Name: Culturing e Triagem da Planta Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a cultivar e triar o nematoide parasita de plantas Ditylenchus dipsaci usando técnicas de cultivo e triagens químicas de média vazão. Este método permite identificar novos nematicidas para proteção de culturas.

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Os autores reconhecem o Dr. Qing Yu (Agricultura e Agro-Alimentos do Canadá) por fornecer a cultura ditylenchus dipsaci e por conselhos sobre métodos culturais; Dr. Benjamin Mimee (Agricultura e Agro-Alimentos do Canadá) e Nathalie Dauphinais (Agricultura e Agro-Alimentos Canadá) para aconselhamento sobre cultura in vitro de nematoides vegetais-parasitas; Dr. Andrew Burns e Sean Harrington para sugestões úteis sobre o projeto e o manuscrito. JK é um NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholar. A PJR é apoiada por uma concessão de projeto cihr (313296). PJR é uma Cadeira de Pesquisa do Canadá (Nível 1) em Genética Química.

A cepa D. dipsaci G-137 usada para o presente trabalho foi coletada do Fish Lake 4 Variety alho no Condado de Prince Edward e foi fornecida pela Agricultura e Agro-alimentos do Canadá. Se iniciar uma nova cultura, consulte Poirier et al. para a metodologia de inoculação15.
1. Cultivo de D. dipsaci
<ol><li>Prepare a mídia e as placas seguindo o trabalho relatado anteriormente15.<ol>
<li>Prepare 500 mL de mídia de ágar nutriente (NA) com 23 g/L de NA (ver Tabela de Materiais) e água ultrauso. Utilizando técnica estéril, despeje 25 mL de mídia NA autoclaved em 20 placas descartáveis de Petri (100 mm de diâmetro x 15 mm de profundidade). Deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente (22 °C) com a tampa ligada por ~2 h e reserve para uso posterior.</li>
		<li>Prepare 500 mL de mídia Gamborg B-5 (GA) contendo 3,2 g/L de meio basal GA com orgânicos mínimos, 20 g/L de sacarose, 15 g/L de ágar e água destilada (ver Tabela de Materiais). Utilizando técnica estéril, despeje 50 mL de mídia GA autoclaved em 10 placas descartáveis de Petri (100 mm de diâmetro x 25 mm de profundidade). Deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente (22 °C) com a tampa ligada por ~5 h e armazenar em pé a temperatura ambiente em um saco estéril até a transferência do broto. NOTA: O excesso de placas de mídia é feito no caso de contaminação ocorrer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar esterilização de sementes seguindo um método modificado de um trabalho anterior15.<ol>
<li>Autoclave um béquer 2 L com uma barra de rebuliço, 2 fórceps, uma placa de petri de vidro, e 1 L de água destilada. Prepare 200 mL de solução etoh de 95% e 200 mL de uma solução de alvejante comercial de 15%.</li>
		<li>Use sementes de ervilha (ver Tabela de Materiais). Despeje 150 sementes em um béquer 2 L estéril com uma barra de agitação perto de uma chama de bico de Bunsen em um banco de laboratório.</li>
		<li>Adicione 200 mL de 95% de EtOH às sementes dentro do béquer, mexa vigorosamente na placa de agitação por 5 minutos e, em seguida, despeje o EtOH em um recipiente de resíduos.</li>
		<li>Despeje a solução de alvejante no béquer para imergir completamente as sementes. Mexa vigorosamente em uma placa de mexida por 20 minutos e despeje alvejante em um recipiente de resíduos.</li>
		<li>Despeje água destilada no béquer para mergulhar as sementes e mexa vigorosamente em um prato de mexida por 20 minutos. Repita as lavagens de água três vezes, derramando água destilada após cada lavagem. Após a lavagem final da água, despeje sementes esterilizadas na placa de vidro Petri.</li>
		<li>Para verificar se há contaminação, transfira 6 sementes para cada placa NA de 10 cm (preparada na etapa 1.1.1) no capô de inundação laminar usando fórceps esterilizados. Disponha as sementes ao redor da circunferência da placa (as sementes de plumper funcionam melhor). Enrole as placas individualmente em filme de embalagem de laboratório e incubar no escuro por 3 dias a 26 °C. NOTA: O revestimento de mais sementes do que o necessário permitirá o uso seletivo de sementes não contaminadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a transferência de broto seguindo o passo abaixo.<ol>
<li>Em uma coifa de fluxo laminar, use fórceps esterilizados para emplacar 2 sementes não contaminadas em cada placa de GA (preparada na etapa 1.1.2). Enrole as placas individualmente em filme de embalagem de laboratório e incubar à temperatura ambiente por 7-10 dias para permitir que as sementes brotem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a criação in vitro seguindo um método modificado de um trabalho anterior15.<ol>
