Name: Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a implementar microscopia SRS de foco espectral para histologia de Raman estimulada em tempo real usando tecido cerebral de rato. Esta técnica sem marcadores acelera o diagnóstico tecidual sem processamento ou coloração.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pelo NIH R35 GM133435 a D.F.

<ol><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Cui, M., Zhang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+and+computational+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence and computational pathology.</a> Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Orringer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+intraoperative+histology+of+unprocessed+surgical+specimens+via+fibre-laser-based+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).</li>
<li>Ji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+brain+tumors+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).</li>
<li>Hollon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+real-time+intraoperative+brain+tumor+diagnosis+using+stimulated+Raman+histology+and+deep+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks.</a> Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraoperative+assessment+of+skull+base+tumors+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).</li>
<li>Lu, F. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+neurosurgical+pathology+with+stimulated+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging.</a> Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).</li>
<li>Shin, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+imaging+of+breast+calcifications+in+association+with+neoplastic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes.</a> Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).</li>
<li>Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+with+stimulated+Raman+scattering+by+chirped+femtosecond+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).</li>
<li>Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microscale+temperature+imaging+by+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+intracellular+distribution+of+tyrosine+kinase+inhibitors+in+living+cells+with+quantitative+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering.</a> Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsai%2C+PS+%22In+Vivo+Optical+Imaging+of+Brain%22">In Vivo Optical Imaging of Brain</a>. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).</li>
<li>Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+pathology+by+spectrally+sliced+femtosecond+stimulated+Raman+scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy.</a> PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).</li>
<li>Figueroa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+parabolic+fiber+amplifier+source%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source.</a> Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Wright, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+enhanced+signal+in+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy.</a> Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

O esquema de imagem SRS de duas cores apresentado neste protocolo depende da implementação adequada de imagens SRS de uma cor. Em imagens de SRS de uma cor, as etapas críticas são alinhamento espacial, alinhamento temporal, profundidade de modulação e mudança de fase. A combinação espacial dos dois feixes é realizada por um espelhodicróico. Vários espelhos de direção são usados para ajuste fino ao enviar as vigas para o espelho dicroico. Uma vez que os feixes são combinados com o espelho dicroico, o alinhamento espacial ...

