Name: Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a medir a oxidação de substratos energéticos in vitro usando armadilhas de 14CO2 em células ósseas. Este método acessível e escalável auxilia pesquisadores a investigar distúrbios metabólicos.

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O trabalho foi apoiado em parte pela concessão do NIH R01 AR060456 (FL). Agradecemos ao Dr. Michael Robinson e Elizabeth Krizman (Hospital Infantil da Filadélfia) por sua generosa ajuda com o contador de cintilação.

O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia por um comitê de segurança designado em cada instituição. Os RAMs usados neste protocolo foram aprovados pela Environmental Health &amp; Radiation Safety (EHRS) na Universidade da Pensilvânia. O uso de animais requer aprovação prévia do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) na instituição de origem. O estudo seguinte foi aprovado pela IACUC no Hospital Infantil da Filadélfia.
1. Preparação de soluções de estoque para substratos rotulados em C
<ol><li>Faça 4 mM de solução de estoque de soro bovino (BSA) misturando 11 g de BSA e 33,1 mL de soro tamponado de Dulbecco (DPBS) e sacudindo-o suavemente à temperatura ambiente por ~3 h até que a BSA esteja totalmente dissolvida. Aqueça a solução de estoque BSA em um banho de água de 70 °C antes de usar.</li>
	<li>Ar seco 50 μCi 14C-oleate (50 μCi/μmol no etanol) no frasco com a tampa desligada por 8h em uma capa de trabalho RAM designada. Adicione 312,5 μL de H2O e depois 3,5 mgs (11,5 μmol) de oleato de sódio. Homogeneizar.</li>
	<li>Aqueça a solução resultante a 70 °C em banho-maria. Adicione 0,9375 mL da solução de estoque BSA pré-armada para produzir uma solução de estoque de oleato quente de 10 mM (contendo uma razão de 1:11,5 de 14C-oleate a oleato não rotulado). Aliquot a solução de estoque e armazene-a a -20 °C para uso a longo prazo.</li>
	<li>Use 14C-glicose e 14C-glutamina diretamente após o descongelamento.</li>
</ol>2. Preparação de meio contendo substratos rotulados em C
NOTA: Para garantir concentrações confiáveis de substratos de energia na mídia, as mídias personalizadas devem ser usadas com substratos frescos adicionados pouco antes do uso. Aqui, é utilizado um meio essencial mínimo personalizado (MEMα) sem glicose, piruvato, glutamina, vermelho fenol ou bicarbonato de sódio. No entanto, um meio ideal deve ser determinado para cada tipo de célula.
<ol><li>Reconstituir 8,67 g do pó médio em 1 L de água purificada. Adicione 2,2 g de bicarbonato de sódio para obter um pH de 7,4 e filtrar a solução usando filtragem de vácuo de 0,22 μm.</li>
	<li>Adicione ingredientes frescos para obter o meio completo (cMEMα) com concentrações finais de glicose de 5,5 mM, glutamina de 2 mM, piruvato de 1 mM e 10% de soro bovino fetal (FBS). Suplementar cMEMα com L-carnitina de 100 mM e HEPES de 10 μM para facilitar a oxidação de ácidos graxos.</li>
	<li>Imediatamente antes do uso, adicione substratos com 14C rotulados ao cMEMα recém-preparado para fazer mídia quente. Para fazer o meio quente oleato, adicione a solução de estoque de oleato quente de 10 mM ao cMEMα para uma concentração final de 100 μM oleate (diluição de 1:100, radioatividade final 0,4 μCi/mL). NOTA: O estoque de oleato quente de 10 mM contendo uma proporção de 1:11,5 de oleato quente:frio (ver passo 1.3) é usado para atingir um nível fisiológico de 100 μM total oleato na mídia, minimizando a quantidade de material radioativo.</li>
	<li>Faça 10 mM de estoque de oleato sem rótulo adicionando 24,36 mg de oleato de sódio a 2 mL de H2O em um banho de água a 70 °C por ~20 min até dissolver completamente antes de misturar rapidamente com 6 mL da solução de estoque BSA de 4 mM pré-rebocada a 70 °C. Transfira para um banho de água de 37 °C por 1h e filtre através de um filtro de 0,22 μm. Alíquota e armazenamento a -20 °C para uso a longo prazo.</li>
