Explorando a interação biomolecular entre a acompanhante molecular Hsp90 e sua proteína cliente Kinase Cdc37 usando tecnologia de biosensão de efeito de campo

FEB é uma plataforma de detecção de interação ________ Este método oferece validação de interações conhecidas ou desconhecidas e uma maneira fácil de testar para potenciais inibidores das interações biomoleculares. A principal vantagem da FEB é seu software automatizado e fácil de usar que emissa ao usuário durante todo o experimento com plataforma de pipetação aberta e manual, permitindo que os usuários trabalhem com pouco ou mesmo nenhum treinamento.

A tecnologia FEB também oferece aplicações em diversos campos de fármacos, análise biomolecular de pequenas moléculas, peptídeos e proteínas, validação de medicamentos traduzindo a atividade biológica in vitro prontamente para a eficácia in vivo. Sendo um iniciante, você pode enfrentar desafios na escolha das concentrações de analito certos para otimizar o experimento para obter um valor KD confiável. Aconselhamos dar atenção ao processo de funcionalização do chip e à troca de buffer adequada.

Comece misturando volumes iguais de solução EDC e sulfo-NHS por pipetting para cima e para baixo. Coloque o chip biosensor fornecido pela empresa em uma placa de vidro Petri com uma tampa equipada. Todas as etapas de funcionalização envolvidas na ativação do chip são sugeridas para serem feitas dentro da placa de Petri.

Aplique 50 microliters de tampão MES de um molar no chip biosensor. Incubar por um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o buffer e aplique 50 microliters da solução EDC sulfo-NHS imediatamente ao chip do sensor.

Cubra a placa de Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução EDC sulfo-NHS do chip e aplique 50 microliters de buffer MES de um molar. Aspire o buffer MES e enxágue o chip duas vezes com 50 microliters de 1X PBS.

Aspire o PBS do chip e adicione a molécula alvo Hsp90. Cubra a placa de petri de vidro e incuba por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução contendo a molécula alvo e enxágue três vezes com 50 microliters de 1X PBS.

Aspire a solução 1X PBS do chip e adicione 50 microliters da solução de saciar uma. Cubra a placa de vidro Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspire a saciar uma solução do chip e adicionar 50 microliters da solução de saciar duas.

Cubra a placa de vidro Petri e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, aspire a solução de duas saídas do chip e enxágue o chip cinco vezes usando 50 microliters de 1X PBS deixando a última gotícula PBS no sensor. Prepare a série de diluição de analito para Cdc37 na faixa de concentração desejada.

Projete o experimento para incluir pelo menos oito concentrações diferentes de analito para obter uma constante de dissociação confiável, ou valor KD, e prepare essas diferentes diluições no mesmo buffer usado para calibração e proteína-alvo. Coloque o chip cuidadosamente no instrumento. Certifique-se de que o software está ligado e a luz LED fica verde.

Em seguida, pressione o módulo Executar Experimento no software automatizado e escolha 10 pontos com regeneração ou qualquer outro protocolo desejado. Preencha os detalhes como nome do operador, nome do experimento, data, buffer de regeneração, alvo imobilizado e o analito na solução. Pressione o botão Iniciar Experimento exibido no software e siga as instruções mostradas pelo software automatizado.

Para realizar a calibração do instrumento, aspire a solução PBS restante do chip e aplique 50 microliters do buffer de calibração. Pressione o botão Continuar e aguarde por cinco minutos até que a etapa de calibração esteja concluída. O software exibe o ponto final determinado para a etapa de calibração com um alarme de aviso para acompanhar.

Em seguida, realize uma associação de analitos aspirando o tampão de calibração do chip e aplicando 50 microliters da menor concentração de analito. Pressione o botão Continuar e aguarde por cinco minutos até que a etapa de associação esteja concluída. O software exibe o ponto final para a etapa de associação com um alarme de aviso para prosseguir.

Para realizar uma dissociação de analito, aspire a solução de analito do chip e aplique 50 microliters do tampão de dissociação. Pressione o botão continuar. Após a duração da etapa de dissociação, o software exibe o ponto final para a etapa de dissociação com um alarme de aviso.

Em seguida, realize a regeneração do chip aspirando a solução de dissociação do chip e aplicando 50 microliters do buffer de regeneração. Em seguida, pressione o botão Continuar. A etapa de regeneração normalmente leva aproximadamente 30 segundos para terminar.

Depois disso, o software exibe o ponto final para a etapa de regeneração com um alarme de aviso para acompanhar. Por fim, para lavar o chip, aspire a solução de regeneração do chip e aplique 50 microliters do tampão de lavagem. Aspire a solução do chip e repita isso cinco vezes.

Deixe a última gota do tampão de lavagem no chip. Em seguida, pressione o botão Continuar e aguarde por 30 segundos até que a duração da etapa de lavagem seja concluída no visor do software. Repita os passos para cada concentração de analito utilizada.

Os cinco passos da calibração, associação de analitos, dissociação, regeneração e lavagem cinco vezes constituem um ciclo. Pressione o botão Análise no software de análise automatizada no final do experimento. Uma janela de exibição contendo todos os pontos experimentais aparecerá.

Certifique-se de que as concentrações de analito utilizadas para o protocolo prescrito estão corretas. Pressione o botão Análise de execução para gerar o valor KD automaticamente. O software gera um gráfico de ajuste de colina, plotando as concentrações de analitos contra as respostas I correspondentes das quais a constante de dissociação no equilíbrio é calculada.

A proteína alvo Hsp90 foi imobilizada para o chip, e para o primeiro experimento, foram preparadas 10 concentrações da proteína analito Cdc37 variando de 25 nanomolars a 5.000 nanomolars. Os arquivos de dados gerados a partir do experimento um foi mostrado aqui. Os dados experimentais monitorados em tempo real são mostrados aqui.

O eixo Y corresponde à resposta I nas unidades biosensoras, e o eixo X corresponde aos diferentes pontos de tempo e concentrações do analito no experimento. A imagem gráfica mostrada aqui representa o gráfico hill fit gerado a partir do software de análise automatizada. O eixo Y corresponde à resposta I nas unidades biosensoras, e o eixo X corresponde às diferentes concentrações de analito no experimento.

A imagem gráfica aqui mostrada representa o enredo de associação gerado utilizando o software de análise estatística. O eixo Y corresponde à resposta I no final da fase de associação, e o eixo X corresponde às diferentes concentrações do analito Cdc37. No experimento dois, foi utilizado um conjunto diferente de concentrações que variam de 0,4 nanomolar a 200 nanomolar, e os arquivos de dados gerados são mostrados aqui.

As imagens gráficas representam o termograma ITC da interação Hsp90 e Cdc37. Aqui são mostradas as curvas correspondentes de evolução do calor obtidas devido às injeções consecutivas de Cdc37 em Hsp90 a 298,15 Kelvin. O poder diferencial usado aqui é uma função do tempo.

Os pontos de dados integrados nesta trama designam o calor normalizado correspondente versus a razão Mueller de Hsp90 a Cdc37. A abordagem de pipetação aberta utilizada aqui requer que o usuário tenha um domínio básico da pipetação manual, certificando-se de não tocar no biosensor com a ponta. A reprodutibilidade do tempo de etapa depende inteiramente do usuário.

Uma vez que o pesquisador caracterize uma interação entre duas biomoléculas, podemos realizar um experimento de triagem projetando potenciais inibidores ou moduladores visando a interação biomolecular específica usando o sistema FEB. Este procedimento pode ser usado para identificar, verificar e quantificar a interação conhecida e nova entre proteínas, bem como pequenas moléculas, incluindo drogas e peptídeos.