Name: Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a detectar anticorpos neutralizantes contra AAV6 usando um ensaio colorimétrico baseado em células HT1080. Este método simples e econômico auxilia na triagem de amostras para terapia gênica.

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Este estudo foi financiado por um Projeto do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica para a JRM e CJT (ID 1163732) e, em parte, pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo Vitoriano. A SB é apoiada por uma bolsa conjunta de doutorado do Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. A KLW é apoiada pela The Shine On Foundation e uma Future Leader Fellowship da National Heart Foundation of Australia (ID 102539). A JRM é apoiada por uma Bolsa Sênior de Pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (ID 1078985).

Os autores não têm nada a revelar.

Este relatório descreve um ensaio colorimétrico que avalia a extensão da neutralização da AAV em uma determinada amostra de soro, avaliando uma reação cromogênica correspondente ao grau de transdução viral in vitro. O desenvolvimento do protocolo foi baseado na reação cromogênica conhecida entre a enzima fosfatista e nbt/BCIP, que tem sido amplamente utilizada como ferramenta de coloração para a detecção de alvos proteicos em aplicações como a imunohistoquímica e como ferramenta repórter para avaliação da transd...

Os vírus associados ao Adeno (AAV) são cada vez mais utilizados como vetores para a entrega de terapias genéticas para tratamentos experimentais para várias condições de saúde que impactam os sistemas nervosos cardiovascular, pulmonar, circulatório, ocular e central1,2,3,4,5. A popularidade dos vetores AAV como uma plataforma líder de terapia genética decorre de seu perfil positivo de segurança, expressão transgênica de longo prazo e tropismos específicos de tecido amplo1,6. Resultados bem-sucedidos em estudos em animais abriram caminho para mais de cinquenta ensaios clínicos de terapia genética AAV que atingiram com sucesso seus pontos finais de eficácia7, bem como a liberação do primeiro medicamento comercialmente disponível de terapia genética AAV aprovado pela Food and Drug Administration8 dos EUA. Após os sucessos iniciais, a AAV continuou a ganhar tração nos setores de pesquisa básica e clínica como vetor de escolha e atualmente é a única terapia genética in vivo aprovada para uso clínico nos EUA e europa9. No entanto, a presença de anticorpos neutralizantes pré-existentes (NAbs) contra capsídeos vetoriais de AAV continua a ser um empecilho tanto para a pesquisa pré-clínica quanto para a eficácia dos ensaios clínicos. Os NAbs estão presentes em populações humanas e animais ingênuas e inibem a transdução genética após a administração in vivo de um vetor AAV1. A soropositividade AAV é um critério de exclusão para a maioria dos ensaios de terapia genética e, portanto, a triagem preliminar para imunidade hospedeira é crucial tanto no laboratório quanto na clínica. Estabelecer um ensaio que possa detectar a presença de NAbs contra AAV é um passo essencial no pipeline de qualquer projeto de pesquisa baseado em terapia genética AAV. Este relatório se concentra no AAV6, que tem sido de interesse dos pesquisadores devido à sua transdução eficiente e seletiva no músculo estriado (músculo cardíaco e esquelético)1,10,11,12. A terapia genética é considerada uma estratégia promissora para atingir o coração porque é difícil atingir especificamente o coração sem procedimentos invasivos de coração aberto.
A atividade neutralizante é geralmente determinada usando um ensaio de inibição de transdução in vitro ou in vivo. In vivo Os ensaios da NAb geralmente envolvem a administração de soro de um sujeito de teste (por exemplo, humano ou animal grande) em camundongos, seguido por um AAV com um gene repórter, seguido de testes para a expressão do gene repórter ou antígeno correspondente. Ensaios in vitro determinam os títulos de NAb incubando soro ou plasma de um animal humano ou grande em diluições seriais com um AAV recombinante (rAAV) que expressa um gene repórter. As células estão infectadas com a mistura soro/vírus, e até que ponto a expressão genética do repórter é inibida é avaliada em comparação com os controles. Ensaios in vitro são amplamente utilizados para a triagem de NAb devido ao seu custo relativamente menor, rapidez nos testes e maior capacidade de padronização e validação13,14 em comparação com ensaios in vivo. Ensaios in vivo são frequentemente relatados como ter maior sensibilidade15,16, mas a mesma alegação foi feita em relação aos ensaios in vitro14,17.