<li>Prepare 50 mL de solução de sacarose de 20 g/L. Filtrar esterilizar a solução de sacarose e reserve.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo laminar, corte um pedaço de ágar contendo tecido radicular (~2 cm3) de uma placa de cultura existente. Pipeta 500 μL de solução de sacarose na nova placa GA com mudas de ervilha e coloque cubo de ágar em cima de sacarose. Enrole as placas individualmente em filme de embalagem de laboratório e mantenha a cultura em uma caixa forrada com papel alumínio à temperatura ambiente (~22 °C).</li>
		<li>Nematoides de subcultura em placas de GA frescas a cada 8-9 semanas para manter a cultura. Nematoides estão prontos para serem extraídos após ~8 semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extração e coleta de D. dipsaci
<ol><li>Realize a extração de D. dipsaci seguindo as etapas abaixo.<ol>
<li>Autoclave um béquer de 50 mL, um funil de 80 mm, 150 mL de água destilada e filtros de café. Coloque o funil no béquer e forque o funil com filtro de café estéril.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo laminar, corte o ágar e o tecido radicular em 1 cm3 usando um bisturi estéril. Transfira os cubos de ágar para o funil revestido de filtro de café e despeje lentamente água destilada no ágar para umedecer o filtro de café.</li>
		<li>Remova o funil forrado de filtro de café do béquer e encha o béquer com água destilada até que o nível da água esteja apenas tocando o fundo do filtro assim que o funil forrado pelo filtro de café for substituído.</li>
		<li>Cubra o funil forrado de filtro de café e o béquer com papel alumínio. Deixe durante a noite (16 h) no banco para permitir que os vermes se movam através do filtro de café para o béquer de coleta. NOTA: Uma placa de cultura nematode está pronta para extração quando os vermes rastejaram para dentro do ágar quando examinados com um microscópio de dissecção. Normalmente, uma placa está pronta para extração 6-8 semanas após sua inoculação inicial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize a coleção de D. dipsaci. NOTA: No dia seguinte, os vermes D. dipsaci terão se estabelecido no fundo do béquer.<ol>
<li>Remova o funil forrado do filtro de café e aspire os 40 mL de água superiores do béquer de coleta; garantir não interromper os vermes resolvidos. Usando uma pipeta sorológica de plástico de 10 mL, colete o líquido restante em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. NOTA: Esta coleção pode ser usada diretamente em ensaios. Coloque a 4 °C se não forem utilizados dentro de 24 horas. Os vermes podem ser deixados por 3 dias a 4 °C sem impacto visível na mobilidade. Remover o funil pode perturbar os vermes no béquer de coleta. Deixe-os se acomodarem até o fundo antes de coletar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tela de molécula pequena in vitro
<ol><li>Prepare as placas de ensaio seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Despeje água destilada autoclavada em um cocho estéril e, usando uma pipeta multicanal, dispense 40 μL de água destilada do cocho em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a ferramenta de fixação e adicione os produtos químicos<ol>
<li>Configure bandejas de pinner (ver Tabela de Materiais) perto de uma chama de queimador Bunsen em um banco de laboratório. Adicione o seguinte às sucessivas bandejas de pinner: 25 mL de solução de limpeza de pinos, 35 mL de 50% DMSO (em água), 45 mL de água destilada, 55 mL de 70% EtOH e 65 mL de 95% EtOH. Coloque um pedaço de papel manchado na frente de cada bandeja</li>
		<li>Limpe a ferramenta de fixação, emersing os pinos na solução de limpeza e movendo os pinos para cima e para baixo três vezes (3x) na solução. Neste protocolo, '3x' e '10x' são definidos como mover o pinner para cima e para baixo em uma solução três ou dez vezes, respectivamente. Borriete os pinos no papel de mancha. Repita este procedimento mais uma vez.<ol>
<li>Em seguida, enxágue os pinos 3x em água destilada, seguido de manchas nos pinos. Repita o procedimento mais uma vez.</li>
			<li>Por fim, enxágue os pinos 3x em 95% EtOH, seguido de manchas nos pinos. Repita mais uma vez. Pegue o pinner e deixe o etanol evaporar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione produtos químicos das placas químicas de 96 poços para assar placas, fixando 3x na placa química e, em seguida, transferindo os pinos 10X para a placa de ensaio. Borrida no papel em frente à solução de limpeza.</li>
		<li>Ferramenta de fixação limpa entre as placas lavando na seguinte ordem, manchando no meio no papel de mancha: 3x em 50% DMSO (uma vez), 3x em água destilada (uma vez), 3x em 75% EtOH (uma vez), 3x em 95% EtOH (duas vezes). Inflama o pinner e permite que o etanol evapore.</li>
		<li>Repita o passo 3.2.2 quando toda a fixação estiver concluída. NOTA: A triagem foi realizada em uma concentração final de 60 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adição de vermes<ol>
