Name: Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de potencial de membrana baseados em fluorescência para estudo funcional de alto rendimento de canais iônicos endógenos em linhagens celulares epiteliais Calu-3 e Caco-2.

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Os autores gostariam de agradecer a Christopher Fladd e ao SPARC BioCentre do Hospital for Sick Children por sua ajuda na condução dos ensaios de potencial de membrana medindo CFTR e ENaC. Este trabalho foi apoiado pelo Programa CFIT com financiamento fornecido pela CF Canada e pela Sick Kids Foundation. Este trabalho foi financiado pelo Governo do Canadá através da Genome Canada e do Ontario Genomics Institute (OGI-148). O presente estudo foi financiado pelo Governo de Ontário. S.X. foi apoiado pela Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.

1. Revestimento e diferenciação celular
<ol><li>Cultura de células Calu-3 e Caco-2 em EMEM contendo 20% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina-estreptomicina (pen/strep) em frasco T-75.</li>
	<li>Quando as células atingirem 80-100% de confluência, aspirar o meio do frasco T-75.</li>
	<li>Lave suavemente as células uma vez com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Adicionar 2 ml de tripsina a 0,25%/EDTA a 0,1% pré-aquecido à monocamada celular e colocar o balão T-75 a 37 °C durante cerca de 5 minutos para permitir que as células se levantem da superfície do balão de cultura e se dissociam numa suspensão de célula única.</li>
	<li>Uma vez que as células são retiradas da superfície do frasco, neutralizar a reação com 8 mL de meio de cultura (passo 1.1) para um total de 10 mL de suspensão celular. NOTA: Agrupamentos celulares dissociados mecanicamente em uma suspensão de célula única com uma pipeta sorológica de 10 mL.</li>
	<li>Coloque as células em uma placa de 96 poços (~140.000-150.000 células/poço) ou em uma placa de 384 poços (~45.000-50.000 células/poço) com 30-40% de confluência.<ol><li>Para plaquear uma placa cheia de 96 poços, adicionar 1,5 mL da suspensão celular a 18,5 mL do meio de cultura em um tubo cônico de 50 mL. Após a mistura, adicionar 200 μL da suspensão celular a cada poço.</li>
		<li>Para plaquear uma placa cheia de 384 poços, adicione 1 mL da suspensão celular a 17 mL do meio de cultura em um tubo cônico de 50 mL. Após a mistura, adicionar 50 μL da suspensão celular a cada poço. NOTA: Certifique-se de que não há aglomerados de células, e células únicas estão distribuídas uniformemente em cada poço.</li>
	</ol></li>
	<li>Troque o meio a cada 2 dias após o revestimento. Se as células não atingirem confluência ao mesmo tempo entre diferentes poços, eliminar a placa e repetir o passo 1.5.</li>
	<li>Uma vez semeadas, aguarde que as células atinjam 100% de confluência dentro de 3-5 dias. Troque o meio 24 h antes dos estudos funcionais.</li>
</ol>2. Preparação da solução tampão de ensaio funcional CFTR
<ol><li>Preparar a solução tampão isenta de sódio e sem cloretos com os reagentes indicados no quadro 1.</li>
	<li>Adicionar os reagentes ao grau de cultura de tecidos, bidestiladoH 2 O (ddH2O). Deixe que os reagentes se dissolvam (num recipiente fechado para evitar a evaporação) agitando durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Quando a solução estiver estável, meça o pH. Se o pH da solução exceder 7,4, adicionar 1 M de solução de N-metil-D-glucamina (NMDG) gota a gota para ajustar o pH para 7,4. NOTA: Não ajuste o pH da solução com HCl porque a solução deve permanecer isenta de cloretos.</li>
	<li>Deixe a solução misturar por mais 30 min e meça a osmolaridade da solução.<ol><li>Reduzir a osmolaridade da solução tampão para uma faixa fisiológica de 300 ± 5 mOsm/kg.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar e armazenar a solução tampão em frascos estéreis. NOTA: A solução pode ser armazenada a 4 °C por até 6 meses. Se armazenado por mais de 6 meses, verifique o pH e a osmolaridade à temperatura ambiente antes do uso.</li>
</ol>3. Ensaio funcional CFTR
<ol><li>Dissolver o corante potencial de membrana na solução tampão isenta de sódio e sem cloretos (0,5 mg de corante/1 ml de solução tampão) e aquecê-lo a 37 °C. NOTA: Evite expor o pó do corante potencial de membrana à luz.</li>
