Entrevista: apresentação de antígenos glicolipídeos por CD1d eo potencial terapêutico das células NKT Ativação

Olá, meu nome é Mitchell Cronenberg e estou no Instituto La Jolla para Alergia e Imunologia. Sou, na verdade, o presidente e diretor científico, mas tenho um laboratório de pesquisa muito ativo e é sobre isso que vamos falar, é claro: uma das tecnologias que possuímos, os tetrameros CD1D. A maior parte do trabalho no meu laboratório diz respeito a linfócitos T reativos ao CD1D.

E essas células são únicas porque reconhecem glicolipídios em vez de peptídeos. E outro ramo do meu laboratório está voltado para um tema completamente diferente, o sistema imunológico mucosal e sua regulação. As moléculas CD1 são moléculas apresentadoras de antígenos, o que significa que elas ligam antígenos ou fragmentos de proteínas ou outras moléculas e os expõem para o reconhecimento por células T.

Agora existem realmente dois tipos diferentes de moléculas apresentadoras de antígenos. Há aquelas que retêm ou apresentam peptídeos, e há aquelas que retêm lipídios e glicolipídios. E as moléculas CD1 retêm lipídios e glicolipídios.

Essa é a função deles, e eles sustentam ou apresentam esses lipídios e glicolipídios para as células T. Na verdade, existem quatro tipos diferentes de moléculas CD1, CD1A, CD1B, CD1C e CD1D. E, na verdade, focamos no CD1D, e o CD1D em particular é provavelmente o melhor estudado, em parte porque existem modelos de camundongos. O CD1D apresenta glicolipídios a um tipo específico de célula T chamada célula T natural killer, um tipo incomum de glóbulo branco que possui características da resposta imune inata e adaptativa.

Os glicolipídios que são apresentados podem ser glicolipídios próprios, embora estes ainda não sejam muito bem caracterizados neste momento, ou podem ser glicolipídios microbianos. E os glicolipídios que sabemos que são apresentados vêm de duas fontes. Uma delas são as chamadas bactérias FMS, que provavelmente são as bactérias mais abundantes na biosfera.

Eles vivem no oceano, vivem em plantas, vivem no solo. No entanto, não deixam muitas pessoas doentes. Estamos muito acostumados a conviver com essas bactérias, suponho.

E a segunda categoria que conhecemos, um tipo diferente de glicolipídio chamado diglicerol contendo glicolipídios. Eles são encontrados em Borrelia burgdorferi, que causa a doença de Lyme, e provavelmente em muitos outros patógenos. E estamos apenas descobrindo agora quais são os diferentes tipos de bactérias que possuem esses glicolipídios.

Assim, temos os chamados lipídios sinal glicoconjugados do SMS e lipídios diglicerídeos do Borrelia e provavelmente muitos outros que são verdadeiramente patogênicos. Esses lipídios são carregados nas moléculas CD1D em células dendríticas, predominantemente, embora possam ser em linfócitos B, células ER no fígado e talvez outros tipos celulares. Essas moléculas CD1D passam pelos lisossomos e endossomos, onde provavelmente se ligam a esses lipídios, e então transportam o lipídio até a superfície celular para reconhecimento por células T, incluindo as células T Natural Killer que mencionei anteriormente.

Uma das coisas que acontece se você for exposto a uma bactéria que possui glicolipídios é que as células T NK são ativadas muito rapidamente. Já as células T convencionais, ou seja, as células T reativas a peptídeos, normalmente levam três ou quatro dias para iniciar uma resposta imune eficaz, especialmente se não tiverem experiência com o antígeno.

Em outras palavras, se eles forem ingênuos. Em contraste, as células T NK podem ser ativadas em questão de horas e começarão a produzir citocinas como interferon gama, importante para a eliminação bacteriana em um período de tempo muito, muito curto. Dessa forma, elas assemelham-se a aspectos da resposta imune inata do modelo.

A partir do estudo de antígenos modelo, sabemos que a CD1D entra nos endossomos tardios e lisossomos, compartimentos intracelulares muito ácidos onde os antígenos glicolipídicos são carregados na CD1, e de fato existem proteínas transportadoras especiais dentro das células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas, que auxiliam no carregamento dos lipídios na molécula CD1D. Com essas bactérias fona, bactérias borre e outras com as quais lidamos, estamos tratando de bactérias extracelulares. Assim, os antígenos lipídicos devem ser de alguma forma transportados para dentro da célula, provavelmente para um lisossomo, onde são carregados na molécula CD1.

