Name: Quantificação de nível global de modificações pós-translacionais histone em um modelo de cultura celular 3D de tecido hepático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a quantificar modificações pós-translacionais de histonas em esferoides de hepatócitos C3A usando cromatografia líquida e espectrometria de massas. Este método permite analisar centenas de PTMs simultaneamente em culturas 3D.

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O laboratório Sidoli agradece a Leucemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (prêmio Xseed), Relay Therapeutics, Merck, e o NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

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<li>Tvardovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+and+middle-down+protein+analysis+reveals+that+intact+and+clipped+human+histones+differ+in+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).</li>
<li>Azad, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+chromatin+by+histone+tail+clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modifying chromatin by histone tail clipping.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).</li>
<li>Kragesteen, B. K., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+or+tails%3A+histone+tail+clipping+regulates+macrophage+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity.</a> Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).</li>
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<li>Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+roles+of+histone-modifying+enzymes+and+their+associated+chromatin+modifications+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation.</a> Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Chan, J. C., Maze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothing+is+yet+set+in+%28hi%29stone%3A+novel+post-translational+modifications+regulating+chromatin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
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<li>Onder, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+epigenetic+histone+modification+analysis+by+mass+spectrometry+for+clinical+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations.</a> Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).</li>
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<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Moradian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
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<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics%3A+a+still+unexploited+resource+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).</li>
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<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+window+acquisition+of+all+theoretical+mass+spectra+%28SWATH%29+analysis+for+characterization+and+quantification+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).</li>
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<li>Wojcik, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27+dimethyl+loss+is+highly+specific+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+and+distinguishes+true+PRC2+loss+from+isolated+H3K27+trimethyl+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss.</a> Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).</li>
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<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Farrelly, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+serotonylation+is+a+permissive+modification+that+enhances+TFIID+binding+to+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3.</a> Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP-ribosylation+of+histone+variant+H2AX+promotes+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair.</a> The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+histone+glycation+is+associated+with+disease-related+changes+in+chromatin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture.</a> Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).</li>
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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

A análise dos PTMs histone é fundamentalmente diferente do típico pipeline de análise de proteômica. A maioria dos PTMs histone ainda tem funções biológicas enigmáticas; como resultado, anotações como Gene Ontology ou bancos de dados de caminhos não estão disponíveis. Existem vários recursos que associam modificações de histona à enzima responsável por sua catálise ou proteínas que contenham domínios que ligam esses PTMs (por exemplo, HISTome36). Além disso, é possível especular sobre o estado ger...