	<li>Para tornar a glicose média quente, adicione 14C-glicose a uma concentração final de 1,333 μM (diluição de 1:4.125, radioatividade final 0,4 μCi/mL). Para fazer glutamina meio quente, adicione 14C-glutamina à concentração final de 2 μM (diluição de 1:1.000, radioatividade final 0,4 μCi/mL).</li>
	<li>Suplemente o meio quente de glicose e glutamina com uma solução de estoque de 10 mM de oleato não rotulado a partir da etapa 2.4 para alcançar a concentração final de 100 μM oleato, o mesmo que no meio quente oleato.</li>
</ol>3. Preparação de células
NOTA: Preosteoblasts calvariais e macrófagos de medula óssea são usados como exemplos aqui. Os usuários devem preparar seu tipo de escolha celular de acordo com os protocolos apropriados. Otimize a concentração de colagenase II para ser usada para digestão em experimentos piloto, pois a atividade enzimática pode variar entre diferentes lotes.
<ol><li>Isolamento e cultura de preosteoblasts calvariais<ol>
<li>Sacrifique filhotes pós-natal 3-5 (P3-5) por decapitação e transfira-os para DPBS gelado contendo Penicilina-Streptomycin (P/S).</li>
		<li>Exponha a calvária removendo a pele e o tecido mole. Recolher a região média cortando os tecidos circundantes de trás para frente na DPBS (Figura 1A). Coce as superfícies internas e externas da calvária suavemente usando pinças para ajudar a liberar as células após a digestão subsequente.</li>
		<li>Prepare uma solução de 2 mg/mL e uma solução de 4 mg/mL de Collagenase tipo II em DPBS e filtre cada solução com um filtro fresco de 0,22 μm. Digerir a calvaria limpa primeiro com a solução de colagenase de 2 mg/mL por 15 minutos e descartar a solução de digestão. Digerir as amostras limpas em 4 mg/mL solução de colagenase 3 vezes por 15 minutos cada vez, agrupando e salvando a solução de digestão.</li>
		<li>Filtre a solução de digestão através de cepas de células de 70 μm e centrifugar o filtrado a 300 × g por 5 min. Resuspende a pelota de célula em cMEMα (ver passo 2.2) contendo 10% de FBS e P/S.</li>
		<li>Conte e semee as células a 4 × 104 células/cm2 em placas de 10 cm. Cultura as células em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 durante 3 dias.</li>
		<li>Dissociar as células a 37 °C com 0,25% de trypsin-EDTA. Conte e semee as células em placas de cultura celular de 24 poços com cMEMα contendo 10% de FBS e P/S a 7,5 × 105/cm2. Semente pelo menos 4 poços por célula tipo por substrato e pelo menos três poços extras para cada tipo de célula para contagem celular antes do ensaio.</li>
		<li>Cultuize as células a 37 °C durante a noite antes que os ensaios de oxidação do substrato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento e cultura de BMMs NOTA: A cultura dos BMMs requer fator estimulante para colônias de macrófagos (M-CSF), que pode ser adquirido comercialmente como uma proteína recombinante. O meio condicionado da linha celular CMG14-12 projetado para expressar M-CSF é uma alternativa econômica usada aqui13.<ol>
<li>Coletar fêmures e tíbias de camundongos de 8 semanas de idade depois de remover os tecidos musculares e conjuntivos. Corte e descarte as duas extremidades dos ossos com uma tesoura afiada.</li>
		<li>Retire a medula óssea de um fêmur e uma tíbia em uma placa de Petri de 10 cm com uma seringa equipada com uma agulha de 23 G contendo 15 mL de cMEMα com 10% de FBS, P/S e 10% cmg14-12 meio condicionado (meio BMM). Cultume as células da placa de Petri em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2.</li>
		<li>Após 3 dias, descarte os meios de cultura e enxágue com DPBS. Dissociar as células anexadas a 37 °C com 0,25% de trypsin-EDTA por 5 min. Centrifugar e resuspensar a pelota celular no meio BMM.</li>
		<li>Conte e semee as células em placas de cultura celular de 24 poços a 7,5 × 105/cm2 da mesma forma descrita em 3.1.6. Cultura a 37 °C durante a noite no meio BMM antes de iniciar os ensaios.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ensaio de oxidação de substrato com armadilha de CO2
