Name: Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a metodologia de mapeamento FRET para identificar sítios de ligação e mudanças conformacionais em proteínas. Esta técnica em solução permite estudar dinâmicas moleculares com precisão.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde doem R15GM135904 (concedido ao IM) e Institutos Nacionais de Saúde GM110552 (concedido à DBO).

Os autores não têm nada a revelar.

Através do uso da metodologia de mapeamento FRET, identificamos o local de ligação da sequência de sinal na proteína SecA. É importante ressaltar que a presença de uma estrutura de cristal 3D do complexo facilitou muito nosso estudo. A força dessa metodologia de mapeamento está na capacidade de usar uma estrutura existente para identificar locais para rotulagem. Esta metodologia não pode ser usada para determinar uma estrutura 3D; no entanto, a determinação dos elementos estruturais56, o refinamen...

Para as proteínas, a elucidação da dinâmica juntamente com o conhecimento estrutural tridimensional (3-D) leva a uma compreensão aprimorada das relações estrutura-função dos sistemas biomoleculares. Métodos estruturais, como cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica criogênica, capturam uma estrutura estática e muitas vezes requerem a determinação de múltiplas estruturas para elucidar aspectos da ligação biomolécula e da dinâmica1. Este artigo discute um método baseado em soluções para mapear elementos estruturais globais, como locais de vinculação ou interações vinculativas, que são potencialmente mais transitórios e menos facilmente capturados por métodos estáticos. Sistemas fortes candidatos a essa metodologia são aqueles em que uma estrutura 3D foi previamente determinada por cristalografia de raios-X, espectroscopia de NMR ou outros métodos estruturais. Neste caso, aproveitamos a estrutura de cristal de raios-X do complexo SecA-SecYEG, um player central na via secretary geral da proteína, para mapear a localização de um local de ligação de peptídeo de sinal usando a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) antes do transporte da pré-proteína através da membrana2. A manipulação do sistema biológico através de modificações genéticas aliadas ao nosso conhecimento da estrutura 3D possibilitou a determinação da conformação da sequência de sinal e da região madura precoce imediatamente antes da inserção no canal 3.
O FRET envolve a transferência de energia sem radiação de uma molécula (doador) para outra (aceitadora) de forma dependente da distância que é através do espaço 4,5. A eficiência dessa transferência é monitorada através de uma diminuição do doador ou um aumento na intensidade de fluorescência aceitadora. A eficiência da transferência de energia pode ser descrita como
E = R06/(R06 + R6)
em que o valor R0 é a distância em que a transferência é 50% eficiente6. A técnica já foi descrita como uma régua molecular e é eficaz na determinação de distâncias na faixa de 2,5-12 nm, dependendo da identidade dos corantes aceitadores de doadores 4,7,8,9. As intensidades de fluorescência do doador e as vidas com ou sem aceitação permitem a determinação da eficiência de transferência e, consequentemente, distâncias 5,8. Devido à disponibilidade da tecnologia, sensibilidade do método e facilidade de uso, a FRET também encontrou ampla aplicação em áreas como espectroscopia de fluorescência de molécula única e microscopia confocal6. O advento de proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde tornou a observação da dinâmica intracelular e da imagem de células vivas relativamente fácil10,11. Muitas aplicações FRET como essas são discutidas detalhadamente nesta questão virtual.