Desde o final do séculoXIX, os sistemas de cultura celular têm sido usados como modelo para estudar o crescimento e o desenvolvimento de células fora do corpo humano 1,2. Seu uso também foi ampliado para estudar como os tecidos e órgãos funcionam em contextos saudáveis e doentes 1,3. As células de suspensão (por exemplo, as células sanguíneas) crescem em placas de Petri ou frascos de forma perfeita e intercambiável, pois não se reúnem em estruturas tridimensionais (3D) in vivo. Células derivadas de órgãos sólidos podem crescer em sistemas de cultura bidimensional (2D) ou 3D. Na cultura 2D, as células são cultivadas em uma monocamada que adere a uma superfície plana 2,4. Os sistemas de cultura celular 2D são caracterizados pelo crescimento exponencial e um tempo de duplicação rápida, tipicamente de 24h a poucos dias5. Células em sistemas 3D crescem para formar interações intrincadas células-células modelando conglomerados semelhantes a tecidos mais de perto, e são caracterizadas por sua capacidade de alcançar um equilíbrio dinâmico onde seu tempo de duplicação pode chegar a 1 mês ou mais5.
Apresentado neste artigo é uma metodologia inovadora para cultivar esferoides 3D em sistemas de cultura celular rotativa que simulam a gravidade reduzida6. Este é um derivado simplificado de um sistema de cultura celular introduzido pela NASA na década de 19907. Essa abordagem minimiza as forças de shearing, que ocorrem em métodos existentes, como frascos giratórios, e aumenta a reprodutibilidade esferoide6. Além disso, o bioreator rotativo aumenta a difusão ativa de nutrientes, minimizando a formação necrótica que ocorre em sistemas como a cultura de células de queda pendurada onde a troca de mídia é impraticável6. Dessa forma, as células crescem em sua maioria sem serem perturbadas, permitindo a formação de características estruturais e fisiológicas associadas às células que crescem no tecido. Os hepatócitos C3A (HepG2/C3A) cultivaram dessa forma não só as organelas ultraestruturais, mas também produziram quantidades de ATP, quinase adenila, ureia e colesterol comparáveis aos níveis observados in vivo 1,2. Além disso, as células cultivadas em sistemas de cultura celular 2D vs.3D exibem diferentes padrões de expressão genética8. A análise da expressão genética dos hepatócitos C3A cultivadas como esferoides 3D mostrou que essas células expressavam uma ampla gama de proteínas específicas do fígado, bem como genes envolvidos em caminhos-chave que regulam a função hepática8. Publicações anteriores demonstraram as diferenças entre os proteomes de células em crescimento exponencial na cultura 2D versus células em equilíbrio dinâmico nas culturas esferoides 3D5. Essas diferenças incluem o metabolismo celular, que por sua vez afeta a estrutura, função e fisiologia da célula5. O proteome das células cultivadas na cultura 2D foi mais enriquecido em proteínas envolvidas na replicação celular, enquanto o proteome de esferoides 3D foi mais enriquecido na funcionalidade hepática5.
A taxa de replicação mais lenta das células cultivadas como esferoides 3D modela com mais precisão fenômenos específicos associados ao estado de cromatina e modificações (por exemplo, recorte de histona9). O recorte de histona é uma modificação pós-translacional irreversível (PTM) que causa decote proteolítico de parte da cauda do terminal de histone. Enquanto sua função biológica ainda está em discussão 10,11,12,13, é claro que sua presença em células primárias e tecido hepático é modelada por células HepG2/C3A cultivadas como esferoides, mas não como células planas 9. Isso é crítico, pois o estado da cromatina e as modificações regulam a leitura de DNA principalmente através da modulação da acessibilidade aos genes e, portanto, sua expressão14. Os PTMs histonos ou influenciam diretamente o estado cromatina afetando a carga líquida dos nucleosmosos onde os histones são montados, ou indiretamente recrutando escritores, leitores e borrachas14. Centenas de PTMs histone foram identificados até o momento15, reforçando a hipótese de que a cromatina hospeda um "código histona" usado pela célula para interpretar o DNA16. No entanto, a identificação de uma miríade de combinações de PTM15, e a descoberta de que combinações de PTMs histone frequentemente têm funções biológicas diferentes de PTMs presentes isoladamente (por exemplo, Fischle, et al.17), destaca que mais trabalho é necessário para descriptografar o "código histona".
Atualmente, a análise histone PTM é baseada em técnicas que utilizam anticorpos (por exemplo, manchas ocidentais, imunofluorescência ou imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento [ChIP-seq]) ou espectrometria de massa (MS). As técnicas baseadas em anticorpos têm alta sensibilidade e podem fornecer informações detalhadas sobre a localização em todo o genoma de marcas de histona, mas são frequentemente limitadas no estudo de PTMs raros ou PTMs presentes em combinações 18,19,20. A ESM é mais adequada para identificação e quantificação de proteínas únicas e coexistindo, em particular proteínas histonas 18,19,20. Por essas razões, este e vários outros laboratórios otimizaram o pipeline de MS para a análise de peptídeos de histona (ms de baixo para cima), caudas de histona intactas (MS médio-para baixo) e proteínas histonas de comprimento completo (MS de cima para baixo) 21,22,23.
Detalhado abaixo está um fluxo de trabalho para o crescimento de spheroids HepG2/C3A e prepará-los para análise de peptídeos histone (bottom-up MS) via cromatografia nano-líquida, juntamente com espectrometria de massa tandem (nLC-MS/MS). Uma cultura celular 2D foi cultivada e as células foram colhidas e transferidas para um bioreator onde começariam a formar esferoides (Figura 1). Após 18 dias na cultura, os esferoides foram tratados com butirato de sódio ou succinato de sódio para aumentar as abundâncias relativas de acetilação de histona e succinilation. Notavelmente, culturas 3D podem ser tratadas com compostos genotóxicos, bem como seus equivalentes de cultura plana; de fato, publicações recentes destacam que a resposta toxicológica das células na cultura 3D é mais semelhante aos tecidos primários do que aqueles na cultura plana 2D 24,25. As células foram então coletadas em pontos de tempo especificados e o isolamento nuclear foi realizado. Em seguida, as histonas foram extraídas e derivadas com anidrido propionônico antes e depois da digestão da trippsina de acordo com um protocolo desenvolvido pela primeira vez por Garcia et al.26. Este procedimento gera peptídeos de tamanho adequado para separação on-line com cromatografia de fase inversa (C18) e detecção com ESM. Finalmente, os peptídeos histonas foram identificados e quantificados, e os dados gerados foram representados de múltiplas formas para uma interpretação biológica mais completa.