Os diagnósticos tradicionais de tecido dependem de protocolos de coloração seguidos de exame sob um microscópio óptico. Um método comum de coloração usado pelos patologistas é a coloração de H&E: manchas de hematoxilina nos núcleos celulares um azul arroxeado, e eosina mancha a matriz extracelular e citoplasma rosa. Essa simples coloração continua sendo o padrão ouro na patologia para muitas tarefas de diagnóstico de tecido, particularmente o diagnóstico de câncer. No entanto, a histopatologia H&E, particularmente a técnica de secção congelada usada em um ambiente intraoperatório, ainda tem limitações. O procedimento de coloração é um processo trabalhoso que envolve incorporação de tecidos, secção, fixação e coloração1. O tempo típico de retorno é de 20 minutos ou mais. O desempenho do H&E durante a seção congelada às vezes pode se tornar mais desafiador quando várias seções são processadas ao mesmo tempo devido à necessidade de avaliar características celulares ou padrões de crescimento em 3D para avaliação de margem. Além disso, técnicas histológicas intraoperatórias exigem técnicos e clínicos qualificados. A limitação no número de patologistas certificados pelo conselho em muitos hospitais é uma restrição para consulta intraoperatória em muitos casos. Tais limitações podem ser aliviadas com os interesses de desenvolvimento rápido na patologia digital e no diagnóstico baseado em inteligência artificial2. No entanto, os resultados de coloração do H&E são variáveis, dependendo da experiência do técnico, que apresenta desafios adicionais para o diagnóstico baseado em computador2.
Esses desafios podem ser potencialmente enfrentados com técnicas de imagem óptica sem rótulos. Uma dessas técnicas é a microscopia SRS. O SRS usa lasers pulsados sincronizados — bomba e Stokes — para excitar vibrações moleculares com alta eficiência3. Relatórios recentes demonstraram que a imagem de proteínas e lipídios da SRS pode gerar imagens equivalentes a H&E (também conhecida como histologia raman estimulada ou SRH) com tecido fresco intacto, o que contorna a necessidade de qualquer processamento de tecido, encurta significativamente o tempo necessário para o diagnóstico, e foi adaptado intraoperatóriamente4. Além disso, a imagem SRS pode fornecer imagens 3D, que oferecem informações adicionais para diagnóstico quando as imagens 2D são insuficientes5. O SRH é imparcial e gera imagens digitais prontamente disponíveis para diagnóstico baseado em computador. Ele surge rapidamente como uma possível solução para o diagnóstico de câncer intraoperatório e análise da margem do tumor, especialmente no câncer cerebral 6,7,8. Mais recentemente, a imagem srs de alterações químicas do tecido também foi sugerida para fornecer informações diagnósticas úteis que podem ajudar ainda mais os médicos a estratificar diferentes tipos de câncer ouestágios 9.
Apesar de seu tremendo potencial em aplicações de diagnóstico de tecidos, a imagem SRS é limitada principalmente a laboratórios acadêmicos especializados em óptica devido à complexidade associada à plataforma de imagem, que inclui lasers ultrarrápidos, microscópio de varredura a laser e sofisticados eletrônicos de detecção. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado para demonstrar o uso de uma fonte de laser femtosegundo comum para imagens srs em tempo real e duas cores e a geração de imagens pseudo-H&E a partir do tecido cerebral do mouse. O protocolo abrangerá os seguintes procedimentos:
Alinhamento e otimização de chirp A maioria dos esquemas de imagem SRS usam picosegundos ou lasers femtosegundos como fonte de excitação. Com lasers femtosegundos, a largura de banda do laser é muito maior que a largura de linha raman. Para superar essa limitação, uma abordagem focalizante espectral é usada para chirp os lasers femtosegundos para uma escala de tempo picosegundo para alcançar a resolução espectral estreita10. A resolução espectral ideal só é alcançada quando o chirp temporal (também conhecido como dispersão de atraso de grupo ou apenas dispersão) é devidamente combinado para a bomba e os lasers stokes. O procedimento de alinhamento e as etapas necessárias para otimizar a dispersão dos raios laser usando hastes de vidro altamente dispersivas são demonstradas aqui.
Calibração de frequência Uma vantagem do srs focalizado espectral é que a excitação de Raman pode ser rapidamente ajustada alterando o atraso de tempo entre a bomba e os lasers Stokes. Tal ajuste oferece imagens rápidas e aquisição espectral confiável em comparação com comprimentos de onda a laser de ajuste. No entanto, a relação linear entre a frequência de excitação e o atraso de tempo requer calibração externa. Solventes orgânicos com picos raman conhecidos são usados para calibrar a frequência raman para srs focalizando espectral.
Imagem em tempo real, de duas cores É importante aumentar a velocidade de imagem nas aplicações de diagnóstico tecidual para encurtar o tempo necessário para analisar grandes amostras de tecido. A imagem simultânea de SRS de duas cores de lipídios e proteínas evita a necessidade de ajustar o laser ou o atraso de tempo, o que aumenta a velocidade de imagem em mais de duas vezes. Isso é conseguido usando uma nova técnica de modulação ortogonal e demodulação de dois canais com um amplificador lock-in11. Este artigo descreve o protocolo de modulação ortogonal e aquisição de imagens de dois canais.
Imagem SRS do modo epi A maioria das imagens SRS mostradas até o momento é realizada no modo de transmissão. A imagem do modo epi detecta fótons recattered do tecido12. Para aplicações patológicas, as amostras cirúrgicas podem ser bastante grandes. Para a imagem do modo de transmissão, a secção tecidual é muitas vezes necessária, o que indesejavelmente requer tempo extra. Em contraste, a imagem do modo epi pode funcionar com amostras cirúrgicas intactas. Como o mesmo objetivo é usado para coletar luz retorcido, também não há necessidade de alinhar um condensador de abertura numérica elevada necessário para a imagem de transmissão. O modo epi também é a única opção quando a seção tecidual é difícil, como com osso. Anteriormente, demonstramos que, para o tecido cerebral, a imagem do modo epi oferece qualidade de imagem superior para a espessura do tecido > 2 mm13. Este protocolo usa um divisor de feixe polarizador (PBS) para coletar fótons dispersos despolarizados pelo tecido. É possível coletar mais fótons com um detector anular em detrimento da complexidade do conjunto de detector personalizado12. A abordagem PBS é mais simples de implementar (semelhante à fluorescência), com o fotodiodo padrão já sendo usado para detecção do modo de transmissão.
Geração de imagens Pseudo-H&E Uma vez coletadas imagens srs de duas cores, elas podem ser recoloridas para simular a coloração de H&E. Este artigo demonstra o procedimento para converter imagens de SRS lipídicos e proteicos em imagens pseudo-H&E SRS para aplicações patológicas. O protocolo experimental detalha as etapas críticas necessárias para gerar imagens srs de alta qualidade. O procedimento aqui mostrado não é apenas aplicável ao diagnóstico tecidual, mas também pode ser adaptado para muitas outras aplicações de imagem hiperespectral srs, como imagem de drogas e imagem metabólica14,15.
Requisitos gerais do sistema O sistema laser para este protocolo deve ser capaz de produzir 2 raios laser femtosegundos sincronizados. Os sistemas possuem idealmente um Oscilador Paramétrico Óptico (OPO) para afinação de comprimento de onda amplo de um dos raios laser. A configuração deste protocolo usa um sistema de laser comercial Insight DS+ que produz dois lasers (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe tunable baseado em OPO, variando de 680 a 1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz. Microscópios de varredura a laser, seja de grandes fabricantes de microscópios ou caseiros, podem ser usados para imagens SRS. O microscópio utilizado é um microscópio de varredura a laser vertical construído em cima de um quadro comercial de microscópio vertical. Um par de espelhos galvo de 5 mm são usados para escanear o raio laser. Para os usuários que optarem por adotar um microscópio de varredura a laser construído em casa, consulte um protocolo publicado anteriormente para a construção de um microscópio de varredura a laser16.

