Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

O Digital Spatial Profiling, ou DSP, oferece um método eficiente para quantificação de proteínas estratificadas espacialmente. Sua implementação nos permite caracterizar a expressão de proteínas em regiões distintas de um tumor e do microambiente. Uma característica fundamental do DSP é sua capacidade de multiplexação, permitindo o processamento de dados de alta taxa de transferência.

A capacidade de definir regiões personalizadas de interesse também fornece uma dimensão espacial para a análise de dados. O DSP pode ser aplicado a qualquer amostra em que a proteína quantificadora espacial ou a expressão de RNA possam ajudar a elucidar um processo patológico ou fisiológico. Isso é especialmente relevante em oncologia, onde a variabilidade do alvo regional pode se correlacionar com o crescimento maligno ou invasão.

Demonstrando o procedimento estarão Scott Palisoul, histotecnólogo, e Rachael Barney, tecnóloga genômica. Para preparar lâminas, comece pegando vários núcleos de dois milímetros de cada biópsia e colocando-os em um único bloco de microarray de tecido. Corte seções de quatro mícrons do bloco e monte-as em lâminas de vidro.

Coloque cada lâmina dentro da junta do suporte da lâmina e incube-a a 60 graus Celsius por 30 minutos. No sistema IHC semi-automatizado, encha o recipiente na posição um com 150 microlitros de tampão de lavagem por lâmina, além de cinco mililitros de volume morto, e deixe a tampa aberta. Encha a mesma quantidade de solução de bloqueio no recipiente na posição dois.

Carregue a bandeja do recipiente do reagente na máquina. Selecione o IHC de processo, seguido pelo nome da solução de bloqueio na caixa suspensa do campo Marcador. Uma vez terminado para todos os slides, clique em Fechar.

Em seguida, clique em Imprimir etiquetas e marque Todas as etiquetas de slide ainda não impressas e clique em Imprimir. Afixe etiquetas na parte superior dos slides. Carregue os slides na bandeja deslizante, garantindo que a amostra e o rótulo estejam voltados para cima.

Pressione o botão LED para abaixar a bandeja e permitir que o instrumento inicie a digitalização e o reconhecimento de slides. Clique no botão Iniciar para iniciar o experimento. Quando a execução estiver concluída, pressione o botão LED quando ele piscar em verde.

Remova a bandeja do instrumento e levante cuidadosamente as telhas da tampa de cada slide. Coloque as lâminas na solução salina tamponada com fosfato 1X. Remova o excesso de tampão e contorne cada seção de tecido com uma caneta hidrofóbica para criar uma barreira hidrofóbica.

Faça uma solução de anticorpo PC oligo adicionando oito microlitros de cada anticorpo por lâmina e usando o tampão W para atingir um volume final de 200 microlitros. Em seguida, aplique a solução de anticorpo PC oligo nas lâminas e incube as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, coloque as lâminas em uma bandeja umidificada e lave três vezes por 10 minutos em 1X TBST.

Pós-fixação em paraformaldeído a 4% por 30 minutos à temperatura ambiente, seguida de lavagem duas vezes por cinco minutos em TBST 1X. Adicione a mancha nuclear SYTO 13 por 15 minutos à temperatura ambiente, seguida de lavagem duas vezes com 1X TBST. Passe o mouse sobre a Coleta de Dados na Central de Controle e selecione Novo ou Continuar Executar.

Coloque o slide no suporte do slide com o rótulo em direção ao usuário. Abaixe a braçadeira da bandeja deslizante, garantindo que o tecido esteja visível na janela alongada. Adicione seis mililitros de Buffer S.Siga as instruções no Centro de Controle.

Aplique zoom entre diferentes eixos com os controles deslizantes x e y para delinear uma região para digitalização. Selecione Digitalizar e permita que a varredura prossiga até que toda a área de destino definida tenha sido visualizada. Gere uma imagem 20 vezes.