	<li>Remover o meio de cultura das monocamadas celulares de Calu-3 ou Caco-2 e adicionar a solução contendo corante a cada poço (195 μL por poço para uma placa de 96 poços, 95 μL por poço para uma placa de 384 poços). NOTA: Até 112 μL podem ser adicionados por poço de placas de 384 poços.</li>
	<li>Deixar que as células carreguem o corante durante 35 minutos a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Mova as células, carregadas com solução de corante, para o leitor de placas de fluorescência. Tomar medidas de fluorescência a partir do fundo da placa, com excitação = 530 ± 5 nm, emissão = 560 ± 5 nm</li>
	<li>Comece fazendo leituras basais contínuas por 5 min em intervalos de 30 s.</li>
	<li>Adicionar 5 μL de uma solução de baixa concentração de forskolina ou DMSO a cada poço para uma concentração final de 1 μM de forskolina (1x). Faça uma leitura de estimulação por 20 min com medições em intervalos de 15 s.<ol><li>Para o formato de placa de 96 poços, prepare a solução de forskolina de baixa concentração (40 μM de forskolina (diluição 1:25)) diluindo 2 μL de 1 mM de solução estoque de forskolina (1.000x) ou DMSO em 48 μL de solução tampão isenta de sódio e sem cloreto. NOTA: A baixa concentração de 40 μM de forskolina é seguida por uma segunda diluição (diluição de 1:40) na próxima etapa para uma concentração final de 1 μM de forskolina.</li>
		<li>Para o formato de placa de 384 poços, prepare a solução de baixa concentração (20 μM de forskolina (diluição 1:50)) diluindo 1 μL de 1 mM (1.000x) de solução estoque de forskolina ou DMSO em 49 μL de solução tampão isenta de sódio e sem cloreto. NOTA: A forskolina de baixa concentração de 20 μM é seguida por uma segunda diluição (diluição de 1:20) na próxima etapa para uma concentração final de 1 μM de forskolina.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 5 μL de solução de baixa concentração de CFTRInh172 para uma concentração final de 10 μM CFTRInh172. Faça uma leitura de inibição por 15 min com medições em intervalos de 30 s.<ol><li>Para o formato de placa de 96 poços, prepare a solução CFTRInh172 de baixa concentração (400 μM CFTRInh172 (diluição 1:25)) diluindo 2 μL de uma solução-estoque CFTRInh172 (1.000x) de 10 mM em 48 μL de solução tampão isenta de sódio e sem cloreto. NOTA: A baixa concentração de 400 μM CFTRInh172 é seguida por uma segunda diluição (diluição de 1:40) na próxima etapa para uma concentração final de 10 μM CFTRInh172.</li>
		<li>Para o formato de placa de 384 poços, prepare a solução CFTRInh172 de baixa concentração (200 μM CFTRInh172 (diluição 1:50)) diluindo 1 μL da solução-estoque CFTRInh172 (1.000x) de 10 mM em 49 μL de solução tampão isenta de sódio e sem cloreto. NOTA: A baixa concentração de 200 μM CFTRInh172 é seguida por uma segunda diluição (diluição 1:20) na próxima etapa para uma concentração final de 10 μM CFTRInh172.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifique as medidas de intensidade de fluorescência de cada poço e exporte os valores como uma planilha em formato de coluna contendo poços individuais. Para calcular as mudanças induzidas por forskolina, divida as medidas de RFU (Unidades Relativas de Fluorescência) de cada poço da placa de 96 ou 384 poços pela última medida de intensidade de fluorescência da leitura basal e plote-as.<ol><li>Alternativamente, quantificar a resposta inibitória mediada por CFTRInh172 para confirmar melhor a especificidade da função do CFTR 12, pois o tratamento agudo com forskolina pode resultar em despolarização da membrana através da atividade de outros canais de cloreto, como SLC26A912.</li>
	</ol></li>
	<li>Meça as respostas de pico como a medida de intensidade máxima de fluorescência a partir da linha de base durante a estimulação com forskolin. Use essa medida ou área sob a curva para quantificar a resposta do CFTR.</li>
</ol>4. Preparação da solução tampão de ensaio funcional ENaC
<ol><li>Preparar a solução tampão com alto teor de sódio e sem cloretos com os reagentes indicados na Tabela 2.</li>