<li>Conte o número de nematoides da coleção primeiro resususundo e, em seguida, pipetting 5 μL usando dicas de baixa retenção em um slide para observação. Conte o número de nematoides em 5 μL usando um microscópio de dissecção.<ol>
<li>Ajuste a concentração para 2 vermes/μL usando água destilada estéril. Usando uma pipeta multicanal e um cocho, adicione 10 μL (~20 worms) a cada poço das placas de 96 poços. NOTA: Aproximadamente 15.000 nematoides d. dipsaci serão coletados por placa de cultura usando o método de cultura e coleta descrito. Vinte worms são usados por poço porque o pequeno número facilita a visualização clara e a contabilidade dos móveis e imóveis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sele as placas em filme de embalagem de laboratório e enrole com uma toalha de papel úmida. Coloque na caixa e afixe em uma almofada pegajosa em 20 °C de incubadora de agitação a 200 rpm. Certifique-se de que as placas estejam estabilizadas na caixa adicionando uma toalha de papel umedecido extra para garantir o mínimo de movimento das placas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Coleta e análise de dados
<ol><li>Observe as placas no dia 5 sob um microscópio dissecando. Conte o número de móveis e número total de D. dipsaci em controles de solventes DMSO e poços tratados com drogas.<ol>
<li>Se os vermes estiverem relativamente imóveis, adicione 2 μL de 1 M NaOH a uma concentração final de 40 mM ao poço para estimular o movimento19,20. NOTA: Depois de adicionar NaOH, os worms se moverão instantaneamente e precisarão ser vistos dentro de 5 minutos. O número de worms móveis e o número total de worms serão usados para calcular a proporção de worms móveis. O comprimento do ensaio pode mudar dependendo da pontaria da tela.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a proporção de vermes móveis. Nas telas D. dipsaci , poços que reproduzivelmente renderam 0% de vermes móveis são categorizados como fortes hits. NOTA: A exposição prolongada de placas no estágio dos microscópios de dissecção é evitada porque a fonte de luz pode aquecer as placas e induzir efeitos variáveis no bioensaio.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Passos críticos Apesar da simplicidade do protocolo, existem passos críticos no protocolo que merecem atenção adicional para maximizar a probabilidade de sucesso. Primeiro, exagerar as sementes pode interromper seu crescimento. Portanto, é essencial limitar o tempo das sementes na solução de branqueamento para 20 minutos ou menos. Em segundo lugar, como observado anteriormente por Storelli et al., a saúde aparente dos nematoides diminui ao longo do tempo quando armazenada a 4 °C16. O uso dos nematoides logo após sua coleta fornece confiança adicional de que condições ideais de triagem podem ser alcançadas. Se for necessário um armazenamento a longo prazo, certifique-se de que a tampa do tubo não esteja apertada para permitir a troca de oxigênio. Em terceiro lugar, garantir que as ervilhas cresçam nas placas de NA pelo tempo sugerido permite que o experimentador julgue quais sementes estão contaminadas. Em quarto lugar, sobrevar as ervilhas nas placas de GA antes de adicionar os nematoides enfraquecerá a infecção e reduzirá o rendimento do nematoide. Finalmente, muitos fatores difíceis de controlar podem impactar os resultados de triagem. Portanto, é essencial realizar múltiplas telas independentes de replicação em dias diferentes e, idealmente, com PPNs coletados de diferentes placas de cultura para garantir a reprodutibilidade dos resultados.
Limitações do método Uma limitação ao protocolo é que ele não consegue sincronizar o estágio de desenvolvimento dos vermes coletados, que variam de jovens a adultos. Assim, os fortes hits revelados por qualquer tela são provavelmente eficazes em vários estágios. No entanto, o protocolo aumenta o risco de ignorar hits eficazes específicos do estágio. Uma segunda consideração é que a triagem in vitro deve ser considerada o primeiro passo em um gasoduto de descoberta de nematicida; Ensaios baseados no solo são uma excelente adição a um pipeline para testar a tradução dos hits.
Significância e aplicação do protocolo Os protocolos aqui descritos são simples e facilmente replicados. Além disso, este protocolo foi aplicado com sucesso a outras PPNs no laboratório, incluindo penetrantes de Pratylenchus, fazendo apenas pequenas modificações. O desenvolvimento de novas e seguras medidas de controle de PPN é essencial para garantir a segurança alimentar global. Isso é especialmente verdadeiro para espécies como d. dipsaci que são geralmente tolerantes a uma grande variedade de nematicides químicos atualmente aceitáveis13,14. Assim, os protocolos aqui descritos têm o potencial de contribuir de forma importante para a saúde humana em escala global.