<table><tbody><tr><td>Solução de tripsina-EDTA a 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,5-20 &micro; Pontas de pipeta L</td><td>MARCA</td><td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L pipeta multicanal</td><td>MARCA</td><td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr> <tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td> <td>Ponta de trava Luer, graduada para 12 mL</td></tr><tr><td>10, 20, 200 e 1000 &micro; L pipetas monocanal</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Pontas de pipeta L</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>agulha de seringa 18 G</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td><td>3" de comprimento, 0.05" de diâmetro</td></tr><tr><td>200 &micro; L pipeta multicanal</td><td>Corning</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &micro; Pontas de pipeta em L</td><td>MARCA</td><td>Z740118 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de fixação ultra-baixa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2&nbsp; Balão de cultura de células em forma de U</td><td>Corning</td><td>461464U</td><td>Não tratado, com tampa de ventilação</td></tr><tr><td>Placa de rodapé de 96 poços</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C (Corning)</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>A acetona deve ser usada</td></tr><tr><td>fria Bicarbonato de amônio (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio solução</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de cultura de células</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>Biorreator para cultura de células 3D</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N / A</td><td>Clinostat CO2 incubadora para cultura de células 3D</td></tr><tr><td>Unidade de controle</td><td>CelVivo</td><td>N / A</td><td>Tablet para ClinoStar configurações</td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>17-205-CV</td><td>1X solução com 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódio, sem L-glutamina e vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Hotte</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Modelo 7121000</td></tr><tr><td>Vidro Pipeta Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9", com plugue de algodão, vidro borossilicato, não estéril</td></tr><tr><td>Suplemento Glutagro</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-ananil-L-glutamina</td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1X solução sem vermelhos de cálcio, magnésio e fenol</td></tr><tr><td>Acetonitrila de grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Gelo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td>100X solução</td></tr><tr><td>Oasis HLB resina</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td>Resina Hidrofílica-Lipofilica-Balanceada (HLB) com 30&micro; m tamanho de partícula</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Espectrômetro de massa Tribrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Espectrômetro de massa de alta resolução</td></tr><tr><td>Placa de filtro de polipropileno Oro-Flex I</td><td>Orochem</td><td>OF1100</td><td>Placa de filtro de polipropileno de 96 poços com 10 &micro; M PE frita</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X solução</td></tr> pH <tr><td>papel</td><td>Hydrion</td><td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td><td>0-13 Papel de teste de pH</td></tr><tr><td>Pipeta pistola</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Polimicro capilar</td><td>Molex</td><td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td><td>Tubo capilar de sílica fundida flexível com revestimento de polimida, 75 &micro; M ID x 363 e micro; M OD</td></tr><tr><td>Poliestireno 10 mL pipetas sorológicas, estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido propiônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Resina Reprosil-Pur MSWIL</td><td></td><td>R13. AQ.0003</td><td>120 &Aring; tamanho dos poros, fase C18-AQ, 3 &micro; M tamanho do grânulo</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Clay Adams</td><td>25477 (American Laboratory Trading)</td><td>Nutator Mixer 1105</td></tr><tr><td>Tripsina modificada de grau de sequenciamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio dibásico</td><td>Concentrador a vácuo Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac (tubos de microcentrífuga de 1,5 mL)</td><td>Savant</td><td>20249 (American Laboratory Trading)</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador a vácuo SpeedVac (96 poços)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Capuz estéril</td><td>Thermo Scientific</td><td>1375</td><td>Classe II, Tipo A2</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker analisou o reagente</td></tr> <tr><td>ACSPrato de 100 mm x 20 mm tratado com cultura</td><td>de tecidos Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético (TCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC421451000</td><td>Ressuspender 100% p/v em água de grau HPLC</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28904</td><td>Coletor de vácuo de grau de sequenciamento</td></tr><tr><td>96 poços</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Banho de água</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de diâmetro largo 1000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de diâmetro largo 200 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de nível global de modificações pós-translacionais histone em um modelo de cultura celular 3d de tecido hepático