	<li>Quando a solução estiver estável, meça o pH. Se o pH da solução for inferior a 7,4, adicionar 1 solução de NaOH N gota a gota para ajustar o pH para 7,4. NOTA: Não ajuste o pH da solução com HCl porque a solução deve permanecer isenta de cloretos.</li>
	<li>Reduzir a osmolaridade da solução tampão para uma faixa fisiológica de 300 ± 5 mOsm/kg.</li>
	<li>Filtrar e conservar a solução-tampão em frascos estéreis a 4 °C durante um período máximo de 6 meses. NOTA: Se o armazenamento for superior a 6 meses, verifique o pH e a osmolaridade à temperatura ambiente antes da utilização.</li>
</ol>5. Ensaio funcional ENaC
<ol><li>Dissolver o corante potencial de membrana na solução tampão com alto teor de sódio e sem cloreto (0,5 mg de corante/1 mL de solução tampão) e aqueça-o a 37 °C. NOTA: Evite expor o pó do corante potencial de membrana à luz.</li>
	<li>Remover o meio de cultura das monocamadas celulares de Calu-3 ou Caco-2 e adicionar a solução contendo corante a cada poço (195 μL por poço para placas de 96 poços, 95 μL por poço para placas de 384 poços). NOTA: Evite expor a solução do corante à luz.</li>
	<li>Permitir que as células carreguem corante durante 35 minutos a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Mova as células, carregadas com solução de corante, para o leitor de placas de fluorescência. Leia as medidas de fluorescência a partir do fundo da placa, com excitação = 530 ± 5 nm, emissão = 560 ± 5 nm.</li>
	<li>Comece fazendo leituras basais contínuas por 5 min em intervalos de 30 s.</li>
	<li>Para inibir a função ENaC, adicione 5 μL de amilorida em solução de baixa concentração ou solução de baixa concentração DMSO dissolvida na solução tampão de cloreto zero de sódio para uma concentração final de amilorida de 10 μM.<ol><li>Para o formato de placa de 96 poços, preparar a solução de amilorida de amilorida de baixa concentração (400 μM de amilorida (diluição 1:25)) diluindo 2 μL de solução-mãe de amilorida (1.000x) a 10 mM em 48 μL de solução tampão isenta de cloretos com alto teor de sódio. NOTA: A amilorida de 400 μM de baixa concentração é seguida por uma segunda diluição (diluição de 1:40) no passo seguinte para uma concentração final de amilorida de 10 μM.</li>
		<li>Para o formato de placa de 384 poços, prepare a solução de amilorida de amilorida de baixa concentração (200 μM de amilorida (diluição 1:50)) adicionando 1 μL de solução-mãe de amilorida 10 mM (1.000x) em 49 μL de solução tampão isenta de cloreto e alto teor de sódio. NOTA: A amilorida de 200 μM de baixa concentração é seguida por uma segunda diluição (diluição de 1:20) no passo seguinte para uma concentração final de amilorida de 10 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Faça uma leitura de inibição por 60 min com medições em intervalos de 45 s.</li>
	<li>Repita a etapa 3.7 para análise de dados.</li>
	<li>Medir a resposta amilorida como a porcentagem de inibição da linha de base até o ponto de platô, aproximadamente 15-20 min após a adição de amilorida. Use essa diferença para quantificar a resposta ENaC.</li>
</ol>

<ol><li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Genomic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> NPJ Genomic Medicine. 2, 12(2017).</li>
<li>Xia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+analysis+of+CFTR+and+other+apically+localized+proteins+in+iPSC-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids.</a> Cells. 10 (12), 3419(2021).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+high-throughput+therapy+testing+on+iPSC-derived+lung+progenitor+cells+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Kidney+293+Cells%3A+a+vehicle+for+biopharmaceutical+manufacturing%2C+structural+biology%2C+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).</li>
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<li>Moore, P. J., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+as+a+therapeutic+target+for+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).</li>
<li>Stutts, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+as+a+cAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269 (5225), 847-850 (1995).</li>