<table><tbody><tr><td>Lente acromática de 100 mm</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>Banda larga, 650 - 1.050 nm, distância focal da lente acromática, filtro passa-banda de 100 mm</td></tr><tr><td>20 MHz</td><td>Minicircuitos</td><td>BBP-21.4+</td><td>Filtro passa-banda LC concentrado, 19,2 - 23,6 MHz, 50 e ômega;</td></tr><tr><td>Lente acromática de 200 mm</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>Banda larga, 650 - 1.050 nm, distância focal da lente acromática, 200 mm</td></tr><tr><td>Meia placa de onda acromática</td><td>Union Optic</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>Banda larga meia placa de onda</td></tr><tr><td>Acromática</td><td>Union Optic</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>Wideplate Quarter waveplate</td></tr><tr><td>Beam Sampler</td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 Espelho</td></tr><tr><td>dicróico dicroico</td> divisor <td>de feixe de placas THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>Outros dicróicos com comprimento de onda central em torno de 1.000 nm podem ser usados.</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>Solvente para calibração do deslocamento Raman. Outros solventes com picos Raman conhecidos podem ser usados.</td></tr><tr><td>Modulador de amplitude eletro-óptico</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>São necessários dois EOMs para modulação ortogonal e imagem de canal duplo. A versão ressonante é recomendada para que uma tensão de acionamento mais baixa possa ser usada.</td></tr><tr><td>Falso H& Script de coloração E</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>Fanout Buffer</td><td>PRL-414B</td><td>Pulse Research Lab</td><td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer e Line Driver, para gerar a frequência de condução EOM e a referência ao</td></tr><tr><td>fotodiodo rápido</td><td>de bloqueio THORLABS</td><td>DET10A2</td><td>Si Detector, 1 ns Tempo de subida</td></tr><tr><td>Divisor de frequência</td><td>PRL-220A</td><td>Laboratório</td> <td>de pesquisa de pulsoDivisor de frequência TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), para geração de 20MHz a partir da saída do laser.</td></tr><tr><td>Hastes de vidro altamente dispersivas</td><td>Union Optic</td><td>CYLROD01</td><td>Lente de haste H-ZF52A de alta dispersão 120 mm, SF11 Lente de haste 100 mm</td></tr><tr><td>Sistema Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>Laser capaz de emitir dois lasers pulsados sincronizados (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe sintonizável, variando de 680-1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz.&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplificador de bloqueio</td><td>Liquid Instruments</td><td>Moku Lab</td><td>Amplificador de bloqueio para extrair o sinal SRS do fotodiodo. Um instrumento Zurich HF2LI ou instrumento semelhante também pode ser usado.</td></tr><tr><td>Espelhos</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>Espelho dielétrico de banda larga, 750 - 1.100 nm. Espelhos prateados também podem ser usados.</td></tr><tr><td>Estágio de atraso motorizado</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>Estágio de atraso para controle fino da sobreposição temporal da bomba e dos lasers Stokes. Qualquer outro estágio motorizado deve funcionar.</td></tr><tr><td>Condensador de imersão em óleo</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>1.4 NA. Outros condensadores com NA>1.2 podem ser usados.</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>Qualquer outro osciloscópio com largura de banda de 400 MHz ou superior deve funcionar.</td></tr><tr><td>Deslocador de fase</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>Para deslocar a fase da frequência de modulação</td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>Diodo PIN de silício com grande área (10 x 10 cm2). Outros diodos com grande área e baixa capacitância podem ser usados.</td></tr><tr><td>Divisor de feixe polarizador</td><td>Union Optic</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>Divisor de feixe polarizador de banda</td></tr><tr><td>larga Banco de dados</td><td></td><td></td> de índice de refatividade <td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>Retrorrefletor</td><td>Edmund Optics</td><td>34-408</td><td>BBAR Prisma de ângulo reto. Outros prismas ou retrorrefletores podem ser usados.</td></tr><tr><td>Minicircuitos</td> de <td>amplificador de potência RF</td><td>ZHL-1-2W +</td> <td>bloco de ganho, 5 - 500 MHz, 50 e ômega;</td></tr><tr><td>Espelhos de varredura</td><td>Cambridge Technologies</td><td>6215H</td><td>Usamos um conjunto de espelhos de 5 mm com revestimento prateado</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Basic</td><td>Software de controle de microscópio de varredura a laser</td></tr><tr><td>Filtro Shortpass</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>Filtro Shortpass Premium de 25,0 mm, Comprimento de onda de corte: 1.000 nm. Para uma supressão eficiente dos Stokes, dois filtros podem ser necessários.</td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>Qualquer outra estrutura de microscópio pode ser usada. Se um microscópio de varredura a laser estiver disponível, ele pode ser usado diretamente. Caso contrário, um scanner galvo e uma lente de varredura precisavam ser adicionados ao microscópio.</td></tr><tr><td>Objetiva de imersão em água</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>A objetiva multifotônica 25X tem um NA de 1,05. Outros objetivos semelhantes podem ser usados.</td></tr></tbody></table>

raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) surgiu como uma poderosa técnica de imagem óptica para diagnóstico de tecidos. Nos últimos anos, o SRS de duas cores mostrou-se capaz de fornecer imagens equivalentes à hematoxilina e eosina (H&E) que permitem um diagnóstico rápido e confiável do câncer cerebral. Tal capacidade permitiu aplicações emocionantes de diagnóstico de câncer intraoperatório. A imagem de tecido srs de duas cores pode ser feita com uma fonte de laser picosegundo ou femtosegundo. Os lasers Femtosegundos têm a vantagem de permitir modos de imagem flexíveis, incluindo imagens hiperespectrais rápidas e imagens srs em tempo real de duas cores. Uma abordagem espectral com pulsos laser chirped é tipicamente usado com lasers femtosegundos para alcançar alta resolução espectral. 
A aquisição de SRS de duas cores pode ser realizada com modulação ortogonal e detecção de lock-in. A complexidade do pulso, modulação e caracterização é um gargalo para a adoção generalizada desse método. Este artigo fornece um protocolo detalhado para demonstrar a implementação e otimização do SRS focado no espectral e imagens em tempo real de duas cores do tecido cerebral do camundongo no modo epi. Este protocolo pode ser usado para uma ampla gama de aplicações de imagem SRS que aproveitam a alta velocidade e capacidade de imagem espectroscópica do SRS.

