Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Anticorpos pré-existentes que neutralizam a AAV representam uma barreira para o avanço das terapias genéticas AAV. Este ensaio é uma ferramenta de triagem para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV. A principal vantagem é que é econômico, eficiente em tempo, fácil de configurar e requer habilidades técnicas mínimas, equipamentos de laboratório e reagentes.

Comece a emplacar células HT1080 no primeiro dia diluindo as células para uma concentração de 1 x 10 para a quinta célula por mililitro em mídia DMEM completa pré-aquecida. Em seguida, semente 100 microliters de células por poço em placas claras de fundo 96 bem planas para a concentração de 1 x 10 para as quatro células por poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite durante 16 a 22 horas.

No segundo dia, gerar diluições seriais das amostras de interesse do soro em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro usando DMEM completo pré-aquecido. A cada tubo com amostras de soro diluído, adicione 66 microliters do 7.5x10 ao genoma seis virais por solução de trabalho do vírus microliter. Misture a diluição do soro do vírus por pipetação e, em seguida, coloque os tubos contendo as misturas de soro do vírus em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos para permitir que a neutralização potencial ocorra.

Após 30 minutos, pipeta 100 microliters da mistura de soro do vírus para cada poço na placa de 96 poços contendo 1x10 para as quatro células por poço, em seguida, enrole a placa em uma folha para colocar em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite por 16 a 24 horas. No terceiro dia, aspire a mídia dos poços da placa de 96 poços usando um vácuo de capô de fumaça sem interromper as células aderidas e adicione 50 microlitadores de 4% de paraformaldeído a cada poço. Depois de embrulhar a placa em papel alumínio, deixe-a por 10 minutos em temperatura ambiente.

Mais tarde, lave e aspire as células duas vezes com 200 microlitres de PBS à temperatura ambiente. Depois da segunda lavagem, pipeta 200 microliters de PBS pré-aquecidos em cada poço e enrolar a placa em papel alumínio seguido de incubação a 65 graus Celsius por 90 minutos para desnaturar atividade fosfatosa endógena, seguindo a incubação em 50 microlitadores do recém-preparado TB dissolvido/NBT em cada poço e incubar as placas embrulhadas à temperatura ambiente por duas a 24 horas. Mais tarde, tire fotos de cada poço usando uma lente objetiva 4X em uma câmera de microscópio leve, garantindo o uso consistente da mesma exposição, equilíbrio branco e configurações de luz para todos os ensaios.

Para analisar a imagem no ImageJ, selecione o arquivo e clique em Abrir. Para as imagens coloridas, converta-se em escala cinza selecionando as guias Imagem, Tipo e 8 bits em ordem. Em seguida, vá para a guia Imagem e selecione Ajustar e Limiar para alterar o limiar até que todas as áreas coloridas estejam coloridas e vermelhas, mas o fundo não está.

clique em Analisar e Definir Medidas e marque as caixas de seleção para Área, Fração de área, Limite ao limiar e Etiqueta Exibir antes de atingir OK.To determinar a leitura do sinal de um determinado poço, clique em Analisar e Medir para que a coluna por cento da janela pop-up exiba a leitura do sinal. O estudo estabeleceu a dosagem viral ideal adicionando o gene repórter AAV6-hPLAP nas células em uma série de concentrações do genoma viral. Uma multiplicidade de infecção de 15.000 conferiu 36% de coloração de placas e foi selecionada como a dose viral ideal.

A análise representativa mostra a correlação entre coloração e multiplicidades de infecção. Obteve-se a maior concentração testada que não afetou a correlação linear entre coloração e concentração viral. O estudo de neutralização da atividade em um anticorpo monoclonal anti-AAV6 contra o vírus associado ao Adeno ou AAV6 no registro 10 diluição mostrou 50% de inibição da transdução AAV6 ou TI50 a uma concentração de 10 nanogramas por mililitro.

No ensaio de anticorpos neutralizantes ou NAb, o grau de neutralização de AAV variou dentro da população amostral ingênua com valores titulantes TI50 variando de 1/2 a 1/80. Os resultados do ensaio indicaram que os valores de titre de inibição de AAV TI50 antes da administração de AAV variaram de 1/4 a 1/80. Após a administração da AAV, o titre TI50 aumentou para entre 1/2000 e superior a 1/32.000, demonstrando um claro contraste nos valores de titre entre a administração pré e pós-AAV.

Ao tirar fotos dos poços, é importante usar consistentemente as mesmas configurações de microscópio ao longo do ensaio e também garantir que as fotos sejam tiradas diretamente no centro dos poços.