<li>Merkert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+modulators+of+CFTR+activity+based+on+genetically+engineered+cystic+fibrosis+disease-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).</li>
<li>Bertrand, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CFTR+trafficking+mutation+F508del+inhibits+the+constitutive+activity+of+SLC26A9%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).</li>
<li>Frelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+and+its+analogs+as+tools+to+inhibit+Na%2B+transport+via+the+Na%2B+channel+the+Na%2B%2FH%2B+antiport+and+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger.</a> Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).</li>
<li>Di Paola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A14+is+a+genetic+modifier+of+cystic+fibrosis+that+regulates+Pseudomonas+aeruginosa+attachment+to+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells.</a> mBio. 8 (6), 02073(2017).</li>
<li>Schiavi, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+and+growth+abnormalities+are+associated+with+high-level+expression+of+CFTR+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells.</a> American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+ciliated+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 6504(2021).</li>
<li>Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PY+motif+of+ENaC%2C+mutated+in+Liddle+syndrome%2C+regulates+channel+internalization%2C+sorting+and+mobilization+from+subapical+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool.</a> Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Aqui, descrevemos métodos baseados em fluorescência para medir a atividade de CFTR e ENaC na linhagem celular de câncer colorretal epitelial, Caco-2, e na linhagem celular de câncer de pulmão epitelial humano, Calu-3. Estes ensaios de potencial de membrana em linhagens celulares epiteliais podem ser usados para confirmar a eficácia de compostos moduladores de pequenas moléculas, previamente identificados em sistemas de expressão heteróloga, antes da validação final in vitro em culturas epiteliais primárias derivadas de pacientes. 
É imperativo confirmar que as medidas acima são apropriadamente atribuídas ao canal de interesse. Por exemplo, a medida atribuída ao CFTR deve mostrar dependência da expressão da proteína CFTR e da força motriz eletroquímica do cloreto, que é modulada pela forskolina e pelo inibidor CFTRInh-172. Da mesma forma, as alterações no potencial de membrana causadas pela amilorida 10 μM podem ser atribuídas ao ENaC, se dependerem da expressão da proteína ENaC e de uma força motriz interna de sódio. Embora tenhamos confirmado essas propriedades do ENaC em células MDCK após transfecção com as três subunidades do ENaC 2, ainda não confirmamos formalmente que a resposta amilorida medida em células Caco-2 e Calu-3 é conferida pelo ENaC. Isso é particularmente importante, pois a amilorida pode modular a função do trocador sódio-prótons NHE3, além do ENaC13. Concebivelmente, a hiperpolarização induzida por amilorídeos observada neste ensaio poderia refletir parcialmente os efeitos indiretos da acidificação intracelular em outros canais. Para confirmar que a hiperpolarização induzida por amilorídeos medida por esse corante sensível ao potencial de membrana é conferida pelo ENaC nas linhagens celulares acima e em sistemas celulares mais complexos, como tecidos derivados de iPSC, estamos confirmando que essa atividade é perdida ao nocautear uma subunidade obrigatória do ENaC (beta) nessas linhagens.
O sucesso desses ensaios requer atenção a vários fatores. Primeiro, as culturas epiteliais devem ser confluentes e bem diferenciadas. Para a medição da função CFTR e ENaC, aproximadamente 145.000 células devem ser plaqueadas por poço em placas de 96 poços ou 45.000 células por poço em placas de 384 poços. Uma vez que as células epiteliais atingem a confluência (dentro de 3-4 dias do plaqueamento), permitir 2-5 dias de diferenciação. Esse tempo foi determinado previamente com base na expressão máxima da proteína CFTR por immunoblotting14. Similarmente, o tempo ótimo foi determinado para a expressão funcional de ENaC em ambas as linhagens celulares, Calu-3 e Caco-2. 
