Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

Ensaios de potencial de membrana baseados em fluorescência fornecem métodos robustos para estudar os efeitos de moduladores em canais iônicos que são endogenamente expressos em células epiteliais. Como prova de conceito, estamos medindo a função de dois canais iônicos em linhagens celulares epiteliais bem conhecidas. Este ensaio é versátil, pois utiliza uma sonda química exógena para medir a função do canal iônico, ignorando assim a necessidade de sondas codificadas geneticamente.

Esses ensaios de alto rendimento podem identificar e caracterizar os efeitos de moduladores de pequenas moléculas sobre os canais iônicos, que têm o potencial de avançar terapias para a fibrose cística. Para começar, cultivamos células Calu-3 e Caco-2 em frasco T75 contendo EMEM com 20% de soro fetal bovino e 1% de estreptomicina com penicilina. Aspirar o meio do frasco T75 após as células atingirem 80 a 100% de confluência.

Lave suavemente as células com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, adicione 2 mililitros de tripsina 0,25% pré-aquecida, com EDTA a 0,1%, à monocamada celular. Colocar o balão a 37 graus Celsius durante aproximadamente cinco minutos.

Nesta etapa, certifique-se de que as células se levantem da superfície do frasco e se dissociam na suspensão de célula única. Adicionar 8 mililitros de meio de cultura para neutralizar a reação. Quando as células atingirem 30 a 40% de confluência, adicionar 1,5 mililitros da suspensão celular a 18,5 mililitros de meio de cultura em tubo cônico e misturar.

Adicione 200 microlitros desta suspensão de células a cada poço de uma placa de 96 poços para obter aproximadamente 140.000 células por poço. Para emplacar uma placa cheia de 384 poços, adicione 1 mililitro da suspensão celular a 17 mililitros do meio de cultura em um tubo cônico para obter aproximadamente 50.000 células por poço. Após a mistura, adicione 50 microlitros da suspensão celular a cada poço.

Troque o meio a cada dois dias e garanta que as células atinjam 100% de confluência dentro de três a cinco dias em todos os poços simultaneamente. Trocar o meio 24 horas antes dos estudos funcionais. Primeiro, prepare a solução tampão isenta de sódio e sem cloretos com os reagentes listados no protocolo de texto.

Adicionar os reagentes à água bidestilada de grau de cultura de tecidos. Deixe que os reagentes se dissolvam agitando durante a noite à temperatura ambiente. Depois que a solução estiver estável, ajuste o pH para 7,4 adicionando solução NMDG 1 molar gota a gota.

Misture durante 30 minutos e ajuste a osmolaridade da solução para um intervalo de 300 milimoles para mais ou para menos por quilograma. Filtrar e armazenar a solução tampão em frascos estéreis. Em seguida, dissolva 0,5 miligramas do corante potencial de membrana em 1 mililitro de tampão isento de sódio e sem cloreto e aqueça a solução a 37 graus Celsius.

Remover o meio de cultura das monocamadas celulares Calu-3 e Caco-2. Adicione 195 microlitros da solução de corante por poço para a placa de 96 poços e 95 microlitros por poço para uma placa de 384 poços. Deixe as células carregarem o corante por 35 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, faça medições de fluorescência com excitação a 530 nanômetros e emissão a 560 nanômetros. Inicialmente, faça leituras basais contínuas por cinco minutos em intervalos de 30 segundos. Em seguida, adicione 5 microlitros de solução de Forskolina micromolar 400 a cada poço da placa de 96 poços, para obter uma concentração final de Forskolina de um micromolar.

Para a placa de 384 poços, adicione cinco microlitros de solução de Forskolina 20 micromolares. Faça uma avaliação de estimulação por 20 minutos com medições em intervalos de 15 segundos. Em seguida, adicione 5 microlitros de uma solução de 400 micromolares de inibidor de CFTR à placa de 96 poços, para obter uma concentração final de 10 micromolares.

À placa de 384 poços, adicione 5 microlitros de inibidor de CFTR micromolar 200. Faça uma leitura de inibição por 15 minutos com medições em intervalos de 30 segundos. Quantifique as medidas de intensidade de fluorescência de cada poço e exporte os valores como uma planilha.

em formato de coluna, contendo poços individuais. Para calcular as mudanças induzidas por Forskolina, divida as medidas de unidade de fluorescência relativa de cada poço da placa de 96 poços pela última medida de intensidade de fluorescência da leitura basal e plote-as. Meça as respostas de pico como a intensidade máxima de fluorescência medida a partir da linha de base durante a estimulação com Forskolin.

Use essa medida, ou área sob a curva, para quantificar a resposta CFTR. A função CFTR foi detectada como despolarização da membrana após estimulação com forskolina em células Caco-2. O efluxo de flúor foi detectado como um aumento acentuado na fluorescência em comparação com o DMSO como controle do veículo.

Após a estimulação com forskolin, o sinal fluorescente foi mantido até a adição do inibidor CFTR, após o que houve um rápido declínio na intensidade da fluorescência. Este fenômeno foi reprodutível em células Caco-2 e Calu-3. A atividade do CFTR foi calculada como a diferença na mudança máxima na fluorescência após a estimulação com Forskolin ou DMSO.

Os pontos individuais variaram entre mais ou menos 3 desvios-padrão da média no caso da estimulação com Forskolina e do controle com DMSO, indicando a reprodutibilidade do ensaio. Para confirmar a especificidade das respostas funcionais, esses ensaios de potencial de membrana podem ser validados usando métodos eletrofisiológicos convencionais, como a câmara de Ussing. Esta plataforma é capaz de preencher a lacuna entre telas moduladoras de alto rendimento e sistemas de expressão heteróloga e medições bioelétricas demoradas em tecidos primários de difícil acesso.