Acoustopforese microfluidica para flowthrough separação de bactérias gram-negativas usando Contas de Afinidade De Aptamer
17 de outubro de 2022
Este artigo descreve a fabricação e o funcionamento de chips acoustopforéticos microfluidos usando a técnica de austopforese microfluidica e microesferas modificadas por aptamer que podem ser usadas para o isolamento rápido e eficiente de bactérias Gram-negativas a partir de um meio.
Este protocolo descreve nossa tecnologia de austopforese microfluidica que pode ser usada para a rápida e eficiente separação de bactérias Gram-negativas de um meio usando micro contas modificadas por aptámero. Os sistemas de acoustopforese microfluídica permitem a separação das bactérias Gram-negativas com rendimento razoável e isolamento celular sem contato. A austopforese microfluida pode ser otimizada para isolar bactérias de amostras médicas e ambientais.
Para começar, projete um chip de acoustopforese microfluida que coleta contas de PS na tomada alvo e descarta o resto depois de injetar uma mistura de amostra de PS na entrada da amostra. Prepare um chip com as camadas acima e abaixo da camada de silício ligada ao vidro borossilicato. E uma terceira camada de vidro borossilicato, usando anodização, adiciona 1000 volts e 400 graus Celsius.
Conecte um PZT à camada de vidro borossilicato ao longo do canal microfluido usando menos de 10 microliters de adesivo de cianoacrilato. Inocular as bactérias GN e GP em luria-bertani médio e incuba-lo a 37 graus Celsius e 220 revoluções por minuto durante 16 horas. Centrifugar as bactérias cultivadas a 9.056 RCF por um minuto à temperatura ambiente.
Em seguida, lave duas vezes com tampão PBS 1X. Prepare as bactérias GN e GP selecionadas para análise, reutilizando-as no buffer de ligação. Resuspenda a mistura de micromedese revestida de micrometárida antes de usar.
Vórtice a mistura por 20 segundos. Prepare o aptamer desnaturando-o a 95 graus Celsius por três minutos, e depois redobrando-o a zero graus Celsius por dois minutos. Transfira 250 microliters da mistura de micro contas revestida de streptavidin resuspended para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 100 microliters de aptamer de DNA biotinilado ao tubo.
Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos enquanto gira a 25 revoluções por minuto. Centrifugar a mistura de reação a 9.056 RCF por 40 segundos em temperatura ambiente. Em seguida, lave o tubo duas vezes com 200 microliters de tampão Tris-HCl.
Adicione 10 microliters de 100 miligramas por mililitro BSA ao tubo de amostra lavado e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente enquanto gira a 25 rotações por minuto. Finalmente, lave as micro contas modificadas do aptamer duas vezes no buffer Tris-HCl por centrifugação a 9.056 RCF por 40 segundos à temperatura ambiente. Conecte os tubos PEEK às duas entradas para injetar duas amostras e tampão, e as duas tomadas para coleta e descarga de resíduos.
Usando uma seringa de 10 mililitros, encha o canal de aoustopforese microfluidic com água desmineralizada livre de bolhas. Prepare um controlador de pressão de precisão com dois ou mais canais de saída para controlar o fluxo de fluidos. Após o preparo do dispositivo, injete a amostra e o buffer aplicando uma pressão de dois quilopascals na entrada da amostra e quatro quilopascals na entrada do buffer usando o dispositivo de controle de pressão de precisão.
Usando um microscópio, concentre-se em uma conta e mova-a para o centro do canal microfluido usando o PZT. Gere uma frequência de ressonância de 3,66 mega-hertz usando um gerador de função de um único canal e amplie um sinal típico por 16 decibéis usando um amplificador de energia. Observe os processos de separação e enriquecimento no chip acoustofluidic com um microscópio de fluorescência e uma câmera de alta velocidade operando a 1.200 quadros por segundo.
O chip acoustopforético introduzido neste estudo confirmou que, à medida que a tensão do PZT aumentava, a concentração central das contas de 10 micrômetros aumentava. A cinco volts da tensão PZT, a maioria das contas de 10 micrômetros estava concentrada no centro. A razão do número de contas coletadas na tomada para o número total de contas injetadas de 10 micrômetros foi referida como a taxa de recuperação.
A razão do número de 10 contas de tamanho micrômetro para o número total de contas coletadas foi referida como pureza. Os resultados indicaram que o dispositivo tinha alta eficiência de separação para contas com um tamanho de 10 micrômetros. Os números de bactérias GN e GP ligadas a cada micro contas modificadas aptamer foram medidos usando um microscópio com uma câmera de alta velocidade.
Todas as cinco bactérias GN estavam ligadas às contas, enquanto significativamente menos bactérias GP estavam ligadas às substâncias testadas. A força do sinal difere significativamente entre as bactérias GN e GP. O adesivo utilizado para fixar o PZT deve ser usado o mínimo possível para a precisão da corrugação e o PZT e o microcanal devem ser paralelos.
Este dispositivo pode ser usado para detectar bactérias vivas ou biomarcadores derivados de bactérias no período de diagnóstico precoce de doenças infecciosas bacterianas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma tecnologia de acustoforese microfluídica para a separação rápida e eficiente de bactérias Gram-negativas a partir de diversos meios. O método utiliza microesferas modificadas com aptâmeros para aprimorar o processo de isolamento, permitindo a separação de células sem contato e com produtividade razoável.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Acustoforese
- Microbiologia
Contexto
- Os sistemas microfluídicos permitem a manipulação precisa de fluidos em escala microscópica.