Monocamadas não confluentes ou supercrescimento celular leva a baixa reprodutibilidade entre réplicas técnicas. Nos casos em que as células de poços individuais não atingem a confluência ao mesmo tempo, essas placas devem ser descartadas. Além disso, leituras basais instáveis ou falta de respostas de estimulação podem ser um indício de má qualidade celular, que deve ser excluída da análise. Respostas reduzidas ao ativador do CFTR, forskolina, ou ao inibidor do ENaC, amilorida, poderiam potencialmente refletir o uso de células excessivamente passageiras15. Embora não seja um problema para as células Calu-3 e Caco-2, outras células ou tecidos podem não aderir bem às placas e podem exigir o pré-revestimento dos poços. Por exemplo, em estudos anteriores, culturas de colangiócitos 2D foram fixadas às placas usando revestimento de colágeno16. Alternativamente, a aderência dos tecidos intestinais 2D foi aumentada usando Poli-L-Lisina2. 
Além disso, ao testar a modulação de canais iônicos por pequenas moléculas usando um ensaio baseado em fluorescência, é fundamental que potenciais artefatos conferidos pelas propriedades fluorescentes das pequenas moléculas sejam abordados. Para confirmar a especificidade das respostas funcionais, ensaios de potencial de membrana podem ser validados por métodos eletrofisiológicos convencionais, como os estudos deUssing17. 
Depois de confirmar que a resposta detectada por corantes sensíveis ao potencial de membrana é especificamente conferida pelo canal de interesse, esses ensaios têm um enorme potencial para validar moduladores promissores de canais iônicos epiteliais em seu contexto celular relevante. Essa plataforma pode preencher a lacuna entre telas moduladoras de alto rendimento em sistemas de expressão heteróloga e medições bioelétricas demoradas em tecidos primários de difícil acesso.

Ensaios de alta atividade de proteínas de canais recombinantes baseados em fluorescência e alto rendimento têm sido altamente eficazes na identificação de moduladores de moléculas pequenas que têm o potencial de se tornarem terapias futuras 1,2,3,4. Um método comum de triagem de pequenas bibliotecas de moléculas para moduladores de canais iônicos é através da medição de mudanças no potencial de membrana. Tipicamente, essas telas são conduzidas utilizando canais recombinantes expressos de forma heterológica em linhagens celulares como as células HEK-2935,6,7.
No entanto, há necessidade de validação de "acertos" em tipos celulares relevantes. Propomos que uma tela secundária em linhagens celulares relevantes que expressem endogenamente os canais de interesse é desejável. Essa triagem secundária identificará os moduladores com maior probabilidade de serem eficazes em ensaios finais de validação que dependem de tecidos humanos primários menos acessíveis.
Há também a necessidade de sistemas de ensaio que tenham a flexibilidade de relatar a atividade de múltiplos alvos de canais iônicos no mesmo tipo de tecido. Por exemplo, há literatura substantiva publicada que apoia o conceito de que CFTR e ENaC interagem funcionalmente 8,9,10. Embora várias linhagens celulares epiteliais bem estudadas sejam conhecidas por expressar CFTR e ENaC, até o momento, as condições do ensaio para estudar ambas de maneira de alto rendimento não foram descritas.
Este ensaio de potencial de membrana baseado em fluorescência é versátil, pois emprega uma sonda química exógena para medir a função de CFTR e ENaC, ignorando a necessidade de sondas codificadas geneticamente11. Como prova de princípio, duas linhagens celulares epiteliais comumente usadas são estudadas como exemplos para destacar as etapas críticas necessárias para medir a atividade do canal de CFTR e ENaC.