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Culturas planas de células mamíferas são uma abordagem in vitro amplamente utilizada para a compreensão da fisiologia celular, mas este sistema é limitado na modelagem de tecidos sólidos devido à replicação celular não naturalmente rápida. Isso é particularmente desafiador quando modela cromatina madura, já que células de replicação rápida estão frequentemente envolvidas na replicação do DNA e têm uma população poliploide heterogênea. Apresentado abaixo é um fluxo de trabalho para modelar, tratar e analisar modificações quiescentes de cromatina usando um sistema de cultura celular tridimensional (3D). Usando este protocolo, as linhas celulares de carcinoma hepatocelular são cultivadas como esferoides 3D reprodutíveis em uma incubadora que fornece difusão ativa de nutrientes e baixas forças de salto. O tratamento com butirato de sódio e succinato de sódio induziu um aumento na acetilação de histona e succinilation, respectivamente. Aumentos nos níveis de acetilação de histona e succiniltação estão associados a um estado de cromatina mais aberto. Os spheróides são então coletados para isolamento de núcleos celulares, dos quais as proteínas histonas são extraídas para a análise de suas modificações pós-translacionais. A análise de histona é realizada através de cromatografia líquida acoplado on-line com espectrometria de massa tandem, seguido por um pipeline computacional interno. Finalmente, exemplos de representação de dados para investigar a frequência e ocorrência de marcas de histona combinatória são mostrados.

Neste protocolo, os esferoides HepG2/C3A foram tratados com 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, ambos áfetou os níveis globais de PTMs histone (Figura 3A). Os PTMs de histone foram então identificados e quantificados no nível único de resíduos via aquisição de MS/MS (Figura 3B).
Quando as amostras são executadas em réplicas, a análise estatística pode ser realizada para avaliar o enriquecimento da mudança de dobra de um PTM entre as a...

Este protocolo descreve como um sistema de cultura celular tridimensional pode ser usado para modelar, tratar e analisar modificações de cromatina em um estado quase fisiológico.

Quantificação de nível global de modificações pós-translacionais histone em um modelo de cultura celular 3D de tecido hepático

