Name: Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a precipitação de proteínas baseada em solventes para purificação robusta de proteoma antes da espectrometria de massa. Este método otimizado garante alta recuperação e pureza em poucos minutos.

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá. Os autores agradecem à Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canadá) e ao SPARC BioCentre (Análise Molecular) no Hospital para Crianças Doentes (Toronto, Canadá) por suas contribuições para a aquisição de dados de MS.

1. Considerações materiais e pré-preparação da amostra
<ol><li>Utilize apenas solventes de alta pureza (acetona, clorofórmio, metanol) (>99,5%) e produtos químicos, livres de excesso de umidade.</li>
	<li>Prepare as soluções de cloreto de sódio e sulfato de zinco (1 M) na água. NOTA: As soluções de sal podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, desde que estejam livres de contaminantes ou crescimento microbiano.</li>
	<li>Use o menor frasco de microcentrífugo de polipropileno (PP) suficiente para reter o volume necessário de amostra e solventes para induzir a precipitação.</li>
	<li>Certifique-se de que a concentração de SDS na amostra a ser precipitada não seja superior a 2% (c/v). Se o SDS for maior, dilui a amostra com água.</li>
	<li>Garanta uma concentração proteica entre 0,01 e 10 g/L para a eficiência ideal de precipitação. NOTA: A massa ideal para precipitação varia entre 1-100 μg de proteína.</li>
	<li>Certifique-se de que todos os solventes e soluções estejam livres de material particulado antes de usar. Realize uma filtragem (<0,5 μm) ou uma etapa de centrifugação (10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente) para remover partículas não resolvidas.</li>
	<li>Se for necessária a redução da ligação de dissulfeto e a alquilação, conduza essas etapas antes da precipitação proteica. O excesso de reagentes de redução e alquilação será removido através do processo de precipitação.</li>
	<li>Precipitar as proteínas selecionando e realizando um dos protocolos (etapas 2, 3, 4 ou 5).</li>
</ol>2. Precipitação de proteína rápida (à base de frasco) com acetona
<ol><li>Pipet 90 μL de proteína (livre de partículas) ou solução proteome em um tubo de microcentrifuge PP. Em seguida, adicione 10 μL de 1 M aquoso NaCl. NOTA: Se a força iônica do extrato de proteome já exceder 100 mM, não é necessário mais sal.</li>
	<li>Pipet 400 μL de acetona na amostra. Tampe o frasco e toque o frasco suavemente para combinar os solventes. Não é necessária uma mistura vigorosa. NOTA: O volume de proteína, sal e acetona pode ser aumentado desde que a razão relativa de cada um seja mantida.</li>
	<li>Deixe o frasco incubar à temperatura ambiente, sem ser perturbado, por um mínimo de 2 minutos. NOTA: Incubações mais longas, incluindo aquelas em temperatura reduzida (por exemplo, a precipitação convencional de acetona emprega precipitação durante a noite no congelador), podem resultar na formação de partículas proteicas agregadas maiores (visíveis) (Figura 1A), que geralmente não melhoram a recuperação total da proteína.</li>
	<li>Após a incubação, coloque amostras em uma centrífuga, observando a orientação do frasco. Gire por um mínimo de 2 min, a 10.000 x g ou mais a temperatura ambiente.</li>
	<li>Despreite o frasco e decante suavemente o supernaspetivo invertendo lentamente o frasco para um recipiente de lixo. Toque no frasco invertido em uma toalha de papel para retirar solvente residual do frasco. ATENÇÃO: Os solventes de resíduos devem ser retidos e descartados conforme protocolos apropriados.</li>
	<li>Para amostras contendo SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, tomando cuidado para não perturbar a pelota. NOTA: O passo 2.6 é opcional.<ol><li>Imediatamente centrifugar a amostra (10.000 x g ou superior por 1 min a temperatura ambiente), colocando o frasco no rotor na mesma orientação do giro inicial. Decante o solvente de lavagem como descrito na etapa 2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Deixe a amostra secar totalmente com a tampa aberta (~1 min). Recapitulando o frasco e proceda com solubilização de pelotas (etapa 6).</li>
</ol>3. Precipitação de peptídeos de baixo peso molecular (LMW) (ZnSO4 + acetona)
