela do navegador. Use a legenda no canto inferior direito para projetar a coluna de dados desejada no modelo 3D.Selecione consecutivamente cada coluna de dados para avaliar a distribuição deste recurso metabólito no modelo 3D. Esta análise levou a uma tabela de 5.502 características e sua visualização em 3D. Esta abordagem permite a visualização de características metabólicas em animais individuais que são altos no local de alta carga de parasitas, metabólitos com distribuição diferencial entre regiões teciduais e características metabólicas que são encontradas em níveis comparáveis em intestinos pequenos e grandes.É importante lembrar de usar apenas solventes LCMS e coletar todo o tecido adjacente e extrair os metabólitos para todas as amostras coletadas para evitar lacunas nos mapas espaciais. Esta técnica pode ser usada para explorar os requisitos de nutrientes para a colonização tecidual por parasitas trypanosomatid para entender a patogênese da doença através da comparação de mapas de distribuição metabólica 3D com a infecção.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este manuscrito descreve o uso de uma cepa bioluminescente de tripanossomas africanos para permitir o rastreamento de infecções em estágio avançado e demonstra como imagens ao vivo in vivo podem ser usadas para visualizar infecções no sistema nervoso central em tempo real.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Os tripanossomas africanos cultivados in vitro sofrem variação antigênica em uma taxa baixa, de modo que as populações são compostas de parasitas que expressam um tipo de glicoproteína de superfície variante dominante (VSG) e uma pequena população de variantes "trocadas".  Este protocolo descreve um método rápido para detectar e quantificar essas populações.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Neste protocolo, fluorescente etiquetadas T. cruzi foram injetados em larvas de peixe-zebra transparente, e motilidade do parasita foi observada na vivo usando microscopia de fluorescência folha de luz.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

O Trypanosoma cruzi agente da doença de Chagas produz duradouro infecções assintomáticas que se desenvolvem abruptamente em patologia clinicamente reconhecida. O protocolo de pesquisa a seguir descreve um curto prazo baseada na família epidemiológico estudo para desvendar a T. cruzi infecção transmitida sexualmente da mãe à progênie.

Transmissão sexual de tripanosomas americanas de machos e fêmeas para companheiros de ingênua

Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

O presente protocolo descreve microscopia fluorescente de folha de luz e métodos automatizados assistidos por software para visualizar e quantificar precisamente parasitas Trypanosoma cruzi e células T intactos e limpos. Essas técnicas fornecem uma maneira confiável de avaliar os resultados do tratamento e oferecem novas percepções sobre as interações parasita-host.

Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos

Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a realização de microscopia de expansão ultraestrutural em três estágios do ciclo de vida in vitro do Trypanosoma cruzi, o patógeno responsável pela doença de Chagas. Incluímos a técnica otimizada para proteínas do citoesqueleto e marcação de pan-proteoma.

Microscopia de Expansão Ultraestrutural em Três Estágios do Ciclo de Vida In Vitro do Trypanosoma cruzi

Parasitas sanguíneos médicos em todo o mundo foram rastreados automaticamente usando passos simples em uma plataforma de IA low-code. O diagnóstico prospectivo de filmes de sangue foi aprimorado com o uso de um método de detecção e classificação de objetos em um modelo híbrido de aprendizagem profunda. A colaboração de monitoramento ativo e modelos bem treinados ajuda a identificar focos de transmissão de tripanossomas.

Auto-Identificação Superior de Parasitas Tripanossomas Usando um Modelo Híbrido de Aprendizagem Profunda

Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Aprenda a criar modelos 3D de distribuição de metabolitos durante infecção por tripanosomatídeos usando cartografia química. Este método permite mapear metabolicamente a relação entre parasita e tecido.

Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

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