Até o momento, ensaios in vitro NAb têm usado principalmente luminescência (luciferase) como o gene repórter para detectar a neutralização. Embora um método baseado em luz tenha mérito em muitos contextos, um ensaio de NAb colorimétrico/cromogênico pode ser vantajoso em algumas circunstâncias. Os ensaios colorimétricos para avaliar a neutralização têm sido empregados com sucesso para outros vírus, como influenza e adenovírus18,19. Sua atratividade decorre de sua simplicidade, menor custo e exigência apenas de aparelhos e ferramentas de laboratório cotidianos20. Ensaios nab que usam um gene repórter baseado em luminescência requerem kits de substrato caros, um luminômetro e software correspondente para análise21. Este ensaio colorimétrico tem a vantagem de exigir apenas um microscópio leve e um substrato muito barato. O relato da sensibilidade dos ensaios colorimétricos versus luminescentes tem gerado resultados conflitantes. Um estudo sugeriu ensaios ELISA baseados em luminescência que mostram maior sensibilidade e reprodutibilidade comparável aos ensaios colorimétricos22, enquanto outro encontrou ensaios ELISA baseados em colorimetria para conferir maior sensibilidade23. Aqui, um protocolo detalhado para um ensaio in vitro NAb contra a AAV que utiliza a reação cromogênica entre um AAV codificando um gene repórter de fosfatase alcalina (AP) e um tetrazolium nitro azul /5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato (NBT/BCIP) substrato é fornecido. Este protocolo passo-a-passo foi desenvolvido com base em um relatório anterior que utilizou um gene de repórter hPLAP (phosphatase alcalina da placenta humana) (AAV6-hPLAP) para detectar atividade neutralizante contra AAV24. Este ensaio é econômico, demorado, fácil de configurar e requer habilidades técnicas mínimas, equipamentos de laboratório e reagentes. Além disso, a simplicidade deste ensaio lhe dá o potencial de ser otimizado para aplicações amplas em diferentes tipos de células, tecidos ou sorotipos virais.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo de centrífuga cônico</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>75 cm2 square frascos</td><td>Falcon</td><td></td><td>353136 Ou equivalente</td></tr><tr><td>96 placa de fundo plano Falcon</td><td></td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>AAV6-CMV-hPLAP Vector</td><td></td><td></td><td>Pesquisa Muscular & Laboratório de Terapêutica (Universidade de Melbourne, Austrália) AAV6-CMV-hPLAP pode ser fornecido mediante solicitação.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-AAV6 (partícula intacta) de folha</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de alumínio</td></tr>, (ADK6)PROGEN 610159 Anticorpo monoclonal de controle positivo <tr><td>BCIP/NBT</td><td>SIGMAFAST</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete</td><td></td><td></td><td></td>de segurança para cultura de células e tecidos</tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td> eletrônica <td>5 e 10 mL inserções de</td></tr> <tr><td>stripetteHemocitômetro de soro</td><td></td><td></td> bovino fetal Gibco 10099-141 <td></td></tr><tr><td>Glicose alta Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 Software</td><td></td> ATCC <td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Disponível gratuitamente: Incubadora https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>37 &graus; C, microscópio de 5% CO2</td></tr><tr><td>Light com câmera</td><td></td><td></td><td>Capaz de tirar fotos com uma lente objetiva 4x</td></tr><tr><td>Forno</td><td></td><td></td><td>Para um microscópio de 65 &deg; C incubação</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>MERCK</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado salina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas e pontas</td><td></td><td></td><td>20 &mu; L, 200 &mu; L & Pipetas individuais de 1 mL e pontas & 200 &mu; Pipeta multicanal L</td></tr><tr><td>Filtro de liberação rápida Stericup</td><td>Millipore</td><td>S2GPU10RE</td><td>Usado para combinar reagentes de mídia</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 8 ml CAT Separador de soro Ativador de coágulo</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>455071</td><td>Usado para coleta e processamento de soro de ovelhas</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a aav usando um ensaio baseado em células coloridas