<ol><li>Dispense 54 μL de extrato de proteome a um frasco PP de 2 mL e, em seguida, adicione 6 μL de 1 M ZnSO4. NOTA: A recuperação ideal dos peptídeos LMW (≤5 kDa) é obtida adicionando acetona a 97% finais em volume. Assumindo um frasco PP de 2 mL, o volume máximo da amostra inicial é de 54 μL.</li>
	<li>Adicione 1940 μL de acetona a um volume final de 97%. Gire suavemente para misturar, e deixe ficar imperturbável no banco por um mínimo de 2 minutos.</li>
	<li>Centrífuga (10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente) e remova o supernatante invertendo o frasco e, em seguida, tocando o frasco em uma toalha de papel.</li>
	<li>Para amostras contendo SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, tomando cuidado para não perturbar a pelota. NOTA: O passo 3.4 é opcional.<ol><li>Imediatamente centrifufique a amostra conforme a etapa 3.3, colocando o frasco no rotor na mesma orientação do giro inicial. Decante o solvente de lavagem como descrito na etapa 3.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Re-solubilize a pelota seca resultante em um solvente aquoso com breve vórtice ou sônica (~5 min).</li>
</ol>4. Precipitação proteica por clorofórmio/metanol/água (CMW)
<ol><li>Dispense 100 μL da solução de proteína ou proteome em um frasco PP. Adicione 400 μL de metanol, seguido por 100 μL de clorofórmio. Tampe o frasco e o vórtice brevemente para misturar. NOTA: Para precipitação cmw, são preferidos frascos de 1,5 mL com fundo estreito (Figura 2A). ATENÇÃO: O solvente de clorofórmio deve ser manuseado em uma coifa de ventilação apropriada. Todos os solventes que entram em contato com o clorofórmio devem ser tratados como resíduos halogenados quando descartados.</li>
	<li>Dispense rapidamente 300 μL de água diretamente para o centro do frasco. Tampe o frasco. Deixe a amostra sentar-se no banco sem ser perturbada por 1 min. NOTA: A solução aparecerá imediatamente em branco nublado. Evite misturar o frasco após a adição de água.</li>
	<li>Coloque o frasco PP em uma centrífuga e gire por um mínimo de 5 min (10.000 x g ou mais a temperatura ambiente). NOTA: Uma vez centrifadas, duas camadas de solventes visíveis se formarão (camada superior = metanol/água; fundo = clorofórmio). Uma pelota de proteína sólida se forma na interface solvente (Figura 2A).</li>
	<li>Usando uma ponta de micropipette grande (1 mL) e segurando o frasco a ~45°, remova ~700 μL do solvente da camada superior a uma taxa uniforme.</li>
	<li>Use uma ponta micropipette menor (200 μL) para continuar removendo a camada de solvente superior do frasco inclinado de ~45°. Pipeta em um movimento contínuo até que a camada de solvente superior forme uma conta no frasco.</li>
	<li>Adicione 400 μL de metanol fresco ao frasco de amostra, sem perturbar a pelota, dispensando o solvente pelo lado do frasco.</li>
	<li>Tampe o frasco. Combine as camadas de solventes balançando suavemente o frasco para girar os solventes juntos. NOTA: É essencial evitar interromper a pelota. Não vórtice o frasco.</li>
	<li>Observando a orientação do frasco no rotor, centrífuga por um mínimo de 10 min (10.000 x g em temperatura ambiente). A pelota de proteína adere ao fundo do frasco (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque o frasco em 45°, com a pelota virada para baixo. Coloque a ponta da pipeta ao longo da borda superior do frasco e remova o supernascer com uma ponta de micropipette de 1 mL a uma velocidade lenta, mas contínua. Retenha ~20 μL de solvente no frasco.</li>
	<li>Lave a pelota de proteína para amostras contendo SDS, distribuindo lentamente 400 μL de metanol fresco. Não vórtice o frasco.<ol><li>Prossiga diretamente com centrifugação (10.000 x g por 2 min de temperatura), colocando o frasco no rotor com a mesma orientação do giro inicial.</li>
	</ol></li>
	<li>Remova o solvente, conforme a etapa 4.9. Deixe a amostra secar em uma fumehood até que o solvente residual evapore.</li>
	<li>Consulte os procedimentos de resolutização recomendados na etapa 6.</li>
</ol>5. Precipitação de proteína usando um cartucho de filtragem descartável
NOTA: Cada protocolo de precipitação baseado em solvente descrito nas etapas 2-5 pode ser realizado em um cartucho de filtragem e extração de dois estágios (ver Tabela de Materiais).