Estima-se que os nematoides parasiticos vegetais (PPNs) sejam responsáveis pela perda de 12,3% da produção global de alimentos e causem cerca de 157 bilhões de dólares em danos anualmente 1,2,3. Infelizmente, a capacidade de controlar as PPNs está diminuindo porque nematicides químicos eficazes foram banidos ou estão enfrentando restrições crescentes devido à segurança humana e preocupações ambientais. Isso se deve principalmente à pouca seletividade nematoide das gerações anteriores de pesticidas4. Nos últimos 25 anos, seis novos nematicides químicos foram pilotados ou introduzidos no mercado5. Um deles já foi banido na Europa, e outro foi descontinuado enquanto era investigado por seu impacto no calor humano 6,7. Portanto, há uma necessidade premente de novos nematicides que são altamente seletivos para PPNs.
O nematoide de caule e bulbo, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) é um PPN4. D. Dipsaci, que infecta cerca de 500 espécies de plantas em 30 raças biológicas e tem como alvo algumas das culturas mais importantes agrícolas, como centeio, aveia, alho, cebola e alho-poró 8,9. Por exemplo, d. dipsaci recentemente esbanjou campos de alho em Ontário e Quebec, resultando em perdas de até 90%10,11. Sua distribuição geográfica é quase onipresente e inclui as Américas (incluindo Califórnia e Flórida), Europa, grande parte da Ásia (incluindo a China) e Oceania9. D. dipsaci é um endoparasita migratório que entra na etomata em folhas ou feridas e lenticels onde liberam enzimas para quebrar a paredecelular 12. Compondo o impacto do D. dipsaci nas culturas, os danos causados pela PPN tornam a planta suscetível à infecção secundária11. Infelizmente, d. dipsaci mostra altos níveis de tolerância aos nematicides atuais em comparação com outras cepas de nematoides13,14.
Este protocolo descreve a cultura de D. dipsaci, e seu uso em telas de grande escala para nematicides candidatos a pequenas moléculas. Resumidamente, as populações de D. dipsaci são mantidas e expandidas em plantas de ervilha cultivadas na mídia Gamborg B-5 (GA)estéril 15. Antes de cultivar brotos de sementes em meio GA, as sementes devem ser esterilizadas através de uma série de lavagens e banhadas em ágar nutriente (NA) para verificar se há contaminação. A esterilização de sementes é essencial para detectar contaminantes bacterianos e fúngicos que possam estar presentes. As sementes não contaminadas são então transferidas para placas de GA, onde brotos de sementes crescerão em preparação para a infecção. As placas de GA contendo brotos de sementes são infectadas com nematoides de uma placa de cultura anterior, transferindo um pedaço de ágar contendo tecido radicular para as placas frescas. Após 6-8 semanas, os nematoides são extraídos da mídia GA e são filtrados através de um funil revestido de filtro de café em um béquer de coleção. Os nematoides podem ser usados em vários bioensadores uma vez que um número adequado tenha sido coletado. A técnica descrita neste protocolo gera aproximadamente 15.000 D. dipsaci por placa de cultura. Protocolos alternativos para cultivar D. dipsaci foram publicados 16,17.
Um ensaio de triagem de pequenas moléculas in vitro baseado no trabalho anterior18 também é descrito aqui. Como um proxy da saúde dos vermes, a mobilidade de 20 nematoides por poço é examinada após 5 dias de exposição a pequenas moléculas. Para melhor visualizar a mobilidade dos vermes, o NaOH é adicionado para aumentar o movimento de vermes vivos19,20. Este protocolo permite a triagem de rendimento médio e fornece dados valiosos para avaliar o potencial nematicida de pequenas moléculas. Se uma técnica diferente de coleta de nematoide for utilizada16,17, a metodologia de triagem de pequenas moléculas descrita aqui pode, no entanto, ser implementada.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>2 pinças</td><td>Almedic</td><td>7747-A10-108</td><td></td></tr><tr><td>Béquer de 2L</td><td>Pyrex</td><td>CLS10002L Béquer</td><td></td></tr> de <tr><td>50mL</td><td>Pyrex</td><td>CLS100050 Placa de</td><td></td></tr><tr><td>96 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>folha de alumínio</td><td>Alcan Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ágar bacteriológico</td><td>BioShop</td><td>AGR001.5</td><td></td></tr><tr><td>filtro de café</td><td>Sem marca</td><td>716</td><td></td></tr><tr><td>alvejante comercial 6%</td><td>Lavo Pro 6</td><td>DIN102358107</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri descartáveis (10 cm x 1,5 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri descartáveis (10 cm x 2,5 cm)</td>Escopo de dissecação <td>de Z358762</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>Leica MZ75</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Funil</td><td>VWR</td><td>414004-270</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5893-10L</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de vidro</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de vidro</td><td>MAGNA</td><td>60-1200</td><td></td></tr><tr><td>Papel mata-borrão sem fiapos</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 522-100</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de baixa retenção (200uL)</td><td>LABFORCE</td><td>1159M44</td><td></td></tr><tr><td>pipeta multicanal</td><td>Eppendorf research plus</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ágar nutriente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70148-100G</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>sementes de ervilha</td><td>Ontario Seed Company</td><td>D-1995-250G</td><td></td></tr><tr><td>soluções de limpeza de pinos</td><td>V & P Scientific</td><td>VP110A</td><td></td></tr><tr><td>pinner</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381N</td><td></td></tr><tr><td>bandejas de enxágue de pinner</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 421</td><td></td></tr><tr><td>reservatório de reagente com tampa para pipetas multicanal</td> Incubadora <td>de agitação de BR703459</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>I26</td><td></td></tr><tr><td>lâmina cirúrgica estéril</td><td>MAGNA</td><td>sb21-100-a</td><td></td></tr><tr><td>barra de agitação</td><td>Fisherbrand</td><td>2109 - 1451359</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing e triagem da planta parasitic nematode ditylenchus dipsaci