Otimização da resolução espectral: A dispersão através de um material é afetada pelo meio dispersivo (comprimento e material) e comprimento de onda. A alteração do comprimento da haste de dispersão afeta a resolução espectral e o tamanho do sinal. É uma relação de dar e receber que pode ser ponderada de forma diferente dependendo da aplicação. As hastes esticam o pulso do feixe de ser larga em frequência e estreita no tempo para ser estreita em frequência e larga no tempo. A Figur...

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Este protocolo demonstrará a implementação e otimização da microscopia srs espectral e como ela pode ser usada para aplicações de histologia Raman estimuladas em tempo real. A principal vantagem desta técnica é a velocidade com que as amostras podem ser processadas uma vez que a instrumentação esteja adequadamente alinhada, já que o SRS não requer processamento e coloração de tecidos. Este protocolo é aplicável a outras aplicações srs, não apenas limitadas à histologia.Tais aplicações incluem pequenas moléculas, drogas, células e tecidos. Comece instalando um par de lentes acráticas para o feixe de bomba para ampliar o tamanho do raio laser em duas vezes como ponto de partida. Coloque uma lente de 100 e 200 milímetros a cerca de 300 milímetros uma da outra.Em seguida, alinhe o feixe da bomba através do centro de ambas as lentes. Em seguida, coloque um espelho após a segunda lente para enviar o feixe em direção a uma parede a mais de um metro de distância. Rastreie o feixe do espelho até a parede com um cartão IR e verifique se o feixe muda de tamanho.Cobrem o feixe se o feixe mudar de tamanho em função da distância. Combine os dois raios laser instalando um espelho dicroico com vários espelhos de direção para ajuste. Otimize a sobreposição espacial da bomba e stokes monitorando feixes após o espelhodicróico em duas posições diferentes em torno de um metro de distância.Ajuste iterativamente o espelho de direção seguido do espelhodicróico para alinhar o feixe de Stokes com o feixe da bomba. Certifique-se de que os feixes combinados sejam enviados para o centro dos espelhos de varredura do microscópio de varredura a laser, ajustando um par de espelhos de direção quando os espelhos de varredura estiverem na posição estacionada. Após o condensador, use outro par de lentes com distâncias focais de 100 milímetros e 30 milímetros, respectivamente, para retransmitir o feixe transmitido para o focdiodo, garantindo que ambos os feixes estejam contidos dentro do fotodiodo.Em seguida, instale dois filtros de passagem baixa para bloquear o feixe de Stokes modulado. Coloque um sampler de feixe no caminho do feixe de Stokes para pegar 10% do feixe e enviá-lo para um fotodiodo rápido para detectar o trem de pulso de 80 mega-hertz. Pegue uma das saídas do buffer de fanout e filtre-o com um filtro de passe de banda para obter uma onda sinusoidal de 20 mega-hertz.Em seguida, use um atenuador rf para ajustar o pico de saída para tensão máxima para aproximadamente 500 milvolts. Envie a saída resultante para um câmbio de fase, o que permite um ajuste fino da fase RF com uma fonte de tensão. Envie esta saída para um amplificador de energia RF e conecte a saída do amplificador ao EOM.Depois de desbloquear o feixe de Stokes, otimize a profundidade de modulação do primeiro EOM colocando um fotodiodo no caminho do feixe. Ajuste a tensão EOM e a placa de onda de trimestre até que a profundidade de modulação pareça satisfatória. Coloque um fotodiodo após o espelhodicróico para detectar o raio laser.Bloqueie o feixe de Stokes primeiro, depois amplie um dos picos de pulso da bomba no osciloscópio. Coloque um cursor vertical para marcar a posição temporal deste pico com o osciloscópio. Agora bloqueie o feixe da bomba e desbloqueie a viga de Stokes.Traduza a etapa de atraso para corresponder temporariamente as posições de pico no osciloscópio à posição marcada na etapa anterior. Calculando a distância de atraso necessária para corresponder às duas vigas seguidas, alongando o caminho do feixe do feixe mais rápido ou encurtando o caminho do feixe do feixe mais lento. Em seguida, prepare uma amostra de slides de microscópio com DMSO e fita dupla face como um espaçador para segurar a amostra entre o slide e um deslizamento de tampa.Coloque a amostra no microscópio com o lado do deslizamento de tampa voltado para o objetivo do microscópio e observe a amostra da peça I sob iluminação de campo brilhante. Encontre o foco da amostra tanto na camada superior quanto inferior das bolhas de ar na interface da fita de vidro e, em seguida, mova o foco para estar entre as duas camadas da fita. Em seguida, defina a saída do feixe tunable para 798 nanômetros.Com base no rendimento óptico do condensador, ajuste a potência óptica para aproximadamente 40 miliwatts cada para a bomba e os feixes de Stokes no foco objetivo. Em