Neste estudo, focamos particularmente no uso de medidas de FRET para produzir valores de distância para determinar detalhes estruturais. Anteriormente, as medidas de FRET têm sido efetivamente utilizadas para determinar a conformação de moléculas de DNA quando ligadas à proteína 12,13,14, a dinâmica interna das proteínas e interações de ligação proteica 15,16,17. As vantagens deste método residem na capacidade de determinar elementos estruturais flexíveis e dinâmicos em uma solução com quantidades relativamente baixas de material. Significativamente, este método é particularmente eficaz quando utilizado em conjunto com as informações estruturais existentes e não pode ser usado como um meio de determinação da estrutura 3D. O método fornece a melhor visão e refinamento da estrutura se o trabalho se baseia em informações estruturais existentes, muitas vezes acoplado à simulação computacional18,19. Aqui, descreve-se o uso de distâncias obtidas a partir de medições fret de estado estável e tempo resolvidos para mapear um local de ligação, local do qual não se sabia, em uma estrutura cristalográfica existente do complexo SecA-SecYEG, grandes proteínas na via secreta3 geral.
O caminho secreto geral, um sistema altamente conservado de procariotes a eucariotes até arqueias, media o transporte de proteínas através ou para dentro da membrana para sua localização funcional na célula. Para bactérias gram-negativas, como e. coli, o organismo usado em nosso estudo, proteínas são inseridas ou translocadas através da membrana interna para o periplasma. O complexo de canal secy bacteriano (chamado translocon) coordena com outras proteínas para translocar a proteína recém-sintetizada, que é direcionada para sua localização correta na célula através de uma sequência de sinal tipicamente localizada no N-terminus20,21. Para proteínas destinadas ao periplasma, a proteína ATPase SecA associa-se ao túnel de saída do ribossomo, e com a pré-proteína após aproximadamente 100 resíduos terem sido traduzidos22. Juntamente com a proteína acompanhante da SecB, mantém a pré-proteína em um estado desdobrado. A SecA se liga ao translocon SecYEG, e através de muitos ciclos de hidrólise ATP, facilita o transporte de proteínas através da membrana23,24.
SecA é uma proteína multi-domínio que existe em formas citosolísticas e ligadas à membrana. Uma proteína homodimemérica no citosol, a SecA consiste em um domínio de ligação pré-proteína ou cross-linking25, dois domínios de ligação de nucleotídeos, um domínio de asa helicoidal, um domínio helicoidal de andaimes e o dedo de duas hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). Em estudos cristalográficos anteriores do complexo SecA-SecYEG, a localização do THF sugeriu que ele estava ativamente envolvido na translocação de proteínas e subsequentes experimentos de ligação cruzada com o peptídeo de sinal estabeleceu ainda mais a importância desta região na translocação de proteínas30,31. Estudos anteriores, utilizando a metodologia de mapeamento DA FRET, demonstraram que peptídeos de sinal exógenos se ligam a esta região da SecA 2,32. Para compreender completamente a conformação e localização da sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína antes da inserção no canal SecYEG, foi criada uma quimera proteica na qual a sequência de sinal e resíduos da região madura precoce foram anexados à SecA através de um linker Ser-Gly (Figura 1). Usando essa construção biologicamente viável, foi demonstrado ainda que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína se ligam ao THF de forma paralela2. Posteriormente, utilizou-se a metodologia de mapeamento DO FRET para elucidar a conformação e a localização da sequência de sinal e da região madura precoce na presença de SecYEG conforme descrito abaixo de3.
O conhecimento da estrutura 3D do complexo SecA-SecYEG 33,34,35 e a possível localização do local de ligação nos permitiu colocar criteriosamente rótulos de doadores-aceitadores em locais onde a intersecção de distâncias individuais de FRET identifica a localização do local de vinculação. Estas medidas de mapeamento fret revelaram que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína formam um grampo de cabelo com a ponta localizada na boca do canal SecYEG, demonstrando que a estrutura do grampo de cabelo é modelada antes da inserção do canal.