<ol><li>Com o plugue ligado ao cartucho de filtragem superior (Figura 3A), dispense o volume desejado do proteome, sal e solvente extraídos conforme descrito em uma das três opções abaixo.<ol><li>(Opção 1) Para precipitação proteica com acetona, combine 90 μL de proteína ou solução proteome, 10 μL de 1 M aquoso NaCl, e 400 μL de acetona. Incubar por um mínimo de 2 minutos no banco. NOTA: Um precipitado visível se desenvolverá para amostras concentradas de proteína (1 g/L) (Figura 3B).</li>
		<li>(Opção 2) Para precipitação de peptídeo LMW, combine 15 μL da amostra, 1,5 μL de 1 M ZnSO4 e 485 μL de acetona. Incubar por um mínimo de 2 minutos no banco. NOTA: Uma concentração de sal de 90 mM na amostra aquosa não afetará a recuperação em relação aos 100 mM recomendados na etapa 3.</li>
		<li>(Opção 3) Para precipitação cmw, adicione 50 μL de extrato de proteome, 200 μL de metanol e 50 μL de clorofórmio. Tampe o frasco e brevemente vórtice para combinar.<ol><li>Dispense rapidamente 150 μL de água diretamente para o centro do frasco. Incubar por 1 min no banco.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar por 2 min a 2.500 x g em temperatura ambiente com o plugue ainda ligado ao cartucho de filtragem.</li>
	<li>Inverta o cartucho e, em seguida, desaparafusar e remova o plugue da base do cartucho.</li>
	<li>Coloque o cartucho de filtragem em um frasco limpo e retorne à centrífuga. Gire por 3 min a 500 x g em temperatura ambiente. Descarte o solvente de fluxo do frasco inferior. NOTA: Se algum solvente permanecer no cartucho de filtragem superior, retorne à centrífuga e realize um giro adicional.</li>
	<li>Lave a pelota de proteína adicionando 400 μL de acetona ao cartucho de filtragem (para precipitação CMW, passo 5.1.3, adicione 400 μL de metanol).</li>
	<li>Centrifugar por 3 min a 500 x g em temperatura ambiente ou até que nenhum solvente permaneça no cartucho superior.</li>
	<li>Re-solubilize a pelota de precipitação conforme descrito na etapa 6.</li>
</ol>6. Resolubilização da pelota de proteína
<ol><li>Molhe a membrana na base do cartucho de filtragem dispensando 2-5 μL de isopropanol diretamente à membrana imediatamente antes dos protocolos de resolubilização descritos abaixo.</li>
	<li>Siga um dos seguintes métodos de resolubilização.<ol><li>(Opção 1) Adicione um mínimo de 20 μL de tampão aquoso contendo ≥2% de SDS ao cartucho de filtragem. Cap e vórtice vigorosamente (~1 min). Alternativamente, sonicato (>10 min) para dispersar a pelota de proteína.<ol><li>Aqueça a amostra a 95 °C por 5 minutos). Repita o passo de mistura após o aquecimento. NOTA: O tampão de carregamento de gel laemmli pode ressusolubilizar a pelota de proteína. No entanto, as amostras contendo SDS são incompatíveis com a digestão de trippsina e LC e MS de fase invertida.</li>
		</ol></li>
		<li>(Opção 2) Prepare uma solução de 80% (v/v) ácido fórmico na água. Prechill a solução ácida (-20 °C), bem como o cartucho de filtragem contendo proteína precipitada.<ol><li>Dispensar 50 μL de ácido fórmico frio no cartucho; tampa e vórtice para 30 s. Volte ao congelador (-20 °C) por 10 min.</li>
			<li>Vórtice o cartucho novamente para 30 s. Em seguida, repita o ciclo de refrigeração e mistura mais uma vez (10 min, -20 °C, vórtice de 30 s).</li>
			<li>Adicione água a 500 μL finais, diluindo o ácido fórmico para 8%. NOTA: O protocolo de ácido fórmico frio é incompatível com a digestão subsequente da trippsina, mas é compatível com LC-MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(Opção 3) Adicione 50 μL de ureia recém-preparada de 8 M em água ao cartucho de filtragem. Sonicate por 30 min.<ol><li>Deixe o cartucho incubar no banco por 1h (até durante a noite).</li>