<table><tbody><tr><td>Amiloride</td><td>Spectrum Chemical</td><td>TCI-A2599-5G</td><td>Dissolvido em DMSO e armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>CFTRInh-172</td><td>CF Foundation Therapeutics</td><td></td><td>Dissolvido em DMSO e armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>EMEM, 1xs</td><td>Wisent</td><td>320-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Dispositivos</td><td>Moleculares</td> de Corante de Potencial de Membrana <td>R8042</td><td>Armazenados a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3917</td><td>Dissolvido em DMSO e armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Lactona de ácido glucônico ou (D- (+) -ácido glucônico &delta;-lactona)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G4750</td><td>Armazenado em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>Armazenado em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Linha celular de adenocarcinoma brônquico humano (Calu-3) Linha celular</td> de adenocarcinoma colorretal epitelial humano <td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>(Caco-2)</td> <td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td></td></tr><tr><td>N-Metil-D-glucamina (NMDG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Armazenado em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Wisent</td><td>450-200-EL</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>Armazenado em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Gluconato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9005</td><td>Armazenado em temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

ensaio de potencial de membrana baseado em fluorescência para estudo funcional de alto rendimento de dois canais iônicos endógenos em duas linhagens celulares epiteliais

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Estudos baseados em fluorescência são adequados para ensaios de leitores de placas de alto rendimento de células em cultura. Eles têm sido comumente empregados para campanhas de descoberta de drogas visando proteínas de canais iônicos recombinantes superexpressas em células como as células HEK-293. No entanto, há uma ênfase crescente no uso de linhagens celulares relevantes para o tecido para estudar os efeitos de intervenções em pequenas moléculas. O protocolo a seguir descreve a adaptação de um ensaio de potencial de membrana baseado em fluorescência para o estudo de canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais. O ensaio de potencial de membrana detalha um ensaio de alto rendimento para a atividade do canal de cloreto do Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) em duas linhagens celulares epiteliais comumente estudadas, Caco-2 e Calu-3. Além disso, este trabalho descreve uma nova aplicação deste sistema para medir a atividade do Canal de Sódio Epitelial (ENaC) em um formato de alto rendimento nas mesmas linhagens celulares epiteliais. Juntos, esses ensaios baseados em fluorescência fornecem uma plataforma robusta e flexível para estudar moduladores de moléculas pequenas, visando dois canais epiteliais em um contexto celular relevante.

Para medir a atividade do canal CFTR, células bem diferenciadas e aderidas são incubadas em uma solução extracelular de cloreto zero contendo o corante sensível ao potencial de membrana. A função CFTR é consistentemente detectada como despolarização da membrana após estimulação com forskolina. O efluxo de cloreto é detectado como um aumento acentuado na fluorescência em comparação com o controle do veículo. O sinal de fluorescência é mantido até a adição do inibidor CFTR (CFTRInh172), levando a um rápido declínio na intensidade da fluorescência, como visto nas células Caco-2 (Figura 1A), e é reprodutível em ambas as células Caco-2 e Calu-3 (Figura 1B). A avaliação da atividade CFTR como a diferença na mudança máxima na fluorescência após forskolina ou o DMSO (veículo). Os pontos individuais variaram entre ± 3 desvios-padrão da média de estimulação com forskolina (pontos pretos) ou controle DMSO (pontos cinzas), o que correspondeu a um fator Z' de 0,586. Esse excelente escore indicou a reprodutibilidade deste ensaio (Figura 1C). No caso de haver uma pequena deriva na linha de base, o impacto da deriva pode ser minimizado extrapolando a linha de base ao longo do traço após a ativação até o ponto de adição do inibidor. A resposta pode ser quantificada como a área sob a curva, sendo o limite inferior definido pela linha extrapolada.