seguida, abra a imagem de varredura no MATLAB e clique no botão de foco rotulado para iniciar a digitalização. Ajuste o espelho de direção antes que o scanner de galvo centralize o sinal DC no visor do canal um.Mova o estágio de atraso motorizado e observe de perto a saída de bloqueio mostrada no visor do canal dois. Por fim, ajuste o atraso de tempo para maximizar a intensidade do sinal CA. Ajuste o espelho dicroico para centralizar o sinal SRS no canal CA.Em seguida, ajuste a fase do amplificador de travamento para maximizar o sinal. Depois de montar a amostra deslize para o microscópio e ajustar a potência de ambos os feixes para aproximadamente 40 miliwatts cada um em foco de amostra, como demonstrado anteriormente. Abra a imagem de varredura do MATLAB.Em seguida, encontre o sinal máximo srs através da fase de atraso correspondente ao pico de 2,913 centímetros inversos raman do DMSO. Adquira uma imagem SRS correspondente ao pico de 2,913 centímetros inversos de Raman do DMSO. Abra a imagem no ImageJ e selecione uma pequena área no centro do quadro.Use a função de medida para calcular a média e o desvio padrão dos valores na área selecionada. Para calibração de acesso à frequência, salve uma varredura hiperespectral com a faixa de estágio de atraso cobrindo os picos de 2,913 e 2.994 centímetros inversos de Raman de DMSO. Em seguida, salve as posições de estágio correspondentes ao conjunto de dados hiperespectrais.Realizar regressão linear para as posições de palco e Raman muda em 2,913 e 2.994 centímetros inversos. Usando a equação de regressão linear, converta as posições de atraso nas frequências raman correspondentes. Para calibração da resolução espectral, estime a posição do estágio com base na posição anterior com o aumento do comprimento óptico do caminho devido à inserção de hastes.Realinhar a sobreposição espacial dos feixes devido ao leve desvio do feixe quando as hastes de vidro são adicionadas. Instale um divisor de feixe polarizador, uma placa de onda de quarto e um segundo EOM no caminho do feixe de imersão após o primeiro EOM. Desligue a entrada do sinal para o segundo EOM e, em seguida, conecte a entrada de sinal ao primeiro EOM e ligue-a.Modular o feixe de Stokes em 20 mega-hertz enviando o feixe através do primeiro EOM. Ajuste a inclinação e a posição do primeiro EOM para garantir que o feixe esteja centrado através do cristal EOM. Prepare uma amostra de slides de tecido com fita dupla face, deslizamento de microscópio e vidro de cobertura.Coloque a amostra no microscópio com o lado de deslizamento de cobertura voltado para o objetivo do microscópio. Para imagens SRS do modo epi, instale uma placa de meia onda antes que o feixe entre no microscópio para alterar a polarização do feixe que vai para o microscópio. Coloque um divisor de feixe polarizador acima do objetivo de permitir que o feixe refletido de costas despolarizada chegue ao detector.Em seguida, use uma lente de acromato de 75 milímetros e uma lente asférica de 30 milímetros para retransmitir os fótons espalhados de trás da abertura traseira do objetivo para o detector de fotos. Monte o detector para coletar a luz dispersa traseira dirigida pelo divisor de feixe polarizador. Em seguida, instale um filtro para impedir que o feixe modulado entre no detector.A variação dos comprimentos da haste afeta a resolução espectral. Quando não são usadas hastes de vidro, os dois picos raman da DMSO não são resolvidos. Um aumento no número de hastes de vidro começa a resolver os dois picos em um ponto satisfatório.O chirping combinado resolve ambos os picos e pode ser usado para calibrar posições de estágio para frequência. Dois tempos de trem de pulso atrasado de polarização ortogonal usado para imagem espectros DMSO mostram o atraso de tempo entre as excitações srs com profundidade de modulação aceitável e separação temporal. Em contraste, uma mudança de fase de duas cores pobres, dá origem a picos invertidos ou negativos.Em tempo real, duas imagens de SRS coloridas em 2,850 e 2.930 centímetros inversos de tecido cerebral ex vivo mouse são mostrados aqui. As imagens lipídicas e proteicas cruas foram codificadas por cores para produzir uma única imagem representando contribuições lipídicas e proteicas. Falsa hematoxilina e recoloração de eosina, também foram realizadas para imitar a hematoxilina e a coloração de eosina para aplicações patológicas.A sobreposição temporal espacial e a otimização da resolução espacial são os passos mais importantes para a abordagem espacial focalização do SRS. Este método é geralmente aplicável para outros experimentos de microscopia de sonda de bomba, como microscopia de absorção transitória. O método também permite a imagem de moléculas não fluorescentes em células e tecidos.O método aqui apresentado acelera o tempo de aquisição de imagens para futura tradução da histologia estimulada de Raman na clínica.

