Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

A tomografia de coerência óptica é amplamente utilizada no diagnóstico clínico de diferentes doenças da retina, mas ainda é difícil de aplicar em modelos de camundongos. Este protocolo descreve como gerenciar a técnica OCT em animais. Esta tecnologia pode ser aplicada a animais com diferentes tamanhos de globo ocular.

Ele permite imagens transversais da retina não invasivas, de alta resolução e em tempo real, juntamente com medições quantitativas da espessura da retina. A OCT auxilia no diagnóstico de retinopatia, identificando as características da lesão, como localização, alcance, forma e tamanho das lesões, bem como todas as suspeitas de anormalidades da retina, como a neovascularização da retina. Este protocolo é aplicável a estudos em animais ou doenças de fundo de olho, incluindo doenças da retina.

Antes de iniciar o procedimento, esteja preparado e siga o protocolo passo a passo. Realizar o experimento quando o animal estiver anestesiado. Deve-se ser capaz de obter imagens OCT de boa qualidade após alguma prática.

Para começar, ligue o computador e inicie o software. Clique no botão de programa de teste para concluir o programa de teste. Em seguida, ligue o termostato e pré-aqueça-o a 37 graus Celsius.

Após o teste do programa, inicie o procedimento do módulo OCT. Crie um novo assunto e preencha as informações do mouse. Em seguida, pré-aqueça o cobertor elétrico e cubra-o com toalhas cirúrgicas.

Coloque o rato anestesiado na plataforma da manta eléctrica e cubra imediatamente ambos os olhos com gel de hialuronato de sódio médico. Em seguida, coloque uma lente de contato 100D na córnea do rato com o lado côncavo tocando o gel de hialuronato de sódio na superfície da córnea. Em seguida, coloque o mouse na pequena plataforma animal de temperatura constante do dispositivo cSLO.

Ajuste o ângulo da lente de contato com pinças para manter a pupila no centro da lente. Ajuste os ajustes na cabeça para fazer com que o olho fique voltado para a frente. Clique no botão OCT, escolha o módulo do mouse e inicie o programa cSLO.

Em seguida, use a alavanca de operação para mover lentamente a lente predefinida em direção à lente de contato. Faça ajustes adicionais para alinhar a imagem do polo anteroposterior, centralizando-a na cabeça do nervo óptico. Em seguida, inicie o programa OCT e clique na barra de progresso para cima e para baixo até que a imagem da OCT apareça.

Ajuste o intervalo mínimo entre 0 a 20 e o intervalo máximo entre 40 a 60. Em seguida, ajuste a distância da lente predefinida e a direção da posição até que uma imagem OCT ideal seja obtida. Selecione a posição de varredura movendo a linha padrão no cSLO.

Em seguida, clique em média para sobrepor o sinal de imagem cSLO e OCT e clique no botão de captura para adquirir a imagem da OCT SLO. Após o experimento, remova a lente de contato 100D e aplique o gel ocular de levofloxacina para proteger a córnea. Para correção da estratificação da retina, clique em carregar o exame na interface OCT e chame as imagens da OCT de uma janela pop-up.

Em seguida, clique duas vezes na imagem no contêiner de mídia para exibi-la na tela. Em seguida, clique em detecção de camada para concluir a colocação automática de camadas na retina. Depois de selecionar a linha divisória em ambos os lados da camada preparada para análise, clique em editar camada para ajustar o espaçamento e limitar o intervalo.

Em seguida, modifique a linha movendo o círculo vermelho. Para medir a espessura da laminação da retina, clique no botão de marcador de medida e selecione a linha divisória da camada a ser analisada para exibir o limite da camada na imagem OCT. Em seguida, selecione conectar com a camada e permanecer conectado em movimento.

Em seguida, selecione a área para exibir os resultados e clique na posição a ser analisada na imagem da OCT para que a linha de medição apareça. Clique na próxima coluna para medições subsequentes e para revelar os dados anteriores. Para medir a espessura total da retina, selecione a linha um e a linha sete na lista no canto superior direito.

Em seguida, a partir do aparecimento da estrutura da retina na borda da papila óptica, meça quatro valores em intervalos de espaçamento de 200 micrômetros na régua horizontal. Imagens OCT de camundongos C57BL/6 mostraram várias camadas da retina com demarcação clara. Em contraste, os camundongos knockout Vldlr apresentaram lesões hiper-reflexivas anormais.

As imagens da OCT mostraram algumas bandas reflexivas médias nas superfícies da retina dos camundongos knockout Vldlr. Essas bandas aderiram ao vaso da retina, sendo consistentes com as características da OCT de descolamento vítreo incompleto. Uma lesão hiperrreflexiva apareceu no espaço sub-retiniano e se espalhou para a camada nuclear externa, mas não rompeu a camada plexiforme externa.

A aparência da OCT desta lesão foi consistente com os achados patológicos. O corte patológico mostrou que a neovascularização rompeu a camada do epitélio pigmentar da retina, os segmentos internos-externos fotorreceptores e a membrana limitante externa, invadindo a camada nuclear externa, mas não a camada plexiforme externa. Outra faixa de lesão hiperrreflexiva, localizada no espaço sub-retiniano, não envolveu a camada nuclear externa.

Consistente com os achados patológicos, essa neovascularização sub-retiniana não rompeu a membrana limitante externa. A comparação da espessura da retina do olho direito nas direções temporal, nasal, superior e inferior do polar posterior entre os dois grupos revelou que a espessura da retina dos camundongos knockout Vldlr foi significativamente menor do que a dos camundongos C57BL/6J. Ao executar o protocolo, coloque corretamente uma lente de contato 100D na córnea e, em seguida, ajuste a posição da imagem.

Selecione o local de digitalização e sobreponha a imagem antes de fotografar. Após esse procedimento, a OCT do segmento anterior é viável, exigindo a alteração da distância entre o cristalino predefinido e a córnea. Pode mostrar a córnea, a câmara anterior, a íris, o corpo ciliar e o cristalino.

Esta técnica fornece uma importante ferramenta para a pesquisa de retinopatia em modelos animais de pequeno porte, promovendo a detecção não invasiva e a medição da retinopatia na pesquisa básica.