E então há uma ativação imediata da célula NKT, e tudo isso deve ocorrer dentro de algumas horas nos seios sinusoides do fígado, no baço, talvez na medula óssea e em outros locais onde as células NKT são encontradas. A estrutura tetramérica é realmente fundamental para definir inequivocamente essas células T natural killer, que possuem essas propriedades inatas que as distinguem de outros linfócitos T. Os outros marcadores disponíveis são realmente muito ambíguos, mas os tetraméricos permitem identificar as células com base na especificidade de seus receptores de antígeno, que é o fato-chave que as define de certa forma. A produção de tetraméricos remonta a muito tempo.

Foi inventado por Mark Davis e John Alman, e a ideia era que o receptor de células T possui baixa afinidade, e se você deseja definir ou identificar células com base em sua especificidade, os peptídeos que elas reconhecem ou os complexos de peptídeos e moléculas apresentadoras de antígeno não têm afinidade suficiente, força de ligação suficiente para permitir a identificação da célula. Assim, o que Mark Davis e John Allman inventaram foi essa tecnologia de tetraméricos, um método de produzir tetraméricos em alguns casos OCRs da molécula apresentadora de antígeno mais a molécula que ela apresenta, o que basicamente aumenta a afinidade ou a força da interação. Dessa forma, é possível visualizar a célula específica para um peptídeo da gripe e uma determinada molécula apresentadora de antígeno ou qualquer outro antígeno de interesse.

Tecnologia muito importante porque permite, por exemplo, verificar a eficácia de um regime vacinal. O que fizemos, começando no final dos anos noventa, originalmente publiquei um artigo em 2000 que já foi citado cerca de 500 vezes até agora. O que fizemos foi simplesmente adaptar essa tecnologia aos lipídios.

Portanto, produzimos moléculas solúveis de CD1 e, por métodos que descreverei brevemente, fomos capazes de multimerizá-las, ou seja, agregá-las com glicolipídios específicos, e dessa forma utilizá-las como reagentes para ensaiar receptores específicos de células T. Em outras palavras, aqueles que reconhecem o glicolipídio de nosso interesse juntamente com o CD1D. Os tetrâmeros podem ser utilizados em qualquer situação em que se deseje analisar o número de células NKT, seu estado de ativação e sua função.

E em nosso laboratório, isso pode vir de qualquer um dentre diversos projetos diferentes. Por exemplo, se você quiser saber se um mutante específico e uma via de sinalização afetam o desenvolvimento de células T NK, podemos fazer isso com nossos tetraméricos, investigando o número de células T NK. E então existem outros marcadores, outras proteínas de superfície celular que podemos analisar para avaliar se as células T NK estão maduras ou se estão ativadas; usando os tetraméricos, após uma estimulação antigênica, também podemos verificar não apenas se estão ativadas, mas quais citocinas estão produzindo.

Assim, podemos combinar a coloração com tetrâmeros com, por exemplo, a coloração intracelular de citocinas e perguntar qual porcentagem das células NKT está produzindo interferon gama, qual porcentagem está produzindo IL-4, qual porcentagem está produzindo ambas, com citometria de fluxo de múltiplos parâmetros; podemos fazer várias perguntas sobre a produção de citocinas diretamente ex vivo por essas células. Também podemos realizar experimentos adicionais. Por exemplo, podemos usar os tetrâmeros para purificar células T NK para cultivo in vitro, a fim de investigar como elas interagem com outros tipos celulares, ou até mesmo para transferência para um animal receptor, por exemplo, que possa carecer de células T NK por razões genéticas.

Queremos restaurar essa função. Podemos fazer isso e investigar onde as células se alojam e como funcionam. Por fim, sei que, no caso de células NKT humanas, as pessoas já utilizaram realmente os tetraméricos para expandir linhagens celulares in vitro, cultivando células para fins analíticos e potencialmente até para fins terapêuticos.

Bem, utilizamos um sistema de expressão com vírus Bao para gerar tetrâmeros de CD1D. Assim, o processo começa com um construto de DNA comum contendo o promotor e a expressão da microglobulina BID e da cadeia pesada de CD1D. Portanto, esta molécula de CD1 é um heterodímero de duas polipeptídeos.