real-time-two-color-stimulated-raman-scattering-imaging-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Bioimaging métodos utilizados para avaliar biodistribuição das células de nanopartículas são aplicáveis ​​para monitorização terapêutica e de diagnóstico de compostos nanoformulated. Os métodos descritos neste documento são sensíveis e específicos, quando avaliada por coregistration histológica. As metodologias de fornecer um caminho de translação de roedores para aplicação em seres humanos.

BioImaging registradas de Nanomateriais para Monitoramento de Diagnóstico e Terapêutica

Fonte: Espinoza, R., et al. Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores em tempo real do cérebro de camundongos para diagnóstico de tecidos. J. Vis. Exp. (2022).  O vídeo demonstra imagens de espalhamento Raman estimulado (SRS) de duas cores de seções de tecido cerebral de camundongos. Dois feixes de laser sincronizados são direcionados para a seção de tecido para excitar vibrações moleculares, resultando em uma mudança de intensidade relativa nos feixes. Lipídios e proteínas no...

Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'&gt; Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de...

 Microscopia de dois fótons para imagens in vivo de microvasculatura cerebral de camundongos 

Fonte: McCullagh, E. A., et al. Aplicação de Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS) para mielinização de imagem em fatias de cérebro. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra imagens de fluorescência e espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) para visualizar a arquitetura neuronal no tecido cerebral de roedores. A coloração de Nissl marca os corpos celulares ligando-se ao RNA ribossômico, enquanto a imagem CARS tem como alvo a mielina rica em lipídios por meio de sinais induzidos...

Espectroscopia Raman anti-Stokes coerente para visualizar neurônios mielinizados no tecido cerebral de camundongos

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

A imagem eletrônica de dispersão de Raman (epr-SRS) de corantes Raman semelhantes ao arco-íris é uma nova plataforma para imagens de proteínas à base de epítope altamente multiplexadas. Aqui, apresentamos um guia prático, incluindo preparação de anticorpos, coloração de amostras de tecido, montagem de microscópio SRS e imagem de tecido epr-SRS.

Imagem de tecido altamente multiplexado com corantes raman

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Este protocolo contém uma descrição detalhada de uma abordagem passo a passo para um modelo de camundongo crônico de janela craniana e embolia microvascular, otimizado para imagens in vivo por microscopia de dois fótons usando microsferas fluorescentes de poliestireno.

Modelo de camundongo com embolia microvascular para microscopia in vivo de dois fótons usando microesferas fluorescentes de poliestireno

Aprenda a implementar microscopia SRS de foco espectral para histologia de Raman estimulada em tempo real usando tecido cerebral de rato. Esta técnica sem marcadores acelera o diagnóstico tecidual sem processamento ou coloração.

Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Explorar mais vídeos