			<li>Diluir a ureia de 8 M um mínimo de 5 vezes com água ou tampão apropriado. NOTA: Uma vez diluído, o protocolo de solubilização da ureia é compatível com a digestão de trippsina subsequente, bem como LC-MS.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Digestão de proteínas
<ol><li>Para análise de ESM de baixo para cima, sujeito as proteínas re-solubilizadas à digestão enzimática utilizando um dos dois métodos mencionados abaixo.<ol><li>(Opção 1) Para resolutização do ácido fórmico, reduza o volume inicial de 80% de ácido fórmico na etapa 6.2.2.1 a 25 μL. Na etapa 6.2.2.3, use 375 μL de água para diluir o ácido fórmico para 5% (v/v).</li>
		<li>Distribua pepsina no cartucho em uma relação proteica aproximada para enzima de 50:1. Com um plugue ligado ao cartucho de filtragem, incubar a amostra durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>(Opção 2) Para resolutização em ureia, garanta um pH entre 8 e 8,3 com a inclusão de 100 mM de Tris ou bicarbonato de amônio na etapa 6.2.3.2.<ol><li>Adicione trippsina em uma proteína aproximada à relação de massa enzimática de 50:1. Com um plugue ligado ao cartucho, incubar a amostra durante a noite em um banho de água morna a 37 °C.</li>
		<li>Termine a digestão acidificando a solução com 10% de TFA para um 1% final.</li>
	</ol></li>
	<li>Recupere a proteína digerida por pepsina ou trippsina removendo o plugue da base do filtro e centrifugando o cartucho contido dentro de um frasco limpo (2 min, 5000 x g, temperatura ambiente).</li>
</ol>8. Limpeza da SPE
NOTA: Para desalar amostras adicionais após a digestão ou troca de solventes, a amostra pode estar sujeita à limpeza de fase inversa, conforme descrito.
<ol><li>Prime um cartucho SPE (ver Tabela de Materiais) passando 300 μL de metanol (2 min, 400 x g) seguido por 300 μL de 5% acetonitrilo/0,1% de TFA (2 min, 400 x g).</li>
	<li>Conecte o cartucho SPE preparado à base do cartucho de filtragem contendo proteína resolubilizada ou digerida.</li>
	<li>Gire a proteína através do cartucho SPE (5 min, 800 x g em temperatura ambiente). Se o solvente permanecer no cartucho superior, devolva o cartucho à centrífuga e repita o giro. NOTA: Passar a amostra pelo cartucho SPE uma segunda vez pode melhorar a recuperação.</li>
	<li>Adicione 300 μL de acetonitrila/0,1% de TFA em água ao cartucho. Para lavar, flua através do cartucho SPE (2 min, 2000 x g). Descarte o fluxo.</li>
	<li>Para proteínas LMW ou peptídeos digeridos, elute a amostra fluindo 300 μL de 50% acetonitrilo /0,1% TFA (5 min, 2500 x g).</li>
	<li>Para proteínas intactas, siga o passo 8.5 com uma etapa de eluição adicional usando 300 μL de acetonitrilo/0,1% TFA. Combine os dois extratos resultantes. NOTA: O passo 8.6 é opcional.</li>
</ol>

O laboratório Doucette concebeu e patenteou o ProTrap XG empregado neste estudo. A AAD também é sócia-fundadora da Proteoform Scientific, que comercializou o cartucho de preparação da amostra.

A caracterização ótima de MS é alcançada quando o SDS residual é esgotado abaixo de 10 ppm. Enquanto abordagens alternativas, como FASP e digestão on-bead, oferecem esgotamento quantitativo de SDS com recuperação variável 31,32,33, o objetivo principal da precipitação é maximizar a pureza e o rendimento simultaneamente. Isso depende de isolar efetivamente o supernasce (contendo o SDS) sem perturbar a pelota de proteína. Com prec...