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Os vírus associados à adeno recombinante (rAAV) provaram ser um vetor seguro e bem sucedido para a transferência de material genético para tratar várias condições de saúde tanto no laboratório quanto na clínica. No entanto, anticorpos neutralizantes pré-existentes (NAbs) contra capsídeos AAV representam um desafio contínuo para a administração bem sucedida de terapias genéticas em grandes modelos experimentais animais e populações humanas. A triagem preliminar para a imunidade do hospedeiro contra a AAV é necessária para garantir a eficácia das terapias genéticas baseadas em AAV como ferramenta de pesquisa e como um agente terapêutico clinicamente viável. Este protocolo descreve um ensaio in vitro colorimétrico para detectar fatores neutralizantes contra o sorotipo AAV 6 (AAV6). O ensaio utiliza a reação entre um gene repórter de fosfatase alcalina (AP) e seu substrato NBT/BCIP, que gera uma mancha roxa quantificável insolúvel após a combinação. 
Neste protocolo, as amostras de soro são combinadas com um AAV expressando AP e incubadas para permitir que possíveis atividades de neutralização ocorram. A mistura de soro do vírus é posteriormente adicionada às células para permitir a transdução viral de quaisquer AAVs que não tenham sido neutralizados. O substrato NBT/BCIP é adicionado e sofre uma reação cromogênica, correspondendo à transdução viral e atividade neutralizante. A proporção de área colorida é quantitatada usando uma ferramenta de software livre para gerar titulações neutralizadoras. Este ensaio mostra uma forte correlação positiva entre coloração e concentração viral. A avaliação de amostras de soro de ovelhas antes e depois da administração de um AAV6 recombinante levou a um aumento dramático na atividade neutralizante (aumento de 125 a >10.000 vezes). O ensaio apresentou sensibilidade adequada para detectar atividade neutralizante em diluições de soro >1:32.000. Este ensaio fornece um método simples, rápido e econômico para detectar NAbs contra AAVs.

Ensaio de transdução para estabelecer a dose viral ideal para cobertura de placas Células HT1080, uma linha celular fibrossarcoma bem estabelecida, foram selecionadas para este ensaio. Uma concentração de 1 x 104 células HT1080/bem fornecida ~50% de confluência celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Para determinar a concentração viral ideal para o ensaio, um rAAV codificando um gene de repórter hPLAP (alcalina alcalina da placenta humana) (AAV6-hPLAP)31 foi ...

Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

Anticorpos pré-existentes que neutralizam a AAV representam uma barreira para o avanço das terapias genéticas AAV. Este ensaio é uma ferramenta de triagem para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV. A principal vantagem é que é econômico, eficiente em tempo, fácil de configurar e requer habilidades técnicas mínimas, equipamentos de laboratório e reagentes.Comece a emplacar células HT1080 no primeiro dia diluindo as células para uma concentração de 1 x 10 para a quinta célula por mililitro em mídia DMEM completa pré-aquecida. Em seguida, semente 100 microliters de células por poço em placas claras de fundo 96 bem planas para a concentração de 1 x 10 para as quatro células por poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite durante 16 a 22 horas.No segundo dia, gerar diluições seriais das amostras de interesse do soro em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro usando DMEM completo pré-aquecido. A cada tubo com amostras de soro diluído, adicione 66 microliters do 7.5x10 ao genoma seis virais por solução de trabalho do vírus microliter. Misture a diluição do soro do vírus por pipetação e, em seguida, coloque os tubos contendo as misturas de soro do vírus em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos para permitir que a neutralização potencial ocorra.Após 30 minutos, pipeta 100 microliters da mistura de soro do vírus para cada poço na placa de 96 poços contendo 1x10 para as quatro células por poço, em seguida, enrole a placa em uma folha para colocar em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite por 16 a 24 horas. No terceiro dia, aspire a mídia dos poços da placa de 96 poços usando um vácuo de capô de fumaça sem interromper as células aderidas e adicione 50 microlitadores de 4% de paraformaldeído a cada poço. Depois de embrulhar a placa em papel alumínio, deixe-a por 10 minutos em temperatura ambiente.Mais tarde, lave e aspire as células duas vezes com 200 microlitres de PBS à temperatura ambiente. Depois da segunda lavagem, pipeta 200 microliters de PBS pré-aquecidos em cada poço e enrolar a placa em papel alumínio seguido de incubação a 65 graus Celsius por 90 minutos para desnaturar atividade fosfatosa endógena, seguindo a incubação em 50 microlitadores do recém-preparado TB dissolvido/NBT em cada poço e incubar as placas embrulhadas à temperatura ambiente por duas a 24 horas. Mais tarde, tire fotos de cada poço usando uma lente objetiva 4X em uma câmera de microscópio leve, garantindo o uso consistente da mesma exposição, equilíbrio branco e configurações de luz para todos os ensaios.Para analisar a imagem no ImageJ, selecione o arquivo e clique em Abrir. Para as imagens coloridas, converta-se em escala cinza selecionando as guias Imagem, Tipo e 8 bits em ordem. Em seguida, vá para a guia Imagem e selecione Ajustar e Limiar para alterar o limiar até que todas as áreas coloridas estejam coloridas e vermelhas, mas o fundo não está.clique em Analisar e Definir Medidas e marque as caixas de seleção para Área, Fração de área, Limite ao limiar e Etiqueta Exibir antes de atingir OK.To determinar a leitura do sinal de um determinado poço, clique em Analisar e Medir para que a coluna por cento da janela pop-up exiba a leitura do sinal. O estudo estabeleceu a dosagem viral ideal adicionando o gene repórter AAV6-hPLAP nas células em uma série de concentrações do genoma viral. Uma multiplicidade de infecção de 15.000 conferiu 36% de coloração de placas e foi selecionada como a dose viral ideal.A análise representativa mostra a correlação entre coloração e multiplicidades de infecção. Obteve-se a maior concentração testada que não afetou a correlação linear entre coloração e concentração viral. O estudo de neutralização da atividade em um anticorpo monoclonal anti-AAV6 contra o vírus associado ao Adeno ou AAV6 no registro 10 diluição mostrou 50% de inibição da transdução AAV6 ou TI50 a uma concentração de 10 nanogramas por mililitro.No ensaio de anticorpos neutralizantes ou NAb, o grau de neutralização de AAV variou dentro da população amostral ingênua com valores titulantes TI50 variando de 1/2 a 1/80. Os resultados do ensaio indicaram que os valores de titre de inibição de AAV TI50 antes da administração de AAV variaram de 1/4 a 1/80. Após a administração da AAV, o titre TI50 aumentou para entre 1/2000 e superior a 1/32.000, demonstrando um claro contraste nos valores de titre entre a administração pré e pós-AAV.Ao tirar fotos dos poços, é importante usar consistentemente as mesmas configurações de microscópio ao longo do ensaio e também garantir que as fotos sejam tiradas diretamente no centro dos poços.

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Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um ensaio colorimétrico in vitro para detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra vetores do sorotipo 6 do vírus adeno-associado recombinante que expressam fosfatase alcalina (rAAV6) em amostras de soro de ovelhas. O ensaio utiliza a reação entre o AAV que codifica um gene da fosfatase alcalina placentária humana e seu substrato para gerar um produto roxo insolúvel.

Ensaio de anticorpos neutralizantes AAV baseado em células: uma técnica colorimétrica para detectar anticorpos neutralizantes contra vírus adeno-associados específicos no soro

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para...

Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

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Analisando a relação antigênica entre vírus usando um ensaio de microneutralização baseado em imagem

Este vídeo demonstra um ensaio para medir anticorpos neutralizantes contra o vírus sincicial respiratório (VSR). A pré-incubação com soro contendo anticorpos neutralizantes do VSR neutraliza as partículas virais, reduzindo a infecção celular e a formação de placas. As células infectadas por vírus são então submetidas à fixação, bloqueio e marcação de anticorpos conjugados com fluoróforo para visualização da placa. Esse processo permite a identificação da maior diluição sérica que neutraliza...

Um ensaio para medir o título de anticorpos neutralizantes específico para o vírus sincicial respiratório

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

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