- A acustoforese é uma técnica que utiliza ondas acústicas para a manipulação de partículas.
- Bactérias gram-negativas apresentam desafios significativos no isolamento devido às suas propriedades estruturais.
- As aptâmeros são oligonucleotídeos curtos e de fita simples que podem ligar-se seletivamente a alvos específicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um chip microfluídico de acustoforese para separação eficiente de bactérias.
- Otimizar o processo de isolamento para amostras médicas e ambientais.
- Demonstrar a eficácia de microesferas modificadas com aptâmeros no aumento da eficiência de separação.
Métodos Utilizados
- Projetar um chip de acustoforese microfluídico.
- Unir camadas de silício e vidro borossilicatado para a fabricação do chip.
- Injetar uma mistura de amostra de PS no chip para separação.
- Aplicar anodização com condições específicas de tensão e temperatura.
Resultados Principais
- O sistema de acustoforese microfluídica isolou com sucesso bactérias Gram-negativas.
- Obteve-se separação de alto rendimento e sem contato físico.
- Microesferas modificadas com aptâmeros melhoraram significativamente a eficiência de isolamento.
- O método é aplicável a amostras médicas e ambientais.
Conclusões
- A acustoforese microfluídica é uma técnica promissora para o isolamento bacteriano.
- Modificações em aptâmeros aumentam a seletividade e a eficiência do processo.
- Essa tecnologia poderia ser benéfica para diversas aplicações em microbiologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de acustoforese microfluídica permite o isolamento rápido e de alta pureza de bactérias Gram-negativas a partir de matrizes complexas, abordando um gargalo crítico no diagnóstico precoce de doenças infecciosas e na monitorização ambiental. Ao combinar separação acústica livre de marcadores com especificidade baseada em aptâmeros, a tecnologia apoia a redução de riscos em alvos durante descobertas de antimicrobianos e validações de biomarcadores. A recuperação demonstrada de >98% e pureza de 97,8% com concentração de 10x oferece uma alternativa escalável e sem contato à centrifugação ou filtração no preparo de amostras pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a validação funcional de alvos bacterianos Gram-negativos mediante o isolamento de patógenos viáveis a partir de amostras biológicas ou ambientais heterogêneas.
- Valor Operacional: Reduz o tempo de processamento da amostra e minimiza danos biomoleculares em comparação com técnicas tradicionais de separação.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao fornecer frações bacterianas purificadas para estudos de interação com o alvo e de mecanismo de ação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera inóculos bacterianos purificados para ensaios fenotípicos, reduzindo falsos positivos provenientes de espécies Gram-positivas contaminantes.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras por meio do foco acustoforético reprodutível e captura mediada por aptâmeros.
- Escalabilidade: O design do canal bifurcado permite o processamento, purificação e concentração simultâneos, proporcionando maior produtividade em cascatas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao permitir o isolamento consistente de bactérias Gram-negativas de matrizes semelhantes às clínicas, como sangue ou urina.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita a detecção de bactérias vivas ou biomarcadores derivados em aplicações de diagnóstico precoce, apoiando o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Avanço Ajustado ao Risco: Métricas elevadas de recuperação e pureza aumentam a confiança em ensaios subsequentes utilizados para avaliação de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na transição entre a fase de descoberta inicial e a pré-clínica, apoiando especificamente o preparo de amostras para validação de alvos, prontidão de ensaios e estudos mecanicistas nos quais a pureza de bactérias Gram-negativas é essencial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de cepas específicas de bactérias Gram-negativas de culturas mistas ou amostras ambientais para redução de riscos do alvo.
- Triagem: Permite populações bacterianas prontas para ensaios com mínima contaminação cruzada de componentes interferentes, melhorando a fidelidade da triagem.
- Análises: Fornece resultados quantitativos por meio de microscopia de fluorescência e imageamento de alta velocidade, permitindo comparações nas razões de ligação entre microesferas e bactérias e na intensidade do sinal.
- Pesquisa Translacional: Integra-se a fluxos de trabalho pré-clínicos ao possibilitar o isolamento a partir de amostras clinicamente relevantes, apoiando a continuidade no desenvolvimento de modelos de doenças infecciosas.
- Reutilização Empresarial: O design baseado em chip e a fluidica controlada por pressão permitem padronização entre laboratórios e adaptação a diversos tipos de amostras sem necessidade de reprojeto.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista decorrente de impurezas nas amostras.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio do controle preciso da força acústica e da padronização da preparação de aptâmeros com microesferas.
- Valor Estratégico: Melhora a confiabilidade das decisões de prosseguimento ou interrupção em programas antimicrobianos ao fornecer insumos biológicos de alta fidelidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados mecanicistas mais limpos obtidos de frações bacterianas purificadas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em projeto de microfluídica, otimização de parâmetros acustoforéticos e protocolos de conjugação de aptâmeros a microesferas.
- Depende de transdutores piezoelétricos, geradores de função, amplificadores de potência e microscopia de fluorescência com capacidade de imagem de alta velocidade.
- Necessita padronização das condições de tampão, taxas de fluxo (2 kPa para amostra, 4 kPa para tampão) e calibração de tensão do PZT entre diferentes usuários.
- A adaptação a diferentes espécies bacterianas ou matrizes de amostra pode exigir reotimização da seleção de aptâmeros e da frequência de ressonância acústica.
- As limitações práticas incluem corrugação do canal induzida por adesivo caso seja usado excesso de cianoacrilato, o que afeta a uniformidade do campo acústico.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