NOTA: Uma densidade de semeadura adequada deve ser determinada para que cada tipo de célula atinja 80-90% de confluência antes do início do ensaio. Note que a densidade celular pode afetar o estado metabólico das células.
<ol><li>Lave as células nos poços extras duas vezes com DPBS. Dissociar as células com 0,25% de trippsina-EDTA e células mistas de 20 μL resuspended em DPBS com 20 μL de laranja acridina/iodeto de propídio (AO/PI) solução de corante comercial pronta para uso. Determine o número de células vivas com um contador celular automatizado e regise o número para cálculos finais.</li>
	<li>Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com DPBS. Adicione 500 μL de meio quente a cada ensaio bem na capa de cultura de tecido designada pela RAM. Sele as placas com parafilm e incuba as células em uma incubadora designada pela RAM a 37 °C por 4h.</li>
	<li>Durante a incubação, corte o papel filtro em pedaços circulares ligeiramente maiores que a área dentro da tampa de tubos de microcentrifus de microcentragem de 1,5 ml e insira o papel snugly na tampa (Figura 1B). Adicione 200 μL de ácido per polemérico de 1 M a cada tubo e 20 μL de hidróxido de sódio ao papel filtro instalado dentro da tampa.</li>
	<li>Após a incubação das células, transfira 400 μL de meio de cultura de cada poço para os tubos preparados e feche as tampas imediatamente. Deixe os tubos em um rack de tubo em temperatura ambiente por 1h.</li>
	<li>Durante a incubação, configure um frasco de cintilação para cada tubo e preencha-o com 4 mL de fluido de cintilação. Transfira cada pedaço de papel filtro para um frasco de cintilação e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Realizar testes de limpeza na capa de cultura tecidual, no banho de água (usado para a preparação de 14C-oleate), geladeira, incubadora, pia, terra e qualquer outra área de trabalho para possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.</li>
	<li>Meça radioatividade 14C nos frascos de cintilação com um contador de cintilação. Regissuam os resultados da leitura. Descontaminar o ambiente de trabalho de acordo com as diretrizes de segurança da radiação, se necessário.</li>
</ol>5. Análise de dados
NOTA: Supondo que cada substrato esteja totalmente oxidado para liberar CO2, a taxa de oxidação do substrato pode ser calculada a partir da radioatividade de CO2 preso.
<ol><li>Calcule a taxa de oxidação do substrato utilizando os valores Eq (1) e X, Y e Z dados na Tabela 1 para diferentes substratos. Taxa de oxidação do substrato (μmol/célula/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>Calcule bem as desintegrações totais por minuto (DPM) para cada reação. Para X, use o valor DPM (leitura de contador de cintilação) a partir de 0,4 mL do meio de reação utilizado para captura de CO2 de 0,5 mL do meio de reação total. Portanto, o DPM total de cada reação bem é X × 1,25.</li>
		<li>Divida o DPM total por um fator de 2.220.000 para converter para μCi.</li>
		<li>Converta a radioatividade em μCi para o número de 14moléculas rotuladas em C. Divida o valor μCi pela atividade específica (Y) de cada substrato rotulado. Utilize os seguintes valores Y (Tabela 1): 14C-glicose: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamina: 200 mCi/mmol; 14 C-oleate: 50 mCi/mmol.</li>
		<li>Calcule o número total de moléculas oxidadas das moléculas oxidadas de 14C rotuladas multiplicando-as com o fator de diluição quente-total (Z). Utilizar os seguintes valores Z (Tabela 1): Glicose: 4.125; glutamina: 1.000; oleate: 12,5.</li>
		<li>Divida o produto resultante por número celular (célula#) e 4 (pelo tempo de reação de 4h) para determinar a taxa de oxidação do substrato por célula. Use a célula# determinada nos poços paralelos no início do ensaio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
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<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

