Técnica quantitativa de fracionamento de microtúbulos para separar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos de camundongos
17 de novembro de 2023
Os microtúbulos, que são polímeros da tubulina, desempenham um papel crucial como componente do citoesqueleto em células eucarióticas e são conhecidos por sua instabilidade dinâmica. Este estudo desenvolveu um método de fracionamento de microtúbulos para separá-los em microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre para avaliar a estabilidade de microtúbulos em vários tecidos de camundongos.
Nosso novo protocolo ajuda a distinguir e quantificar três status de anéis de tubo, como microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e túbulos livres em tecidos animais. Esta técnica é composta por etapas simples e pode avaliar a estabilidade estrutural da tubulação, que não pode ser detectada pela quantificação da tubulação pós-modificação translacional. Este método é essencial para a pesquisa e desenvolvimento de formas terapêuticas para doenças onde a estabilidade dos microtúbulos é crítica, como a doença de Alzheimer e cânceres.
Inicie o procedimento preparando o desgaste de laboratório para a dissecção do tecido. Encha uma caixa com gelo picado e coloque duas placas de Petri sobre ela. Encha um prato com solução tampão fosfato gelada ou PBS para lavagem transitória e armazenamento dos tecidos dissecados.
Coloque papel filtro umedecido com PBS no segundo prato. Em seguida, pesar os microtubos de 1,5 mililitro preenchidos com PBS para armazenamento do tecido dissecado. Depois de extrair os tecidos de um camundongo eutanasiado, transfira-os para os tubos e pese novamente cada microtubo.
Mover os tecidos para um homogeneizador de vidro com tampão estabilizador de microtúbulos gelado ou meio MSB+, e homogeneizar o tecido imediatamente usando um homogeneizador refrigerado. Agora transfira o homogeneizado de tecido para um microtubo de dois mililitros usando uma pipeta de Pasteur e centrífuga a 2.400 G por três minutos a dois graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo microtubo de 1,5 mililitro para remover os detritos.
Vórtice o sobrenadante ou a fração S1 em um novo microtubo de 1,5 mililitro. Pipetar imediatamente 200 microlitros da fração S1 em um microtubo de centrifugação e centrifugar a 100.000 G usando um rotor TLA-55 por 20 minutos a dois graus Celsius. Após a segunda centrifugação, separar o sobrenadante S2 do precipitado P2.
Transfira imediatamente toda a quantidade da fração S2 para um microtubo de centrifugação e use um rotor TLA-120.2 para girá-lo a 500.000 G por 60 minutos a dois graus Celsius. Após a terceira centrifugação, separar o sobrenadante S3 do precipitado P3. Dissolva toda a fração S3 em 200 microlitros de dodecil sulfato de sódio 2X, ou tampão de amostra SDS.
Misture as frações S1 restantes com um volume igual de buffer de amostra SDS 2X para uso como uma curva padrão para western blotting. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de amostra SDS aos tubos de fração P2 e P3. Em seguida, sonice brevemente a solução para dissolver o precipitado antes de transferir as amostras para novos microtubos de 1,5 mililitro e colocá-los na caixa de gelo.
Ferva todas as amostras a 100 graus Celsius por três minutos. Os microtúbulos da fração P2 representaram 34,86% da alfa-tubulina total em cérebro de camundongo, enquanto os das frações P3 e S3 representaram 56,13% e 9,01%, respectivamente. A porcentagem de tubulina beta-3 nas frações P2, P3 e S3 não foi significativamente diferente da alfa-tubulina.
A fração S2 mostrou passagem limitada de tubulina através de uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 quilodaltons, enquanto a fração S3 permitiu a passagem completa de complexos tubulinos. A separação cromatográfica resultou em uma eluição de 100 quilodalton da tubulina S3. Proporções iguais de alfa e beta-tubulina foram recuperadas em cada fração.
As frações P2 foram significativamente enriquecidas com alfa-tubulina acetilada, enquanto a alfa-tubulina tirosinada foi dominante na fração P3. O congelamento do cérebro antes da homogeneização resultou na diminuição da concentração de alfa-tubulina nas frações P2. Entretanto, a alfa-tubulina aumentou na fração P3.
O congelamento também diminuiu os níveis de acetilação e aumentou os níveis de tirosinação de alfa-tubulina na fração P2. O tratamento com nocodazol diminuiu a alfa-tubulina na fração P2. Ao contrário do congelamento, o nocodazol não afetou as modificações pós-traducionais da tubulina P2.
O tecido cerebral exibiu uma concentração significativamente maior de tubulinas P2, enquanto as tubulinas P3 estavam concentradas no tecido proliferativo. O Western blotting mostrou que a tubulina P2 especificamente encontrada no sistema nervoso originou-se de microtúbulos estáveis, e a tubulina P3 originou-se de microtúbulos lábeis. A estabilidade dos microtúbulos é altamente dinâmica.
É importante completar este protocolo rapidamente, sem interrupções, no ambiente de temperatura fria. Certifique-se também de que os tecidos e fracções não foram congelados até serem dissolvidos em tampão de amostra SDS. Espera-se que a combinação da apresentação imune usando cada fração com proteômica identifique fatores envolvidos na dinâmica dos microtúbulos.
Usando este método, revelamos como a tau normal existe nos microtúbulos. Ele também pode ser usado para estudar como se torna anormal em cérebros envelhecidos, a fim de identificar novos alvos de drogas de demência.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo para distinguir e quantificar microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e tubulina livre em tecidos animais. O método avalia a estabilidade estrutural dos microtúbulos, o que é essencial para compreender doenças como Alzheimer e cânceres.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Dinâmica dos Microtúbulos
Contexto
- Os microtúbulos são componentes essenciais do citoesqueleto em células eucarióticas.