A análise proteome por espectrometria de massa tornou-se cada vez mais rigorosa, devido à sensibilidade, resolução, velocidade de varredura aprimorada e versatilidade dos instrumentos modernos de ESM. Os avanços em MS contribuem para maior eficiência de identificação de proteínas e uma quantitação mais precisa 1,2,3,4,5. Com a melhor instrumentação de ES, os pesquisadores exigem uma estratégia de preparação de amostra frontal correspondentemente consistente capaz de recuperação quantitativa de proteínas de alta pureza em tempo mínimo em todas as etapas do fluxo de trabalho 6,7,8,9,10,11 . Para refletir com precisão o estado proteome de um sistema biológico, as proteínas devem ser isoladas da matriz amostral nativa de forma eficiente e imparcial. Para isso, incluir um surfactante de desnaturação, como sulfato de dodecil de sódio (SDS), garante a extração eficiente de proteínas e solubilização12. No entanto, a SDS interfere fortemente na ionização de eletrospray, causando supressão severa de sinal de MS se não for devidamente eliminada13.
Várias estratégias de esgotamento do SDS estão disponíveis para análises proteome subsequentes, como a retenção de proteínas acima de um filtro de corte de peso molecular contido dentro de cartuchos de spin descartáveis 14,15,16. O método de preparação da amostra auxiliado por filtro (FASP) é favorecido, pois efetivamente esgota o SDS abaixo de 10 ppm, facilitando a MS ideal. No entanto, a recuperação de proteínas com FASP é variável, o que motivou a exploração de outras técnicas. Abordagens cromatográficas que capturam seletivamente proteína (ou surfactante) evoluíram em vários cartuchos convenientes ou formatos baseados em contas 17,18,19,20,21. Dadas essas estratégias simples e (idealmente) consistentes para a purificação de proteínas, a abordagem clássica da precipitação de proteínas com solventes orgânicos é muitas vezes negligenciada como uma abordagem promissora para o isolamento proteico. Embora a precipitação de solventes seja demonstrada para esgotar a SDS abaixo dos níveis críticos com sucesso, a recuperação de proteínas tem sido uma preocupação de longa data dessa abordagem. Vários grupos observaram um viés de recuperação de proteínas, com rendimentos inaceitáveis de baixa precipitação em função da concentração de proteínas, peso molecular e hidrofobitude22,23. Devido à diversidade de protocolos de precipitação relatados na literatura, foram desenvolvidas condições padronizadas de precipitação. Em 2013, Crowell et al. relataram pela primeira vez a dependência da força iônica na eficiência de precipitação das proteínas em 80% de acetona24. Para todas as proteínas examinadas, a adição de até 30 mM de cloreto de sódio mostrou-se essencial para maximizar os rendimentos (até 100% de recuperação). Mais recentemente, Nickerson et al. mostraram que a combinação de força iônica ainda maior (até 100 mM) com temperatura elevada (20 °C) durante a precipitação de acetona deu recuperação quase quantitativa em 2-5 min25. Observou-se uma ligeira queda na recuperação de proteínas de baixo peso molecular (LMW). Portanto, um relatório subsequente de Baghalabadi et al. demonstrou a recuperação bem sucedida de proteínas LMW e peptídeos (≤5 kDa) combinando sais específicos, particularmente sulfato de zinco, com um nível mais alto de solvente orgânico (97% acetona)26.
Embora o refino do protocolo de precipitação dê uma estratégia de purificação de proteínas mais confiável para a proteômica baseada em MS, o sucesso da precipitação convencional depende fortemente da técnica do usuário. O objetivo principal deste trabalho é apresentar uma estratégia robusta de precipitação que facilite o isolamento da pelota de proteína do supernanato contaminante. Um cartucho de filtragem descartável foi desenvolvido para eliminar a pipetação isolando a proteína agregada acima de um filtro de membrana PTFE porosa27. Os componentes que interferem em MS no supernante são efetivamente removidos em uma etapa de centrifugação de baixa velocidade. O cartucho de filtro descartável também oferece um cartucho SPE intercambiável, o que facilita a limpeza subsequente da amostra após a resolubilização e digestão de proteínas opcionais, à frente da espectrometria de massa.