O protocolo fornece um método fácil de usar para determinar a taxa de oxidação dos principais substratos de energia. É uma alternativa mais simples a outros protocolos que usam frascos contendo um poço central e tampados com rolhas de borracha 14,15,16. Embora o exemplo de estudo aqui seja realizado com cultura celular, o método pode ser facilmente adaptado para explantos teciduais ou homogeneizadores de tecidos contendo mitocôn...

A fosforilação oxidativa (OXPHOS) em eucariotes é o processo pelo qual os nutrientes são divididos dentro das mitocôndrias para liberar energia química na forma de ATP através do consumo de oxigênio.  O catabolismo de vários substratos dentro das mitocôndrias através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) gera poucas moléculas de ATP diretamente, mas armazena energia através da redução dos portadores de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e dinucleotídeo de adenina flavin (FAD+). Os portadores reduzidos são então oxidados por ETC localizados na membrana interna das mitocôndrias para gerar um gradiente de concentração de prótons através da membrana. Os prótons eventualmente fluem de volta para a matriz mitocondrial através da synthase ATP para produzir ATP. Oxphos é o meio mais eficiente de produção de ATP a partir de substratos de energia e geralmente preferido em ambientes aeróbicos. Anteriormente, a produção de glicólise aeróbica de lactato a partir da glicose, enquanto o oxigênio está presente- pensava-se ser fiofosiológica, muitas vezes uma marca registrada das células cancerosas. Cada vez mais, está sendo descoberto que alguns tipos normais de células usam glicolise aeróbica por razões que ainda não foram totalmente decifradas.
Flexibilidade metabólica é a capacidade de células ou organismos se adaptarem às mudanças nas demandas energéticas e às fontes de combustível disponíveis. Por exemplo, a demanda energética do músculo esquelético é atendida principalmente pelo OXPHOS em estado estável, mas por glicólise anaeróbica durante o exercício de alta intensidade1. À medida que a duração do exercício aumenta, a oxidação da glicose e do ácido graxo contribuem mais para a produção global de energia2. No entanto, o uso de substrato não depende apenas da disponibilidade, pois substratos competem antagonistamente durante a oxidação. Mais notavelmente, a oxidação por ácidos graxos tem sido demonstrada para inibir a utilização da glicose pelo músculo esquelético em um fenômeno conhecido como efeito Randle3. Um efeito recíproco foi demonstrado pelos estudos subsequentes 4,5. Além disso, muitas doenças estão associadas à mudança na preferência por substrato e ao desenvolvimento da inflexibilidade metabólica nas células. Por exemplo, a oxidação por ácidos graxos é reduzida no músculo esquelético dos pacientes diabéticos tipo II em comparação com os sujeitos de controle normal6. As alterações metabólicas nos cenários da doença são objeto de intensa investigação, pois podem contribuir para a patogênese.
O metabolismo energético nos tipos de células esqueléticas é relativamente pouco estudado, mas ganhou atenção nos últimos anos7. Trabalhos anteriores mostraram que a glicólise aeróbica é a via de energia dominante nos osteoblastos calvariais, enquanto a oxidação da glicose através do ciclo TCA desempenha um papel na formação osteoclasta 8,9. Outros forneceram evidências de ácidos graxos como fonte de energia para os osteoblastos10. O catabolismo da glutamina também tem sido demonstrado para apoiar a diferenciação do osteoblasto dos progenitores11,12. No entanto, ainda falta uma compreensão abrangente da utilização de substratos por vários tipos de células esqueléticas. Além disso, espera-se que mudanças no metabolismo celular durante a diferenciação celular ou em resposta a sinais patológicos alterem a utilização do substrato de combustível. Descrito abaixo é um protocolo fácil de usar para avaliar a oxidação de substrato in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtros</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Usado para filtrar a solução BSA</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Dissociar células de placas de cultura de células Tubos</td></tr><tr><td>Eppendorf de 1,5 mL</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Usado para incubação de reação</td></tr><tr><td>Placas de 10 cm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Usado para cultura de células</td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Usado para lavar a medula de ossos longos</td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td>Para preparação de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>14C-Glucose</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Usado para fazer meios</td></tr> <tr><td>quentes14C-glutamina</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Usado para fazer meios</td></tr> <tr><td>quentes14C-oleato</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Usado para fazer mídia quente</td></tr><tr><td>Agulha de 23 G</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Usado para lavar medula de ossos longos</td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Usado para cultura de células</td></tr><tr><td>70 &mu; filtros de células m</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Usado para filtrar o sobrenadante durante a digestão cavarial</td></tr><tr><td>Corante Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI)</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Cora células vivas para determinar a densidade da semente Soro</td></tr><tr><td>bovino Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Usado para conjugação de ácidos graxos</td></tr><tr><td>Celômetro Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Determinar o número de células viáveis</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Usado para pellet células</td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Dissociar células do tecido</td></tr><tr><td>MEM alfa personalizado</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>Usado para criar meios quentes personalizados</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Usado para dissolver e diluir reagentes, e lavar pratos de cultura</td></tr><tr><td>Papel de Filtro</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Armadilhas CO2 com hidróxido de sódio</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Usado para fazer meios personalizados</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Armadilhas CO2 durante a cultura de células</td></tr><tr><td>L-carnitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Suplementado para oxidação de ácidos graxos</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Usado para fazer meios personalizados</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Plastic Packaging</td><td>PM998</td><td>Usado para selar placas de cultura</td></tr><tr><td>de células Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Previne a contaminação em cultura de células</td></tr><tr><td>Ácido Perclórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>Libera CO2 durante o ensaio metabólico</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Usado para fazer meios personalizados</td></tr><tr><td>Contador de Cintilação</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>Determina a radioatividade do papel de filtro</td></tr><tr><td>Fluido de Cintilação</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>Absorva a energia emitida pelas RAMs e reemite-a como flashes de luz</td></tr><tr><td>Frasco de cintilação Fisher</td><td>Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Recipientes de reação para fluido de cintilação</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Tampão de equilíbrio para meio</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Retém CO2 durante o ensaio de metaboilização</td></tr><tr><td>Oleato</td> <td>de sódioSANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA preparação de ácidos graxos conjugados</td></tr><tr><td>Filtração a vácuo 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filtro cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de co2