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Os nematoides parasiticos vegetais (PPNs) destroem mais de 12% das culturas alimentares globais a cada ano, o que equivale a cerca de 157 bilhões de dólares (USD) perdidos anualmente. Com uma população global crescente e terras aráveis limitadas, controlar a infestação de PPN é fundamental para a produção de alimentos. O desafio de maximizar a produção agrícola são as restrições crescentes a pesticidas eficazes devido à falta de seletividade de nematoides. Por isso, desenvolver nematicides químicos novos e seguros é vital para a segurança alimentar. Neste protocolo, demonstram-se a cultura e a coleta da espécie PPN Ditylenchus dipsaci . D. dipsaci é economicamente prejudicial e relativamente resistente à maioria dos nematicídeos modernos. O trabalho atual também explica como usar esses nematoides em telas para nematicides de pequenas moléculas e relatórios sobre metodologias de coleta e análise de dados. O gasoduto demonstrado oferece um rendimento de milhares de compostos por semana e pode ser facilmente adaptado para uso com outras espécies de PPN, como penetrantes de Pratylenchus. As técnicas aqui descritas podem ser usadas para descobrir novos nematicides, que, por sua vez, podem ser desenvolvidos em produtos comerciais altamente seletivos que combatem com segurança as PPNs para ajudar a alimentar um mundo cada vez mais faminto.