Uma série de fluxos de trabalho recomendados de precipitação proteome são apresentados aqui, incluindo protocolos modificados de acetona e clorofórmio/metanol/água28 , em um formato convencional (à base de frasco) e um formato semi-automatizado em um cartucho descartável de filtragem e extração de dois estados. Destacam-se as recuperações de proteínas resultantes e a eficiência de esgotamento do SDS, juntamente com a cobertura proteome LC-MS/MS de baixo para cima, para demonstrar o resultado esperado de cada protocolo. São discutidos os benefícios práticos e as desvantagens associados a cada abordagem.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&le; 0,002 % aldeído</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Grau HPLC</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Amônio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>sólido</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>Grau em biologia molecular</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>Bromofenol sal azul de sódio</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>Clorofórmio</td></tr><tr><td>Ácido Fórmico</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Aditivo eluente para LC-MS</td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa Lumos de Fusão</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>para análise de mistura proteica padrão</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>Para biologia molecular, > 99%</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>Grau HPLC</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>Grau HPLC</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>Até 21.000 xG</td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>Fundo afilado</td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>Base arredondada</td></tr><tr><td>Dicas de Micropipeta&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (0.1-10 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>Ponta universal de pipeta, não estéril</td></tr><tr><td>Dicas de Micropipeta&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (1-200 & mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>Ponta universal de pipeta, não estéril</td></tr><tr><td>Dicas de Micropipeta&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (200-1000 & mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>Ponta universal de pipeta, não estéril</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>Pacote de Trio de Micropipetas</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>Pó liofilizado, &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; >3200 unidades/mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Proteoform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>50 unidades completas por caixa</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>Reagente ACS, >99%</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>Pó sólido</td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa TimsTOF Pro</td><td>Bruker</td><td></td><td>para análise do extrato de proteoma do fígado</td></tr><tr><td>Ácido Trifluoroacético</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Grau em biologia molecular</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>Do pâncreas bovino, tratado com TPCK</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>sólido</td></tr><tr><td>Água (deionizada)</td><td>Sistema de Purificação de Água Mini Sartorius Arium</td><td>76307-662</td><td>Tipo 1 ultrapuro (18,2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>Sulfato de Zinco</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>sólido</td></tr></tbody></table>

precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Embora os múltiplos avanços nos instrumentos de espectrometria de massa (MS) tenham melhorado a análise qualitativa e quantitativa do proteome, abordagens front-end mais confiáveis para isolar, enriquecer e processar proteínas à frente da ES são fundamentais para uma caracterização proteome bem-sucedida. Recuperação de proteínas baixas e inconsistentes e impurezas residuais, como surfactantes, são prejudiciais à análise de ESM. A precipitação proteica é muitas vezes considerada não confiável, demorada e tecnicamente desafiadora de executar em comparação com outras estratégias de preparação da amostra. Essas preocupações são superadas pela utilização de protocolos ideais de precipitação de proteínas. Para precipitação de acetona, a combinação de sais específicos, controle de temperatura, composição de solventes e tempo de precipitação é crítica, enquanto a eficiência da precipitação de clorofórmio/metanol/água depende da manipulação adequada da tubulação e do frasco. Alternativamente, esses protocolos de precipitação são simplificados e semi-automatizados dentro de um cartucho de spin descartável. Os resultados esperados da precipitação proteica à base de solventes no formato convencional e utilizando um cartucho descartável de filtragem e extração em dois estágios são ilustrados neste trabalho. Isso inclui a caracterização detalhada das misturas proteômicas por análise de LC-MS/MS de baixo para cima. O desempenho superior dos fluxos de trabalho baseados em SDS também é demonstrado em relação à proteína não contaminada.

A Figura 4 resume o esgotamento esperado do SDS após a precipitação facilitada por frascos ou cartuchos de proteínas em um cartucho de filtro descartável usando acetona. A incubação noturna convencional (-20 °C) em acetona é comparada com o protocolo de precipitação de acetona rápida à temperatura ambiente (passo 2), bem como a precipitação cmw (passo 4). A SDS residual foi quantificada pelo ensaio 29 das substâncias ativas azul-metileno (MBAS). Resumidamente, a amost...

O presente protocolo descreve a precipitação de proteínas à base de solventes em condições controladas para recuperação e purificação robustas e rápidas de amostras de proteome antes da espectrometria de massa.

Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Esses protocolos são projetados para maximizar a recuperação, bem como a pureza das proteínas através da precipitação à base de solventes. Vamos mostrar alguns truques para realizar precipitação em frascos, bem como uma abordagem semi-automatizada em um formato de cartucho de spin. Também otimizamos o protocolo de precipitação para sermos consistentes e rápidos.Todo o protocolo leva apenas alguns minutos. Esses protocolos demonstram que a precipitação de proteínas solventes é ideal para a preparação de amostras antes da espectrometria de massa. Os protocolos se encaixarão perfeitamente em baixo para cima, bem como saídas de trabalho pro.Demonstrando para nós hoje serão Ziheng Dang e Victoria Miller, cientista sênior da Proteoform Scientific em Halifax, Nova Scotia Pipette 90 microliters de solução de proteína livre de partículas em um tubo de micro centrífuga de polipropileno. Em seguida, adicione 10 microliters de um cloreto de sódio aquoso mole e 400 microliters de acetona na solução amostral, tampa e toque o frasco suavemente para combinar os solventes. Deixe o frasco incuba-lo.Temperatura ambiente imperturbável por um mínimo de dois minutos após a incubação, centrifugar as amostras observando a orientação do frasco e girar por um mínimo de dois minutos a 10.000 RCF ou mais alto à temperatura ambiente. Após a centrifugação, uma pelota branca visível é observada na parte inferior do tubo. Neste ponto, descape o tubo e decante o supernato em um recipiente de resíduos invertendo o tubo.Use uma toalha de papel para retirar qualquer solvente residual do frasco. Para SDS contendo amostras. Dispense cuidadosamente 400 microliters de acetona fresca sem perturbar a pelota.Imediatamente exime a amostra por um minuto a 10.000 vezes G ou mais a temperatura ambiente, colocando o frasco no rotor na mesma orientação do giro inicial. Desconta o solvente de lavagem como descrito anteriormente. Seque a amostra com a tampa aberta por aproximadamente um minuto.Em um capuz de fumaça, antes de uma solubilização de pelotas. Distribua 100 microliters da solução proteica em um frasco de polipropileno. No capô da fumaça, adicione 400 microliters de metanol seguido por 100 microliters de clorofórmio.Tampe o frasco e o vórtice brevemente para misturar. Distribua rapidamente 300 microliters de água diretamente no centro do frasco. Tampe o frasco e deixe-o sentar no topo do banco sem ser perturbado por um minuto, depois de colocar o frasco de polipropileno em uma centrífuga e gire-o por cinco minutos a 10.000 vezes G ou mais a temperatura ambiente.Observa-se que o frasco tenha duas camadas de solvente e uma pelota branca visível até o frasco a aproximadamente 45 graus. Remova aproximadamente 700 microliters do solvente da camada superior a uma taxa uniforme usando uma grande ponta de micro pipeta mililitro inicialmente e posteriormente com uma ponta de pipeta de 200 microliteres até formar uma conta no frasco. Adicione 400 microliters de metanol fresco ao frasco de amostra sem perturbar a pelota, distribuindo o solvente pelo lado do frasco.Cubra o frasco e misture as camadas de solventes balançando suavemente o frasco para rodar os solventes juntos. Observar a pelota de proteína branca observando a orientação do frasco na centrífuga do rotor por um mínimo de 10 minutos a 10.000 vezes G ou mais a temperatura ambiente. Angueta o frasco com a pelota virada para baixo.Coloque uma ponta de pipeta ao longo da borda superior do frasco e remova o supernatante com uma ponta de micro pipeta de um mililitro a uma taxa lenta, mas uniforme. Retendo aproximadamente 20 microliters de solvente. Deixe o solvente residual secar no capô da fumaça.Para precipitar a proteína. Utilizando um cartucho de filtragem descartável, conecte o plugue ao cartucho de filtragem superior. Combine 90 microliters de solução proteica 10 microliters de uma toupeira aquas, cloreto de sódio e 400 microliters de acetona.Incubar por um mínimo de dois minutos na parte superior do banco, centrifugar a amostra de proteína preparada com o plugue ainda ligado ao cartucho de filtragem por dois minutos a 2.500 vezes G.At temperatura ambiente, inverter o cartucho e desaparafusar e remover o plugue da base do cartucho. Coloque o cartucho de filtragem em uma centrífuga de frasco limpo a amostra de proteína por três minutos a 500 vezes G à temperatura ambiente. Descarte o fluxo através do solvente do frasco inferior.Lave a pelota de proteína adicionando 400 microliters de acetona ao cartucho