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Mitocôndrias hospedam o maquinário para o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte de elétrons (ETC), que geram triptosfato de adenosina (ATP) para manter a homeostase energética. Glicose, ácidos graxos e aminoácidos são os principais substratos de energia que alimentam a respiração mitocondrial na maioria das células somáticas. Evidências mostram que diferentes tipos de células podem ter uma preferência distinta por certos substratos. No entanto, a utilização do substrato por várias células no esqueleto não foi estudada em detalhes. Além disso, como o metabolismo celular está sintonizado com alterações fisiológicas e fisiodicos, avaliações diretas da dependência de substratos em células esqueléticas podem fornecer insights importantes sobre a patogênese das doenças ósseas.
O protocolo a seguir baseia-se no princípio da liberação de dióxido de carbono de moléculas de substrato após a fosforilação oxidativa. Ao usar substratos contendo átomos de carbono radioativos rotulados (14C), o método fornece um ensaio sensível e fácil de usar para a taxa de oxidação de substrato na cultura celular. Um estudo de caso com preosteoblasts primários do calvário versus macrófagos derivados da medula óssea (MMC) demonstra diferente utilização dos principais substratos entre os dois tipos de células.

Neste exemplo, o método de captura de CO2 é usado para comparar a oxidação do substrato por preosteoblasts pré-sísceros do calvário primário versus BMMs, que são frequentemente usados para a diferenciação de osteoblasto in vitro ou osteoclasta, respectivamente. Depois que as células primárias são passaged e cultivadas em cMEMα durante a noite, elas normalmente atingem 80-90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os preosteoblastas calvariais são notavelmente maiores que os BMMs (<stro...

Este protocolo descreve um método fácil de usar para examinar a oxidação do substrato rastreando a produção de 14CO2 in vitro.

Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

O uso de diferentes substratos de energia é tanto tipo celular específico quanto indicativo de doença. Medir o consumo dos substratos específicos pode lançar luz sobre a biologia normal e a patologia. A técnica não precisa de equipamentos especializados e é fácil de escalar.Também é mais fácil de usar do que os métodos publicados anteriormente. A compreensão das mudanças na taxa de oxidação do substrato permitirá o desenvolvimento de intervenções dietéticas e farmacológicas para distúrbios metabólicos. Embora demonstrada com tecido ósseo esta técnica é facilmente personalizada para estudar a flexibilidade metabólica em todos os tipos de células, proporcionando uma compreensão das causas e consequências das mudanças metabólicas.Depois de sacrificar os filhotes de três a cinco dias pós-natal, transfira-os para o frio d pbs frio contendo penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Exponha a calvária removendo a pele e o tecido mole. Colete a região média cortando os tecidos circundantes de trás para frente em D PBS.Coce as superfícies internas e externas da calvária suavemente usando pinças para ajudar a liberar as células após a digestão subsequente. Prepare 2 e 4 miligramas por mililitro de soluções de colagenase tipo dois em D PBS e filtre cada solução com um filtro fresco de 0,22 micrômetros. Primeiro, digerir a calvaria limpa com dois miligramas por solução de colagem mililitro por 15 minutos e, em seguida, descartar a solução de digestão.Em seguida, digerir as amostras limpas em quatro miligramas por solução de colagenase mililitro três vezes por 15 minutos cada vez. Em seguida, puxe a solução de digestão e salve-a. Filtre a solução de digestão através de cepas de células de 70 micrômetros e centrífugue o filtrado a 300 RCF por cinco minutos.Suspender a pelota celular em meio alfa MEM completo contendo 10% FBS e penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Conte e semee as células em uma placa de 10 centímetros. Cultume as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por três dias.Em seguida, dissociar as células a 37 graus Celsius com 0,25 Trypsin EDTA. Após a digestão, conte e semente as células em uma placa de cultura de 24 poços com um meio alfa MEM completo contendo 