Assim, temos este sistema de expressão com dois promotores, e infectamos células de cultura de tecido de inseto com os vírus vao, cuidadosamente titulados conforme explicado pelo nosso canal. Em seguida, infectamos as células e coletamos do meio de cultura de tecido a proteína expressa pelas células. A cadeia pesada CD1D é modificada geneticamente, especialmente para a produção de tetrâmeros.

Há duas coisas, ou melhor, devo dizer três coisas que fazemos. Uma delas é remover o fragmento transmembrana. Assim, temos uma proteína solúvel sendo expressa.

Em segundo lugar, adicionamos uma etiqueta hexa-his para que a proteína possa ser purificada por cromatografia de íons metálicos. E em terceiro lugar, temos o que é chamado de sítio BirA para biotinilação enzimática. E esta é a inovação.

Foi muito importante quando Davis e Alman inventaram pela primeira vez a tecnologia de produção de tetrâmeros. Assim, após colhermos a proteína, ela é purificada por cromatografia em coluna de níquel na coluna de níquel. Às vezes, realizamos cromatografia de exclusão por tamanho após esse passo.

Em seguida, a proteína pode ser biotinilada enzimaticamente e incubada, e, uma vez biotinilada enzimaticamente, ao ser incubada com estreptavidina, formará tetrâmeros. Porém, a proteína solúvel de CD1 pode ser incubada basicamente durante a noite em uma solução contendo um glicolipídio de interesse. É muito importante que o glicolipídio não seja dissolvido em DMSO, pois isso é comum para glicolipídios como diluente ou solvente, já que a CD1 é muito sensível a esse composto.

Então, normalmente utilizamos um tampão que contém uma pequena quantidade de tween e PBS. E esse tampão é muito eficaz para dissolver a maioria dos nossos glicolipídios. E para o carregamento em CD1D, que parece ocorrer espontaneamente, utilizamos estreptavidina de qualquer um dentre diversos fabricantes.

E ele é conjugado a PE, ficoeritrina, eritrina ou corantes de ficocianina PC, qualquer um deles funciona muito bem e nos fornece uma coloração muito boa. Assim, no geral, o procedimento realmente não é muito diferente dos procedimentos bem caracterizados para a produção de tetraméricos de MHC Classe I, exceto pelo fato de que não utilizamos expressão bacteriana, mas sim expressão por vírus bacterianos, e é claro que utilizamos antígenos lipídicos em vez de peptídeos. Um ponto que devo enfatizar é que os humanos possuem células T NK e elas têm a mesma especificidade que as células T NK de camundongo.

Portanto, a especificidade existe há pelo menos 60 milhões de anos, desde que divergimos dos roedores, e, de fato, produzimos tetrâmeros humanos de CD1D pelas mesmas técnicas que você pode observar no vídeo que foi produzido aqui. No entanto, na realidade, as células T NK humanas funcionam muito bem com tetrâmeros de camundongo e vice-versa. Assim, não produzimos os tetrâmeros humanos com tanta frequência, simplesmente porque podemos usar nossos tetrâmeros de camundongo para pesquisas com humanos.

Portanto, existem muitos modelos de camundongos nos quais as células T NK demonstraram ser determinantes críticos do resultado da resposta imune. E isso abrange desde a resposta a cânceres e regulação de doenças autoimunes, até a eliminação de agentes infecciosos e mesmo o desenvolvimento de placas ateroscleróticas. Esse é um processo inflamatório crônico que ocorre nas artérias.

Existe alguma dúvida quanto à importância dessas células em humanos, onde são menos abundantes; há muitos relatos indicando que elas são alteradas em estados autoimunes, e também existem relatos de que são altamente enriquecidas nos pulmões de pacientes com asma. Embora esses relatos incluam um artigo publicado no England Journal of Medicine, há certa controvérsia sobre isso. No entanto, há diversos estudos em humanos sugerindo que essas células poderiam ser importantes.

Em termos de ensaios clínicos, a estimulação de células T NK foi testada em quatro ensaios de fase um com pacientes com câncer avançado. E há algumas evidências de eficácia, é claro, essas pessoas estão muito doentes e os estudos estão em andamento em diversos tipos de câncer. Além disso, há pesquisadores interessados em utilizar a terapia com células T NK também em doenças autoimunes, embora isso ainda não tenha saído do papel.