de filtragem, centrífuga por três minutos a 500 vezes G à temperatura ambiente ou até que nenhum solvente permaneça no cartucho superior. Seguindo os protocolos de precipitação de proteínas previamente demonstrados. Solubilize a proteína molhando a membrana na base do cartucho de filtragem, distribuindo de dois a cinco microlitadores de propanol ISO diretamente à membrana imediatamente antes de prosseguir para o protocolo de ressubilização para ressubilização da pelota de proteína preparar 80% de volume por solução de volume de ácido fórmico na água.Pré-esfrie esta solução de ácido a menos 20 graus Celsius e o cartucho de filtragem contendo proteína precipitada. Distribua 50 microliters de ácido fórmico diluído a frio na tampa do cartucho resfriado e vórtice por 30 segundos. Devolva o cartucho de filtragem ao congelador a menos 20 graus Celsius por 10 minutos.Repita o vórtice anterior e as etapas de incubação. Adicione 450 microliters de água a um volume final de 500 microliters. Diluir o ácido fórmico para 8% Inverter o cartucho desaparafusado e remover o plugue da base do cartucho e fixar o cartucho SPE ao frasco.Gire a proteína através do cartucho SPE em uma centrífuga à temperatura ambiente por cinco minutos a 800 vezes G.Se o solvente permanecer no cartucho superior, devolva o cartucho à centrífuga e repita o giro. Enxágüe adicionando 300 microlitadores de 5%acetonitrila com 0,1% de TFA em água ao cartucho SPE, flua através do cartucho SPE por dois minutos a 2000 vezes G.Para proteínas de baixo peso molecular ou peptídeos digeridos elute a amostra fluindo 300 microliters. Um acetonitrilo de 50% com 0,1% de TFA por cinco minutos a 2,500 vezes G.Para proteínas intactas.Acompanhe com um passo adicional de elusão utilizando 300 microlitres de 75% de acetonitrilo com ácido ascético trifluoro de 0,1%. Combine os dois extratos resultantes. A figura compara o esgotamento do SDS após a base de frascos ou precipitação de proteínas em um cartucho de filtro descartável.Usando acetona com os protocolos convencionais rápidos e CMW. Todas as abordagens reduzem os SDS para permitir a análise ideal de espectrometria de massa. Este número mostra a recuperação quantitativa da proteína, seguindo a precipitação rápida de acetona e precipitação de CMW através da análise de página SDS de um teor celular total de levedura processada.A recuperação consistente foi obtida com todos os protocolos de precipitação. A precipitação em um cartucho de filtragem descartável elimina a necessidade de pipeta cuidadosamente SDS contendo supernanato, mantendo as proteínas agregadas acima de um filtro de membrana. Assim, não foram detectadas faixas visíveis nas frações supernantes em três réplicas independentes.A precipitação de proteína baseada em cartucho demonstra uma recuperação superior de uma amostra digerida de pepsina de plasma bovino em relação à precipitação à base de frascos. Diferenças mais significativas no rendimento são notadas no cartucho ao empregar cloreto de sódio enquanto a empregação de solvente de zinco resultou no maior rendimento. Esta figura quantifica a intensidade máxima do peptídeo de cada amostra de peptídeo com uma razão acima de uma refletindo uma maior abundância de peptídeos para amostras processadas nos cartuchos de filtro descartáveis.A figura compara o número de peptídeos identificados por proteína nas três preparações amostrais de réplica. Os coeficientes de correlação de 0,94 a 0,95 nestes gráficos demonstram a alta consistência da abordagem de preparação da amostra para análise de espectrometria de massa de baixo para cima. Então, uma vez que a pelota é formada você realmente quer evitar perturbá-la.Se você mantê-lo como uma pelota intacta você terá um rendimento maior. Por isso, certifique-se de não esquecer de lavar essa pelota com acetona extra. Isso é ter certeza de que estamos nos livrando do SDS mantendo nossa amostra o mais limpa possível e isso nos dá a melhor análise de espectrometria de massa.Então descobrimos que remover o excesso de solvente invertendo o é muito mais simples do que tentar pipeta a amostra. Você terá rendimentos mais consistentes assim. A realização da precipitação de acetona à temperatura ambiente resultou em uma recuperação mais consistente e mais rápida do que a precipitação tradicional no congelador.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Precipitação de proteína orgânica baseada em solventes para purificação robusta de proteome antes da espectrometria de massa

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