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

A dinâmica global da cromatina tem se mostrado um importante mediador de vários estados da doença, como câncer e envelhecimento. Nosso protocolo fornece um modelo fisiologicamente relevante para estudar esse processo. A análise laboratorial padrão das modificações pós-translacionais de histone ou PTMS é geralmente limitada à sondagem para um único PTM de cada vez usando ensaios baseados em anticorpos.A análise de espectrometria de massa da cromatografia líquida da histona PTMS nos permite medir a abundância de centenas de PTMS em um único experimento. Demonstrando o procedimento estarão Stephanie Stransky, Ronald Cutler e Julie Kim, pós-doutora, estudante de pós-graduação e tecnologia de pesquisa, respectivamente, do laboratório. Primeiro, usando mídia de crescimento padrão, cresça as células como uma monocamada até que elas sejam 80% confluentes.Em seguida, lave as células com HBSS. Adicione cinco mililitros de 0,05% trypsin-EDTA diluídos no HBSS. Incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Use um microscópio para verificar o desprendimento celular. Depois de contar as células, diluir a suspensão celular com nova mídia de crescimento. Adicione 0,5 mililitros de mídia de crescimento para equilibrar uma placa inferior de 24 poços com vários micro-poços em cada.Em seguida, centrifufique as placas a 3000 x g para remover bolhas de ar da superfície da placa. Agora transfira a suspensão celular previamente feita para a placa de 24 poços e centrífuga por três minutos a 120 x g. Verifique as células na placa de 24 poços e, em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para formação de esferoides.Enquanto isso, para equilibrar o bioreator, adicione 25 mililitros de água estéril à câmara de umidade e nove mililitros de mídia de crescimento à câmara celular. Incubar o bioreator em uma incubadora rotativa de clinostat por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Retire os esferoides da placa de 24 poços de fixação ultra baixa, pipetando suavemente usando um mililitro de pontas de furo largo, e transfira-os para um prato de cultura de tecido.Para selecionar esferoides suficientemente formadores, verifique a qualidade dos esferoides sob um microscópio. Spheroids de boa qualidade têm tamanho uniforme, compactação e arredondamento. Encha o bioreator equilibrado com cinco mililitros de mídia de crescimento fresco, e transfira os esferoides para ele.Em seguida, encha o bioreator completamente com novas mídias de crescimento e coloque o bioreator na incubadora de clinostat de 10 a 11 RPM. A cada dois ou três dias, trocam a mídia de crescimento substituindo 10 mililitros da mídia antiga por mídia fresca. À medida que este spheroids aumenta em tamanho e número, aumente a velocidade de rotação da incubadora.Depois de obter a pelota esferoide, adicione cinco volumes de ácido sulfúrico molar frio de 0,2 molar à pelota e pipeta para cima e para baixo para interromper a pelota e soltar histones. Uma vez que o supernante é obtido após a centrifugação, adicione ácido tricloroacético concentrado a frio, de tal forma que a concentração final se torne 25 a 30% de volume em volume. E misture invertendo o tubo algumas vezes e centrífuga como descrito no manuscrito.Depois de descartar o supernatante, usando uma pipeta de pasto de vidro, lave a pelota e as paredes do tubo com aproximadamente 500 microliters de acetona fria e ácido clorídrico de 0,1%, e depois centrífuga a 3.400 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, vire o tubo para descartar o supernatante. Usando uma pipeta de pastagem de vidro, adicione 500 microliters de acetona 100% fria para lavar a pelota e a centrífuga, como demonstrado anteriormente.Depois de descartar o supernasce, remova completamente a acetona por pipetar cuidadosamente, e deixe a amostra secar com uma tampa aberta por cerca de 20 minutos. Resuspenja a pelota em 20 microlitres de 15 a 20% de acetonitrilo em um bicarbonato de amônio de 100 milimônios de pH 8. Após o vórtice, gire a suspensão a 1000 x g por 30 segundos.Para oito ou mais amostras, transfira cada amostra suspensa para uma placa de 96 poços. Em seguida, em um capô, adicione dois microliters de anidrido propiônico e misture por pipetação cinco vezes. Adicione rapidamente 10 microliters de hidróxido de amônio e misture por pipetação cinco vezes.Misture a resina HLB em uma placa de agitação magnética. Em seguida, adicione 70 microliters da suspensão HLB a cada poço de uma placa de filtro de 96 poços em uma placa de coleta de 96 poços. Após descartar o fluxo, lave a resina com 100 microlitres de ácido trifluoroacético de 0,1%.Após reaprgerentar cada amostra em 100 microlitres de ácido trifluoroacético de 0,1%, carregue cada amostra em cada poço e evite espirrar usando um vácuo. Depois de descartar o fluxo, lave as amostras com 100 microlitres de ácido trifluoroacético de 0,1% e coloque a placa do filtro em uma nova placa de coleta. Em seguida, adicione 60 microliters de 60% de acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1% a cada poço e evite espirrar usando vácuo.Colete o fluxo através e seque em um vácuo de velocidade. Carregue a placa de coleta seca no HPLC e execute o método LC/MS/MS conforme descrito no manuscrito. Neste estudo, observou-se a abundância relativa de modificações pós-translacionais de histona comum em hepatocitos C3A cultivados como esferoides tridimensionais.Modificações pós-translacionais também poderiam ser observadas em um único resíduo em peptídeos gerados a partir de proteínas histonas. O tratamento dos esferoides com butirato de sódio aumentou a abundância relativa de acetilação de histona, enquanto que com succinato de sódio aumentou a succinylation de resíduo de histona. O método também demonstrou o padrão de distribuição da acetilação de histona após o tratamento de butirato de sódio e o de succinylation de histona após o tratamento com succinato de sódio.O resultado também mostrou padrões comuns de diferentes modificações de histona. Os tratamentos de butirato de sódio aumentaram significativamente a acetilação do resíduo de lysina 14 em um peptídeo gerado a partir da proteína histona H3, somente quando seu nono resíduo de lysina tinha dois grupos de metila, mas não um ou três grupos de metila. As abundâncias relativas de modificações individuais e várias combinações de modificações pós-translacionais no peptídeo derivado de H3 também foram calculadas.Padrões combinatórios de modificações pós-translacionais após o tratamento de butirato de sódio também foram observados em um peptídeo gerado a partir da proteína histona H4. Aqui também, o tratamento de butirato de sódio resultou em um aumento significativo na acetilação. Atenção crítica deve ser colocada sobre manter os esferoides no banco o mínimo possível e em um passo desalado para evitar derramamento de amostras. Este fluxo de trabalho pode ser usado para explorar a cromatina em tecidos sólidos usando um modelo mais fisiológico do que replicar rapidamente culturas de células planas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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