A atividade do ENaC também pode ser medida em células epiteliais confluentes das vias aéreas e colônicas cultivadas em placas de 96 poços. Em contraste com o ensaio de atividade do canal CFTR, essas células são submersas em uma solução com alto teor de sódio, permitindo a absorção de sódio através do ENaC. Com a adição aguda de amilorida, a captação de sódio é bloqueada e as células experimentam hiperpolarização relativa da membrana. Isso é demonstrado em células Caco-2 em baixas (10 μM) (Figura 2A) e altas (50 μM) de amilorida (Figura 2A,B) e em células Calu-3 com alta concentração de amilorida (50 μM) (Figura 2B). O ensaio ENaC foi expandido para um formato de placa de 384 poços e demonstrou grande reprodutibilidade na inibição do ENaC. Da mesma forma, os pontos individuais variaram entre ± 3 desvios-padrão da inibição média da amilorida (pontos pretos) ou do controle DMSO (pontos cinzas). A resposta do ENaC em células Calu-3 relatou um fator Z' de 0,629 com tratamento agudo com amilorida (50 μM) (Figura 2C), o que indica que esses parâmetros suportam triagem de alto rendimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig01.jpg"> Figura 1: Medição do canal CFTR como mudanças na despolarização da membrana em células Caco-2 e Calu-3. (A) Traço representativo da estimulação CFTR com forskolina (1 μM) e controle DMSO em células Caco-2. (B) Box and whisker plot da estimulação com forskolina em células Caco-2 e Calu-3 (**** P &lt; 0,0001, n &gt; 3 réplicas biológicas, n &gt; 3 réplicas técnicas). Réplicas biológicas são passagens independentes de linhagens celulares; As réplicas técnicas referem-se a poços independentes das placas multipoços. Box plot mostra o valor mediano; Os limites representam o IQR, com os bigodes definindo os valores mínimos e máximos. (C) Gráfico de Bland-Altman da resposta reprodutível do CFTR com estimulação com forskolina em comparação com o controle de DMSO em células Caco-2. Os pontos pretos representam mudanças absolutas máximas na fluorescência em resposta à estimulação com forskolina. Os pontos cinzentos representam mudanças na fluorescência em resposta ao controle do DMSO. Abreviações: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = dimetil sulfóxido; IIQ = intervalo interquartil; Fsk = forskolina; ΔF/F0 = mudança na fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig02.jpg"> Figura 2: Medidas de inibição do ENaC através da hiperpolarização da membrana nas células Caco-2 e Calu-3. (A) Traço representativo da inibição do ENaC com amilorida (10 μM) em relação ao controle de DMSO em células Caco-2. (B) Gráfico de inibição de amilorida em células Caco-2 e Calu-3 (**** P &lt; 0,0001, n &gt; 3 réplicas biológicas, n &gt; 3 réplicas técnicas). (C) Gráfico de Bland-Altman da resposta reprodutível do ENaC com inibição da amilorida em comparação com o controle de DMSO em células Calu-3. Os pontos pretos representam mudanças absolutas máximas na fluorescência em resposta à inibição da amilorida. Os pontos cinzentos representam mudanças na fluorescência em resposta ao controle do DMSO. Abreviações: ENaC = canal de sódio epitelial; DMSO = dimetil sulfóxido; Amil. = amilorida; ΔF/F0 = mudança na fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td>Concentração</td>
		</tr><tr><td>NMDG (N-metil-D-glucamina)</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Ácido Glucônico Lactona</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Gluconato de potássio</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Reagentes e suas concentrações correspondentes para o ensaio funcional CFTR com zero sódio e cloreto. Abreviação: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td>Concentração</td>
		</tr><tr><td>Gluconato de Sódio</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Gluconato de potássio</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Reagentes e suas concentrações correspondentes para tampão de ensaio funcional ENaC com alto teor de sódio e zero cloreto. Abreviação: ENaC = Canal de sódio (Na) epitelial.

Este protocolo descreve um método para o estudo de proteínas de membrana eletrogênicas através da medição de mudanças no potencial de membrana. Este ensaio fornece uma plataforma para a leitura funcional de múltiplos canais iônicos expressos endogenamente em linhagens celulares epiteliais.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...

Ensaios de potencial de membrana baseados em fluorescência fornecem métodos robustos para estudar os efeitos de moduladores em canais iônicos que são endogenamente expressos em células epiteliais. Como prova de conceito, estamos medindo a função de dois canais iônicos em linhagens celulares epiteliais bem conhecidas. Este ensaio é versátil, pois utiliza uma sonda química exógena para medir a função do canal iônico, ignorando assim a necessidade de sondas codificadas geneticamente.Esses ensaios de alto rendimento podem identificar e caracterizar os efeitos de moduladores de pequenas moléculas sobre os canais iônicos, que têm o potencial de avançar terapias para a fibrose cística. Para começar, cultivamos células Calu-3 e Caco-2 em frasco T75 contendo EMEM com 20% de soro fetal bovino e 1% de estreptomicina com penicilina. Aspirar o meio do frasco T75 após as células atingirem 80 a 100% de confluência.Lave suavemente as células com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, adicione 