Réplicas independentes revelam hits reprodutíveis Para ilustrar a variação esperada entre as telas de replicação, os meios e a variação na mobilidade amostral são plotados a partir de três placas representativas de uma tela recente (Figura 1). Três réplicas da tela foram realizadas em três dias diferentes. Todas as três placas possuem controles negativos (somente solventes) (barras mais escuras) e as amostras dentro do conjunto continham nematicides estabelecidos. Os compostos restantes são de uma biblioteca personalizada que está sendo caracterizada no laboratório Roy. Em comparação com telas similares feitas com C. elegans com as mesmas moléculas (SC, JK, PJR, resultados inéditos), a taxa de acerto com D. dipsaci é significativamente menor, e muitas placas de drogas não apresentam atividade (Figura 1A). Algumas placas têm acertos totalmente reprodutíveis (Figura 1B,C), enquanto outras variam em atividade (Figura 1C). Em relação a outras espécies examinadas (não mostradas), d. dipsaci mostra menor variabilidade em sua resposta aos compostos. Independentemente disso, as réplicas são consideradas necessárias na identificação de hits reprodutíveis.
Os nematicides variam em sua capacidade de imobilizar ditylenchus dipsaci Dos sete nematicides caracterizados testados contra D. dipsaci, apenas Fluopyram apresenta atividade robusta no ensaio descrito aqui (Figura 1C). Isso é consistente com trabalhos anteriores mostrando que d. dipsaci é tolerante com nematicides13,14. Fluopyram inibe o complexo II da cadeia de transporte de elétrons de forma nematoide-seletiva e é um nematicida comercial usado para controlar uma variedade de PPNs, incluindo Rotylenchulus reniformis e Meloidogyne incognita 4,21,22. Fluopyram e um dos nematicides que não tinham atividade na concentração testada (Oxamyl)23 foram investigados com mais detalhes através de uma análise dose-resposta com D. dipsaci. O fluopyram induz um efeito aparente dependente de dose na mobilidade D. dipsaci com um EC50 de 9,3 μM (com um intervalo de confiança de 95% entre 8,2 e 10,5 μM) (Figura 2A,B). Este resultado é esperado com base nos resultados in vitro publicados da Storelli et al., 202013. Oxamyl não tem efeito significativo na mobilidade até uma concentração de 120 μM (p = 0,3632, t-test não remunerado) (Figura 2C,D).
Hidróxido de sódio melhora sensibilidade ao ensaio Em contraste com a atividade de natação quase contínua de C. elegans na cultura líquida18, os animais D. dipsaci são dramaticamente menos móveis. Isso não é incomum entre nematoides parasitas na cultura16. Para ajudar a distinguir vermes "descansando" de vermes doentes, 40 mM de NaOH é usado no ponto final do ensaio para estimular o movimento naqueles indivíduos capazes (Figura 3)19,20. Esta técnica permite a identificação clara de pequenas moléculas que imobilizam vermes, dado que todos os vermes em poços de controle negativo se movem e produzem um fundo excepcionalmente baixo de falsos positivos na tela.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg"> Figura 1: Exemplos de saída da tela. Três réplicas biológicas (círculos abertos) com D. dipsaci foram realizadas contra as pequenas moléculas (60 μM) em cada uma das três placas mostradas. Todas as três placas têm 0,6% dos controles somente de solventes DMSO (barras mais escuras). Exceto quando observados de outra forma com controles de solventes ou nematicides conhecidos, os poços das três placas contêm compostos relativamente não característicos de drogas comprados de fornecedores (ver Burns et al., 2015)18. (A) Uma placa de 96 poços da biblioteca de moléculas pequenas não tem qualquer molécula com bioatividade observável contra D. dipsaci. (B) Uma placa de poço 96 da pequena biblioteca de moléculas tem uma única molécula que interrompe a mobilidade de D. dipsaci . (C) Uma placa de 96 poços contendo os nematicides caracterizados fluopyram (fluo), iprodiona (ipro), abamectina (abam), fluensulfone (flue), tioxazafen (tiox), oxamyl (oxam) e wact-11. As barras de erro representam o erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo de resultados positivos e negativos utilizando ensaio de mobilidade. (A) Exemplos dos fenótipos terminais após a exposição de D. dipsaci ao aumento das concentrações de fluopíram após 5 dias antes da adição de NaOH. (B) Uma análise dose-resposta do movimento de D. dipsaci após 5 dias de exposição às concentrações indicadas de fluopíramo. (C,D) O mesmo que A,B, exceto oxamyl. Cada gráfico mostra ensaios feitos em dois dias separados com três réplicas por dia. O eixo y de cada gráfico indica a fração móvel dos vermes em cada bem calculado como o número de animais se movendo em relação ao número total de animais no poço. As barras de erro em ambos os gráficos representam o erro padrão da média. A barra de escala representa 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg"> Figura 3: Mobilidade de D. dipsaci depois de adicionar 40 mM de NaOH. O efeito da adição de NaOH às amostras de D. dipsaci na presença de controle somente de solvente (A), tioxazafen (B) ou fluopyram (C) após 5 dias de co-incubação. A barra de escala representa 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente protocolo descreve um método confiável e direto para a colheita, coleta e triagem de ditylenchus dipsaci.