Os tetrâmeros podem desempenhar um papel nesses estudos principalmente no que diz respeito à análise do que aconteceu com as células T NKT após a terapia com agonistas. Assim, a ideia geralmente é usar agonistas glicolipídicos ou, em alguns casos, até antagonistas glicolipídicos, que outros grupos estão desenvolvendo, dependendo da resposta e da condição. E então avaliar o que aconteceu, o que ocorreu com as células T NK, o que normalmente se faria com tetrâmeros.

O outro uso potencial seria na expansão in vitro de células NKT humanas. É bastante viável e perfeitamente possível cultivar grandes quantidades de células NKT humanas in vitro por meio, por exemplo, da estimulação antigênica, que pode ser realizada com tetraméricos ou com células que contenham os glicolipídios adequados. Além do uso dos tetraméricos ou das células, é necessário adicionar citocina.

Mas sob essas condições, pode-se expandir grandes quantidades de células T NK humanas. E há pelo menos um grupo em Boston interessado nesse tipo de terapia, em oposição à terapia baseada em glicolipídios. Outra parte do meu laboratório está envolvida no estudo da imunidade mucosal.

A maioria dos imunologistas se concentra nos linfócitos ou glóbulos brancos presentes nos linfonodos e no baço. No entanto, talvez a maior parte dos linfócitos encontrados em nossos corpos esteja na mucosa intestinal, um local onde também temos provavelmente entre 10¹⁴ e 10¹⁵ bactérias. Assim, do ponto de vista microbiano, somos em grande parte estéreis, exceto no intestino.

E também no intestino temos uma grande quantidade de glóbulos brancos. Essas células possuem propriedades únicas e, na verdade, são relativamente pouco estudadas. Assim, realizamos algumas investigações de ciência básica dessas células.

Mas também estudamos um processo do que eu chamaria de desregulação imunológica, no intestino, que leva à doença inflamatória intestinal, que, essencialmente, são doenças mediadas pelo sistema imunológico do intestino delgado ou grosso, e são conhecidas como doença de Crohn ou colite ulcerativa. E embora realizemos alguns estudos com humanos, a maior parte do nosso trabalho é feita em modelos murinos. Temos o que considero modelos murinos muito bons para a desregulação do sistema imunológico da mucosa que leva a sintomas semelhantes aos da doença de Crohn.

Estamos estudando esse processo e também maneiras de interferir nesse processo, com a esperança final de desenvolver terapias melhores para pacientes que sofrem de doenças mediadas pelo sistema imunológico. Assim, em conclusão, podemos refletir um pouco sobre para onde a imunologia está caminhando nos próximos 10 anos, mais ou menos, e é realmente difícil prever o que acontecerá daqui a 10 anos. Por mais surpreendente que isso possa parecer.

Eu, eu acho que o sistema imunológico mucosal é uma das principais áreas não exploradas da imunologia, na verdade. Embora cada vez mais pessoas e cada vez mais grupos de destaque estejam demonstrando interesse em estudos de imunologia mucosal. Acho que outra área que terá impactos enormes é a genética, e particularmente a genética humana, à medida que avançamos — ou deveria dizer, progredimos — para o sequenciamento de 1.000 genomas humanos; será realmente possível realizar estudos em indivíduos e avaliar como a variabilidade do DNA afeta a resposta imune.

No momento, a maioria das melhores investigações sobre vias básicas envolve roedores. Roedores, particularmente camundongos, são realmente essenciais para os nossos estudos. Mas acredito que no futuro, quando considerarmos fenômenos autoimunes complexos ou outras coisas que possam estar ocorrendo em indivíduos, seremos capazes de fazer isso com base em polimorfismos genéticos humanos.

Seremos capazes de avaliar os polimorfismos e, em seguida, utilizar essas informações para tentar prever como isso afetará as respostas imunológicas e, eventualmente, avançar em direção ao que eu chamaria, e o que outros chamam, de terapias imunológicas personalizadas ou, de forma mais ampla, medicina personalizada. Assim, a genética terá um impacto tremendo. Já dispomos de excelentes ferramentas em genética de camundongos.

Podemos eliminar qualquer gene que desejarmos. Podemos interromper a expressão de genes em tipos celulares específicos. Podemos fazer coisas incríveis.

Mas acho que no futuro estaremos focando na compreensão da resposta imunológica e da imunidade do ponto de vista das respostas humanas.