10% FBS e penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Semente pelo menos quatro poços por tipo de célula por substrato, e pelo menos três poços extras para cada tipo de célula para contagem pré-ensaio.Cultume as células a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de remover o músculo e o tecido conjuntivo de camundongos de oito semanas de idade e coletar fêmures e tíbias, corte e descarte ambas as extremidades dos ossos com uma tesoura afiada. Limpe a medula óssea de um fêmur e uma tíbia em uma placa de Petri fresca de 10 centímetros com uma seringa equipada com uma agulha de calibre 23 contendo 15 mililitros de meio alfa MEM completo com 10% FBS penicilina dupla solução antibiótico, e 10% CGM 14 12 meio condicionado.Cultume as células da placa de Petri em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após três dias, descarte os meios de cultura e enxágue as células com D PBS. Dissociar as células anexadas a 37 graus Celsius com 0,25% Trypsin EDTA por cinco minutos.Após a centrifugação, suspenda a pelota celular no meio BMM. Conte e semee as células em uma placa de cultura de 24 poços de células pelo procedimento descrito anteriormente. Cultura a 37 graus Celsius durante a noite no meio BMM antes de iniciar os ensaios.Lave as células nos poços extras duas vezes com D PBS. Dissociar as células com 0,25% Trypsin EDTA. Suspender 20 microliters de células digeridas em D PBS.Com 20 microliters de laranja acridina e solução de corante de ióide de propídio, determine o número de células vivas com um contador celular automatizado e registe o número. Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com D PBS. Adicione 500 microliters de meio quente a cada ensaio bem na capa de cultura de tecido designada RAM.Depois de selar a placa com parafilme, incubar as células em uma incubadora designada RAM a 37 graus Celsius por 4 horas. Durante a incubação, corte o papel filtro em pedaços circulares, ligeiramente maior que a área dentro da tampa do tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro e insira o papel na tampa. Adicione 200 microlitres de um molar ácido perpólorico a cada tubo e 20 microlitres de hidróxido de sódio ao papel filtro instalado dentro da tampa.Após a incubação das células, transfira 400 microliters de meio de cultura de cada poço para os tubos preparados e feche as tampas imediatamente. Deixe os tubos em um rack de tubo em temperatura ambiente por uma hora. Paralelamente durante a incubação configure um frasco de cintilação para cada tubo e preencha-o com quatro mililitros de fluido de cintilação.Transfira cada pedaço de papel filtro para um frasco de cintilação e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Realize testes de limpeza na capa da cultura tecidual, no banho de água, geladeira, incubadora, pia, no chão e em qualquer outra área de trabalho para possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.Meça a atividade de rádio carbono 14 nos frascos de cintilação com um contador de cintilação e regissuça os resultados da leitura. Descontaminar o ambiente de trabalho, de acordo com as diretrizes de segurança da radiação, se necessário. A figura compara a oxidação do substrato por pré-osteoblastos de calvaria primária versus BMMs.Depois que as células primárias são permeadas e cultivadas em meio alfa MEM completo durante a noite, elas normalmente atingem 80 a 90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os pré-osteoblastos calvariais são notavelmente maiores que os MMMs. Os resultados da oxidação do substrato mostraram que a taxa de oxidação para cada substrato é significativamente maior em pré-osteoblastos calvariais do que os MMM, provavelmente indicando maior produção de energia por fosforilação oxidativa nos pré-osteoblastos.O terceiro papel inserido deve ser ligeiramente maior do que uma tampa de tubo de ebin de 1,7 mililitro. Este método pode ser usado em conjunto com o consumo de oxigênio e para determinar a taxa global de fosforilação oxidativa e produção lactativa nas células. Este protocolo pode ser usado para determinar o uso de substratos durante estágios distintos de diferenciação ou configurações de doenças.Com esse conhecimento podemos desenvolver intervenções para distúrbios metabólicos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe...