Defina os ROIs selecionando três ROIs circulares de tamanho igual de um diâmetro de 250 micrômetros para cada núcleo de tecido. Aprove os ROIs clicando no botão Sair do Espaço de Trabalho de Digitalização. Em seguida, espere que a luz UV colha os oligos dos anticorpos.

Depois de concluir o processo do instrumento de limpeza, selecione Nova coleta de dados para continuar com os slides ou a placa atuais. Abra a janela da placa finalizada clicando duas vezes na área do ícone da placa. Insira o número de lote do pacote de código de hibridização e clique em Atualizar.

Em seguida, clique em Finalizar. Desprenda o suporte do slide e a placa de coleta seguindo as instruções. Guarde as lâminas em TBST ou cubra-as com um meio aquoso e cubra o deslizamento para armazenamento a longo prazo.

Selar as placas usando uma vedação permeável e secar os aspirados a 65 graus Celsius em um termociclador com o topo aberto. Adicione sete microlitros de água tratada com pirocarbonato de dietilo e misture. Incube à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, gire para baixo rapidamente.

Prepare a mistura de buffer da sonda escolhendo as equações R e U da sonda apropriadas aplicando a equação conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 84 microlitros de mistura de buffer de sonda a cada pacote de código de hibridização. Em uma nova placa de hibridização de 96 poços, adicione oito microlitros de cada mistura mestre de código de hibridização em todos os 12 poços da linha indicada.

Transfira sete microlitros da placa de coleta DSP para o poço correspondente na placa de hibridização. Sele o calor, gire a placa e incube-a durante a noite a 67 graus Celsius. Após a incubação, resfrie a placa no gelo e realize um giro rápido.

Junte os produtos de hibridização de cada poço em um tubo de tira, pipetando suavemente cada poço cinco vezes. Gire para baixo e carregue os tubos da tira no sistema de análise. No instrumento DSP, salve o arquivo CDF em uma unidade USB e transfira os dados para o analisador digital.

Na tela, pressione Iniciar processamento. Selecione Alta sensibilidade seguida de Avançar. Pressione Select All para o número de poços com amostras e, em seguida, Finish, seguido por Next na notificação por email.

Em seguida, clique em Iniciar. Uma vez que a estação de preparação esteja pronta, sele o cartucho e transfira-o para o analisador digital. Pressione Start Counting.

Selecione Posição do palco. Pressione Load Existing CDF file (Carregar arquivo CDF existente) e selecione o arquivo carregado anteriormente. Pressione Concluído.

Selecione Posição do Palco novamente, pressione Concluído e Iniciar para executar o programa. Salve o arquivo ZIP dos arquivos de conversão de contagem do repórter do sistema de análise em uma unidade USB. Insira a unidade na máquina DSP.

No Centro de Controle de DSP, passe o mouse sobre Coleta de Dados e clique em Carregar Contas. Selecione o arquivo ZIP relevante. Clique em Registros no Centro de Controle DSP.

Para exibir varreduras na fila, selecione Adicionar varreduras selecionadas à fila e, em seguida, Minha fila de análise. Selecione Novo Estudo na Fila passando o mouse sobre a opção Análise de Dados na Central de Controle. O experimento de DSP foi realizado em amostras de glioblastoma, e os resultados foram visualizados como um mapa de calor.

As linhas representam alvos proteicos e cada coluna corresponde a uma região de interesse. O nível de expressão é representado por um intervalo de cores que varia de azul, mostrando expressão baixa, a vermelho, que denota alta expressão. A variabilidade da cor dentro de uma linha reflete a heterogeneidade da proteína regional e sugere uma possível associação espacial com a expressão diferencial de proteínas.

Neste experimento, S100 e CD-56 foram universalmente altos, porque são marcadores neurais. Os marcadores com maior variabilidade incluem B7-H3, KI-67, CD-44 e fibronectina, que são conhecidos por estarem associados à proliferação, migração e metástase tumorais. A partir de uma vasta gama de alvos candidatos, o DSP pode identificar aqueles que exibem variação regional significativa.

Isso estabelece as bases para investigar fatores associados à variabilidade e sua relevância para a doença.