<table><tbody><tr><td>Laser LED de 490 nm</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimida//DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy; 4 Filtro centrífugo (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilmaltosídeo (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>E. coli peptídeo sinal de fosfatase alcalina SP22</td><td>Biomoléculas Midwest</td><td>N/A</td><td>Peptídeo de sinal estendido de item personalizado sintetizado</td></tr><tr><td>SP41</td><td>Biomoléculas Midwest</td><td>N/A</td><td>Item personalizado sintetizado</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Programa de</td> aquisição espectral <td>Horiba versão 2.4</td><td>para espectrofluorômetro Fluoromax4</td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro Fluoromax 4</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td><td></td><td>programa de análise espectral para decaimentos resolvidos no tempo</td></tr><tr><td>H&shy; 4&tímido; Azido&tímido; Phe&shy; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 sílica coloidal (40% em peso de suspensão em H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>diluição é necessária para fazer uma solução de espalhamento adequada</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>versão 4.1.0.4096</td><td>programa de aquisição espectral para PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master Instrumento</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Molecular Graphics Program</td><td>Schrödinger</td><td>versão 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um método baseado em fluorescência estabelecido usado para medir com sucesso distâncias dentro e entre biomoléculas in vitro , bem como dentro das células. No FRET, a eficiência da transferência de energia, medida por mudanças na intensidade ou na vida útil da fluorescência, relaciona-se à distância entre duas moléculas fluorescentes ou rótulos. A determinação da dinâmica e as mudanças conformais a partir das distâncias são apenas alguns exemplos de aplicações desse método aos sistemas biológicos. Sob certas condições, essa metodologia pode adicionar e aprimorar estruturas de cristal de raios-X existentes, fornecendo informações sobre dinâmica, flexibilidade e adaptação a superfícies de ligação. Descrevemos o uso de FRET e determinações de distância associadas para elucidar propriedades estruturais, através da identificação de um local de ligação ou das orientações de subunidades mais fracas. Através da escolha criteriosa de sites de rotulagem, e muitas vezes emprego de múltiplas estratégias de rotulagem, aplicamos com sucesso esses métodos de mapeamento para determinar propriedades estruturais globais em um complexo de DNA proteico e no sistema de translocação de proteínas SecA-SecYEG. No sistema SecA-SecYEG, usamos métodos de mapeamento FRET para identificar o local de ligação pré-proteína e determinar a conformação local da região de sequência de sinal vinculado. Este estudo descreve as etapas para a realização de estudos de mapeamento de FRET, incluindo identificação de locais de rotulagem adequados, discussão de possíveis rótulos, incluindo resíduos de aminoácidos não nativos, procedimentos de rotulagem, como realizar medições e interpretação dos dados.

Este estudo concentrou-se em determinar a localização do local de ligação pré-proteína na SecA antes da inserção da pré-proteína no canal SecYEG. Para mapear o local de ligação, foram realizados experimentos de FRET entre diferentes regiões da pré-proteína e três locais distintos nas proteínas SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Das distâncias obtidas e estruturas tridimensionais da SecA, SecYEG e pré-proteína, a localização do local de ligação pré-proteína foi pre...