Culturing e Triagem da Planta Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

Este protocolo permite a descoberta de novos nematicides para combater o dipsaci ditylenchus através da técnica de cultivo e telas químicas de médio rendimento. A simplicidade dessa técnica permite a triagem de milhares de compostos por semana para identificar compostos com potencial nematicida. Esta técnica pode identificar novos compostos para matar nematoides parasiticos vegetais das culturas e, portanto, aumentar a oferta global de alimentos.Para começar, prepare 500 mililitros de ágar nutriente, ou mídia NA, com 23 gramas por litro de NA e água ultra-pura. Usando técnica estéril, despeje 25 mililitros de mídia NA autoclaved em 20 placas descartáveis de 100 milímetros de diâmetro e 15 milímetros de profundidade de Petri. Prepare 500 mililitros de Gamborg B5, ou mídia GA, contendo 3,2 gramas por litro de meio basal GA com orgânicos mínimos, 20 gramas por litro de sacarose, 15 gramas por litro de ágar e água destilada.Usando técnica estéril, despeje 50 mililitros de mídia GA autoclaved em 10 placas de Petri descartáveis. Para realizar a esterilização de sementes, despeje 150 sementes de ervilha em um béquer estéril de dois litros com uma barra de agitação perto de uma chama de queimador bunsen em um banco de laboratório. Adicione 200 mililitros de 95% de etanol às sementes e mexa vigorosamente na placa de mexida por cinco minutos.Em seguida, despeje o etanol em um recipiente de lixo. Despeje a solução de alvejante no béquer para imergir completamente as sementes. Mexa vigorosamente em uma placa de mexida por 20 minutos.Em seguida, despeje o alvejante em um recipiente de lixo. Despeje água destilada no béquer para mergulhar as sementes e mexa vigorosamente em um prato de mexida por 20 minutos. Após a lavagem final da água, despeje sementes esterilizadas na placa de vidro Petri.Para verificar se há contaminação, transfira seis sementes para cada placa NA de 10 centímetros no capô de fluxo laminar usando fórceps esterilizados. Disponha as sementes ao redor da circunferência do prato. Enrole as placas individualmente em filme de embalagem de laboratório e incuba-as no escuro por três dias a 26 graus Celsius.Em uma capa de fluxo laminar, placa duas sementes não contaminadas em cada placa de GA com fórceps esterilizados. Incubar em temperatura ambiente por 7 a 10 dias para permitir que as sementes brotem. Prepare 50 mililitros de solução de sacarose de 20 gramas por litro.O filtro esteriliza a solução de sacarose e reserve. Em um capô de fluxo laminar, corte um pedaço de ágar contendo tecido radicular de uma placa de cultura existente. Pipeta 500 microliters de solução de sacarose em nova placa GA com mudas de ervilha e coloque um cubo de ágar em cima da sacarose.Mantenha a cultura em uma caixa forrada com papel alumínio à temperatura ambiente. Para manter a cultura, subcultura os nematoides em placas de GA frescas a cada oito a nove semanas. Nematoides estão prontos para serem extraídos após cerca de oito semanas.Em uma capa de fluxo laminar, corte o ágar e o tecido radicular em cubos de um centímetro com um bisturi estéril. Transfira os cubos de ágar para o funil revestido de filtro de café e despeje lentamente água destilada no ágar para umedecer o filtro de café. Remova o funil forrado de filtro de café do béquer e encha o béquer com água destilada até que o nível da água esteja apenas tocando o fundo do filtro assim que o funil forrado pelo filtro de café for substituído.Cubra o funil forrado de filtro de café e o béquer com papel alumínio. Para coletar os vermes, remova o funil forrado de filtro de café e aspire os 40 mililitros de água do béquer de coleta, não interrompendo os vermes assentados. Colete o líquido restante em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros com uma pipeta sorológica de plástico de 10 mililitros.Para preparar as placas de ensaio, despeje água autoclave destilada em um cocho estéril e dispense 40 microliters de água destilada do cocho em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços com uma pipeta multicanal. Adicione produtos químicos das placas químicas de 96 poços às placas de ensaio, fixando três vezes na placa química. Em seguida, transfira os pinos 10 vezes para a placa de ensaio.Borrida no papel em frente à solução de limpeza. Para contar o número de nematoides da coleção, primeiro, suspenda novamente a coleção e, em seguida, pipeta cinco microliters da solução usando pontas de baixa retenção em um slide. Conte o número de nematoides em cinco microlitros usando um microscópio de dissecção.Em seguida, ajuste a concentração para dois vermes por microliter usando água estéril e destilada. Em seguida, adicione 10 microliters da amostra a cada poço das placas de 96 poços com uma pipeta multicanal e um cocho. Enrole as placas com uma toalha de papel úmida e coloque-as em uma caixa.Em seguida, adicione uma toalha de papel úmido extra para estabilizar e garantir o movimento mínimo das placas e afixar em uma almofada pegajosa em uma incubadora de agitação de 20 graus Celsius definida para 200 RPM. Observe as placas no quinto dia sob um microscópio dissecando. Conte o número de d.dipsaci móvel e total em controles de solventes DMSO e poços tratados com drogas.Se os vermes estiverem imóveis, adicione dois microlitradores de hidróxido de sódio de um molar a uma concentração final de 40 milimôlares ao poço para estimular o movimento. Calcule a proporção de vermes móveis. Nas telas D.dipsaci, poços que reproduzivelmente renderam vermes 0% móveis são categorizados como hits fortes.Três placas de drogas diferentes foram rastreadas em uma concentração de 60 micromolar, onde cada placa de droga tem três réplicas biológicas. Todas as três placas incluíam 6% dos controles somente de solventes DMSO. Muitas placas contendo drogas da pequena biblioteca de moléculas não tinham qualquer molécula com bioatividade observável contra d.dipsaci.Algumas placas tinham golpes totalmente reprodutíveis, enquanto outras contendo nematicides caracterizados variavam em sua atividade. As barras de erro representam o erro padrão da média. Aqui, o fluopyram exibiu atividade robusta no ensaio.Fluopyram induziu um efeito aparente dependente de dose na mobilidade d.dipsaci com um EC50 de 9,3-micromolar. O oxamílico não teve efeito significativo na mobilidade até uma concentração de 120 micromolares. O oxamílico não teve efeito significativo na mobilidade até uma concentração de 120 micromolar.A adição de hidróxido de sódio melhorou a sensibilidade do ensaio na detecção de vermes imóveis. 40 milimiliar de hidróxido de sódio foi usado como ponto final de ensaio para estimular o movimento em indivíduos capazes e, assim, distinguir vermes descansando de vermes doentes. Este protocolo permitiu a identificação de compostos com novos mecanismos de ação contra d.dipsaci e outras espécies.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.

Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp.</em

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de triagem para identificar a eficácia de nematicidas de moléculas pequenas contra nematóides. Os nematicidas são considerados eficazes se causarem uma diminuição no número de nematóides móveis na amostra após a exposição.

Ensaio de triagem de nematicidas de moléculas pequenas: um método de rendimento médio para rastrear nematicidas potenciais contra Ditylenchus dipsaci

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Um protocolo para investigar o comportamento de acasalamento do nematoide da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é apresentado. As características comportamentais de B. xylophilus são descritas no processo de acasalamento.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

Aqui, um protocolo é apresentado para a seleção não-destrutiva rápida de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O protocolo envolve o exame visual das raízes de mudas de algodoeiro infectadas com nematoides para determinar a resposta da infecção. O disparo vegetativo de cada planta é então propagado para recuperar plantas para a produção de sementes.

Triagem de genótipos de algodão para resistência ao nematódeo reniforme

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Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

O protocolo descreve a infecção de raízes de Solanum tuberosum com nematóides parasitas de plantas em condições de casa de vegetação in vivo e raízes transgênicas in vitro de batata para análise histoquímica da estrutura radicular por meio de microscopia óptica.

Infecção in vivo e in vitro de raízes de batata com nematóides parasitas de plantas para avaliação de alterações estruturais induzidas

Apresentamos dois métodos para que agricultores propaguem em massa nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. O primeiro método utiliza gel de poliacrilamida como substrato de cultivo do nematoide, enquanto o segundo utiliza algodão revestido com polímero como substrato de cultivo. Ambos os métodos dependem da propagação in vivo de nematoides dentro de cadáveres de insetos.

Propagação In Vivo de Nematoides Entomopatogênicos Baseada em Cultivadores

Aprenda a cultivar e triar o nematoide parasita de plantas Ditylenchus dipsaci usando técnicas de cultivo e triagens químicas de média vazão. Este método permite identificar novos nematicidas para proteção de culturas.

Culturing e Triagem da Planta Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

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