- Eles exibem instabilidade dinâmica, afetando funções celulares.
- Compreender a estabilidade dos microtúbulos é crucial para o desenvolvimento de terapias.
- Doenças como Alzheimer e certos tipos de câncer estão associadas à disfunção dos microtúbulos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para fracionar microtúbulos em tecidos de camundongos.
- Avaliar a estabilidade de diferentes estados de microtúbulos.
- Ampliar a compreensão das doenças relacionadas aos microtúbulos.
Métodos Utilizados
- Preparação do equipamento de proteção individual para a dissecação de tecidos.
- Uso de solução tampão de fosfato gelada para o manuseio de tecidos.
- Fractionamento de microtúbulos em tubulina estável, lábil e livre.
- Quantificação da estabilidade de microtúbulos por meio do novo protocolo.
Resultados Principais
- O protocolo distingue efetivamente microtúbulos estáveis de lábeis.
- A quantificação revela insights sobre a estabilidade dos microtúbulos em diversos tecidos.
- O método é simples e reprodutível para uso em laboratório.
- Os achados contribuem para a compreensão da dinâmica dos microtúbulos em contextos de doenças.
Conclusões
- Este novo protocolo é uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam a estabilidade de microtúbulos.
- Ele possui aplicações potenciais na compreensão e tratamento de doenças associadas à disfunção de microtúbulos.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar abordagens terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação precisa da estabilidade dos microtúbulos é essencial para analisar mecanismos terapêuticos em doenças neurodegenerativas e cânceres onde a dinâmica do citoesqueleto influencia a resposta ao fármaco. Essa técnica de fracionamento permite a quantificação direta de pools estáveis, lábeis e livres de tubulina em tecidos nativos, fornecendo uma leitura bioquímica que complementa ensaios baseados em imagem e específicos para modificações. Ao distinguir os estados funcionais dos microtúbulos, o método auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas em programas precoces de descoberta focados em agentes moduladores de microtúbulos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações nas populações de microtúbulos estáveis versus lábeis em resposta ao tratamento com compostos.
- Valor Operacional: Fornece um ensaio bioquímico baseado em tecido para validar o engajamento de alvos por agentes estabilizadores ou desestabilizadores de microtúbulos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar a estabilização bioquímica de microtúbulos com desfechos funcionais em sistemas relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera dados quantitativos de fracionamento de tubulina adequados para triagem de alta densidade de bibliotecas de compostos que visam a dinâmica dos microtúbulos.
- Reprodutibilidade: Utiliza etapas padronizadas de ultracentrifugação para obter separação consistente das frações de microtúbulos entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com blotagem ocidental e análises proteômicas complementares para identificar reguladores da estabilidade dos microtúbulos a partir de pools de tubulina fracionada.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Detecta variações tecido-específicas na estabilidade dos microtúbulos que se correlacionam com a capacidade proliferativa, permitindo a estratificação de modelos pré-clínicos.
- Continuidade Tradutiva: Relaciona estados bioquímicos dos microtúbulos a assinaturas de modificações pós-traducionais (por exemplo, acetilação em pools estáveis, tirosinação em pools lábeis) para alinhamento de biomarcadores.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de avançar/não avançar ao fornecer métricas quantitativas de estabilidade que predizem o índice terapêutico em programas direcionados aos microtúbulos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, no qual a estabilidade dos microtúbulos atua como um biomarcador farmacodinâmico para confirmação do mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de alterações induzidas por compostos nos estados de polimerização de microtúbulos em lisados de tecidos nativos.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de limiares definidos de sedimentação (100.000 × g para microtúbulos estáveis, 500.000 × g para microtúbulos lábeis), assegurando fracionamento reprodutível.
- Análises: Gera leituras quantitativas de tubulina por meio de western blot das frações P2 (estável), P3 (lábil) e S3 (tubulina livre) para comparar os efeitos dos compostos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona dados de fracionamento de microtúbulos com padrões de expressão tecido-específicos e perfis de modificações para validação pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma bioquímica reutilizável para avaliação de compostos direcionados a microtúbulos em diversas áreas de doenças e tipos de tecidos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao medir diretamente os estados de polimerização de microtúbulos, em vez de depender exclusivamente de modificações pós-traducionais.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de parâmetros padronizados de centrifugação e processamento com controle de temperatura para preservar a integridade dos microtúbulos.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança nas decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer uma validação ortogonal do mecanismo de ação sobre microtúbulos além dos ensaios celulares.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base na eficácia quantitativa de estabilização em tecidos relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas de homogeneização de tecidos e ultracentrifugação para manter a estabilidade dos microtúbulos durante o processamento.
- Depende do acesso a rotores de alta velocidade (TLA-55 e TLA-120.2) capazes de 100.000 × g e 500.000 × g para a separação de frações.
- Requer padronização entre equipes quanto ao tempo e temperatura de fracionamento para garantir resultados consistentes entre laboratórios.
- Necessita adaptação da composição do tampão e dos parâmetros de centrifugação ao aplicar o método a tecidos não neurais com diferentes densidades de microtúbulos.
- Limitado pela necessidade de processamento imediato para evitar a despolimerização artifactual dos microtúbulos durante o manuseio das amostras.