2 mililitros de tripsina 0,25% pré-aquecida, com EDTA a 0,1%, à monocamada celular. Colocar o balão a 37 graus Celsius durante aproximadamente cinco minutos.Nesta etapa, certifique-se de que as células se levantem da superfície do frasco e se dissociam na suspensão de célula única. Adicionar 8 mililitros de meio de cultura para neutralizar a reação. Quando as células atingirem 30 a 40% de confluência, adicionar 1,5 mililitros da suspensão celular a 18,5 mililitros de meio de cultura em tubo cônico e misturar.Adicione 200 microlitros desta suspensão de células a cada poço de uma placa de 96 poços para obter aproximadamente 140.000 células por poço. Para emplacar uma placa cheia de 384 poços, adicione 1 mililitro da suspensão celular a 17 mililitros do meio de cultura em um tubo cônico para obter aproximadamente 50.000 células por poço. Após a mistura, adicione 50 microlitros da suspensão celular a cada poço.Troque o meio a cada dois dias e garanta que as células atinjam 100% de confluência dentro de três a cinco dias em todos os poços simultaneamente. Trocar o meio 24 horas antes dos estudos funcionais. Primeiro, prepare a solução tampão isenta de sódio e sem cloretos com os reagentes listados no protocolo de texto.Adicionar os reagentes à água bidestilada de grau de cultura de tecidos. Deixe que os reagentes se dissolvam agitando durante a noite à temperatura ambiente. Depois que a solução estiver estável, ajuste o pH para 7,4 adicionando solução NMDG 1 molar gota a gota.Misture durante 30 minutos e ajuste a osmolaridade da solução para um intervalo de 300 milimoles para mais ou para menos por quilograma. Filtrar e armazenar a solução tampão em frascos estéreis. Em seguida, dissolva 0,5 miligramas do corante potencial de membrana em 1 mililitro de tampão isento de sódio e sem cloreto e aqueça a solução a 37 graus Celsius.Remover o meio de cultura das monocamadas celulares Calu-3 e Caco-2. Adicione 195 microlitros da solução de corante por poço para a placa de 96 poços e 95 microlitros por poço para uma placa de 384 poços. Deixe as células carregarem o corante por 35 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Em seguida, faça medições de fluorescência com excitação a 530 nanômetros e emissão a 560 nanômetros. Inicialmente, faça leituras basais contínuas por cinco minutos em intervalos de 30 segundos. Em seguida, adicione 5 microlitros de solução de Forskolina micromolar 400 a cada poço da placa de 96 poços, para obter uma concentração final de Forskolina de um micromolar.Para a placa de 384 poços, adicione cinco microlitros de solução de Forskolina 20 micromolares. Faça uma avaliação de estimulação por 20 minutos com medições em intervalos de 15 segundos. Em seguida, adicione 5 microlitros de uma solução de 400 micromolares de inibidor de CFTR à placa de 96 poços, para obter uma concentração final de 10 micromolares.À placa de 384 poços, adicione 5 microlitros de inibidor de CFTR micromolar 200. Faça uma leitura de inibição por 15 minutos com medições em intervalos de 30 segundos. Quantifique as medidas de intensidade de fluorescência de cada poço e exporte os valores como uma planilha.em formato de coluna, contendo poços individuais. Para calcular as mudanças induzidas por Forskolina, divida as medidas de unidade de fluorescência relativa de cada poço da placa de 96 poços pela última medida de intensidade de fluorescência da leitura basal e plote-as. Meça as respostas de pico como a intensidade máxima de fluorescência medida a partir da linha de base durante a estimulação com Forskolin.Use essa medida, ou área sob a curva, para quantificar a resposta CFTR. A função CFTR foi detectada como despolarização da membrana após estimulação com forskolina em células Caco-2. O efluxo de flúor foi detectado como um aumento acentuado na fluorescência em comparação com o DMSO como controle do veículo.Após a estimulação com forskolin, o sinal fluorescente foi mantido até a adição do inibidor CFTR, após o que houve um rápido declínio na intensidade da fluorescência. Este fenômeno foi reprodutível em células Caco-2 e Calu-3. A atividade do CFTR foi calculada como a diferença na mudança máxima na fluorescência após a estimulação com Forskolin ou DMSO.Os pontos individuais variaram entre mais ou menos 3 desvios-padrão da média no caso da estimulação com Forskolina e do controle com DMSO, indicando a reprodutibilidade do ensaio. Para confirmar a especificidade das respostas funcionais, esses ensaios de potencial de membrana podem ser validados usando métodos eletrofisiológicos convencionais, como a câmara de Ussing. Esta plataforma é capaz de preencher a lacuna entre telas moduladoras de alto rendimento e sistemas de expressão heteróloga e medições bioelétricas demoradas em tecidos primários de difícil acesso.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

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