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Este vídeo demonstra uma técnica de quantificação para CO2 liberado durante a oxidação do substrato usando 14substratos radiomarcados com C. O 14CO2 liberado é preso em uma solução alcalina e quantificado por um contador de cintilação. A oxidação de diferentes substratos varia entre os tecidos e reflete a condição fisiopatológica do tecido.

Ensaio de oxidação de substrato em células cultivadas: um ensaio in vitro para quantificar a oxidação de substrato em células medindo sinais radioativos de CO2 aprisionado

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.

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Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

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Este protocolo descreve a avaliação do status de redox específico do compartimento subcelular dentro da célula. Uma sonda fluorescente sensível ao redox permite uma análise racionmétrica conveniente em células intactas.

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Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

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A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Apresentamos um protocolo para permeabilizar seletivamente a membrana plasmática, permitindo a entrega direcionada de substratos e inibidores para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) em células cultivadas, superando barreiras de transporte da membrana plasmática que normalmente dificultam essa análise. Usando essa técnica, demonstramos como a função do OXPHOS é modulada por agonistas muscarínicos e antagonistas.

Modulação dependente de ligante colinérgico do acoplamento de fosforilação oxidativa em células de neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

Aprenda a medir a oxidação de substratos energéticos in vitro usando armadilhas de 14CO2 em células ósseas. Este método acessível e escalável auxilia pesquisadores a investigar distúrbios metabólicos.

Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com ¹⁴armadilhas de CO₂

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