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Desenvolvemos uma metodologia de mapeamento FRET que permite a identificação e caracterização de sítios de ligação de ligantes, orientação subunita, alterações conformais associadas à ligação de ligantes e movimentos dinâmicos de proteínas. Uma vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada em solução e as moléculas podem se mover livremente. As distâncias medidas por essa técnica são apropriadas para sistemas biológicos.O FRET é amplamente aplicável a muitos sistemas. O mapeamento melhora o monitoramento de mudanças estruturais e dinâmicas em qualquer sistema biomolecular, e é particularmente eficaz se houver informações estruturais tridimensionais. Depois de purificar a proteína, a parte mais difícil é rotular com alta eficiência e remover o corante livre.Para os experimentos, ajuda ter o mínimo de corante livre possível. Para começar, escolha locais de rotulagem dentro de 25 a 75 angstrom do local de ligação punitiva, e em regiões relativamente estáticas da proteína. A distância determinará o par de corante FRET específico a ser usado.Localize os locais de rotulagem em regiões proteicas relativamente distintas umas das outras. Assim, os locais descrevem os vértices de um triângulo, com o local de ligação punitiva localizado no centro. Para medir os valores de R0, dependendo do tamanho e volume desejados da cuvette, prepare duas amostras de proteína na mesma concentração de proteína total.Uma com a proteína rotulada apenas com o corante doador, e outra com a proteína rotulada apenas com o corante aceitador. Ligue o fluorômetro e abra o programa de aquisição e análise espectral no software FluorEssence, se estiver usando um espectrômetro. Clique no M vermelho para conectar o computador ao instrumento e escolha espectros de emissão.Digite parâmetros de varredura usando o item do menu de teste de coleta, como comprimento de onda de excitação, a faixa para varredura de emissões, temperatura e amostra mudam sua posição. Clique no RTC e nas configurações otimizadas do instrumento, conforme descrito no manuscrito, monitorando a emissão de fluorescência no pico usando um comprimento de onda de excitação definido no máximo de absorção do corante. Coloque a amostra de proteína rotulada pelo doador no suporte da amostra, e clique para gerar uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com o corante doador, excitando a amostra no máximo de absorção de corantes, e escaneando sobre o pico de emissão.Estabeleça uma linha de base para a varredura estendendo a varredura em 25 a 50 nanômetros após o final do pico. Meça o rendimento quântico da proteína do doador apenas realizando absorções e medições de fluorescência em amostras de diferentes concentrações, conforme descrito no manuscrito do texto. Prepare apenas proteínas, proteínas aceitadoras e amostras de proteínas aceitadoras de doadores, na mesma concentração.Obtenha o doador apenas para gerar espectros de emissão de fluorescência. Excite a solução no máximo de absorção de corantes doadores e escaneie os picos de emissão do doador e do aceitador. Ou troca a amostra apenas pela proteína aceitadora, ou altera a amostra muda sua posição para a cuvette que contém apenas proteína aceitadora.Obtenha uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com o corante aceitador. Excite a amostra no comprimento de onda de excitação do doador. Troque a amostra para a amostra de proteína aceitadora do doador ou altere a amostra mude sua posição para a cuvette contendo a proteína rotulada do doador.Obtenha uma varredura de emissão da amostra de proteína aceitadora de doadores usando as mesmas configurações. Para todos os espectros, corrija a fluorescência de fundo subtraindo as contagens de fundo medidas no final da varredura. Use um programa de visualização gráfica 3D, como o PyMOL, para mapear as distâncias na estrutura, inserindo diretamente os comandos do script na janela de comando com as informações de distância apropriadas.Gere uma concha para cada distância medida e o erro associado. Mapeie a posição através da intersecção das diferentes conchas. O local de ligação do peptídeo de sinal foi mapeado usando três locais diferentes na SecA e SecYEG, e quatro locais diferentes no peptídeo de sinal.Experimentos de FRET entre diferentes regiões da pré-proteína e três locais distintos nas proteínas SecA e SecYEG mapeiam o local de ligação pré-proteína e orientação. O local de ligação punitiva do peptídeo de sinal foi previamente identificado como o dedo de duas hélices, e a cauda terminal C da SecA sugeriu uma orientação paralela ao dedo de duas hélices. Foram obtidos espectros de FRET de estado constante entre SecA37 e PhoA2 e PhoA22.A redução da intensidade do doador indicou maior transferência de energia a partir de PhoA22. Em relação ao site PhoA2, que está localizado mais longe da SecA37. Os espectros de decadência de fluorescência resolvidas demonstraram que o complexo aceitador de doadores tem uma decadência homogênea mais curta consistente com a transferência de energia associada a uma distância.As conchas de distância FRET construídas entre o resíduo SecA PhoA2, e os locais triangulados, demonstraram que cada concha se cruza com o dedo de duas hélices, o local de ligação presumido, que é mostrado em verde. A área intersetorial é menor do que cada concha FRET e inclui uma grande contribuição do andaime helicoidal. Conchas de distância FRET determinadas entre o resíduo PhoA2 e os locais rotulados, descrevem uma área menor localizada mais próxima da ponta do dedo de duas hélices e da boca do canal SecYEG.Esta área interseccionada está situada na extremidade oposta do dedo de duas hélices de PhoA2. Coisas importantes a considerar incluem a seleção adequada dos sites de rotulagem para triangular a área de interesse, medir os rendimentos quânticos para cada site e remover todo o corante livre. Este método se alinha com informações estruturais obtidas com métodos como NMR ou cristalografia de raios-X.Quando os resultados do FRET são colocados em um contexto estrutural, ele pode melhorar as informações existentes.

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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