Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR
20 de setembro de 2022
Construímos um fluxo de trabalho metabolômico não-acompanhado que integrou XY-Meta e metaX juntos. Neste protocolo, exibimos como usar o XY-Meta para gerar uma biblioteca espectral chamariz a partir da referência de espectro de acesso aberto e, em seguida, executamos o controle FDR e usamos o metaX para quantificar os metabólitos depois de identificar o espectro metabolômico.
Este protocolo permite a análise qualitativa e quantitativa do metabolome não-alvo com base no controle de qualidade FDR que reduz efetivamente os falsos positivos da identificação metabólica. Este fluxo de trabalho integra o XY-Meta que utiliza a estratégia de isca-alvo para avaliar o FDR com mais precisão para identificação metabolome no módulo de análise qualitativa. Esta medida pode efetivamente filtrar resultados falsos positivos da identificação metabolome não alvo, o que melhora a robustez de descobrir biomarcadores ou moléculas-chave.
Esperamos que os pesquisadores possam entender e dominar a estratégia de isca-alvo para o controle da FDR e devem tentar executar rigorosamente este pipeline várias vezes com os parâmetros padrão do protocolo. Comece indo para a página web do banco de dados GNPS e clique em procurar conjuntos de dados. Pesquise a palavra-chave na coluna título e clique no número de identificação do conjunto de dados.
Baixe o conjunto de dados usando FTP e salve os dados brutos na respectiva pasta. Para converter o formato de dados brutos, instale primeiro o software ProteoWizard. Sob o caminho de instalação ProteoWizard, digite msconvert.
exe, seguido pelos parâmetros específicos para converter o formato de dados brutos em formato mzXML. Novamente, usando msconvert. exe converta esses dados em formato MGF e armazene-os na pasta MGF.
Para preparar a biblioteca espectral de referência para os metabólitos, acesse a página web do GNPS. Pesquise a palavra-chave NIST, clique em exibir os detalhes e baixe a biblioteca. Salve a biblioteca na pasta do banco de dados.
Baixe o programa XY-Meta. Encontre o arquivo de configuração do parâmetro na pasta config e altere seu conteúdo conforme descrito no protocolo de texto. Defina o tipo de adutos como uma lista na pasta aduto.
Realize a identificação metabólica e o falso controle da taxa de detecção usando o comando XY-Meta.exe. Baixe e instale o pacote de software metaX. Em seguida, edite a lista de amostras.
arquivo txt para especificar a amostra e seus dados correspondentes de espectrometria de massa, conforme descrito no protocolo de texto. Use o arquivo R fornecido com o protocolo de texto para executar o script para quantificação de grupos simulados e tipos selvagens usando o software metaX. Verifique a pasta de saída na qual os resultados da análise quantitativa são armazenados, como o gráfico PCA.
Em seguida, modifique os parâmetros no script R para anotar os picos na análise qualitativa e quantitativa usando identificações metabólitos, a fim de integrar os resultados e executar o script R. Parcelas de caixa de metabólitos quantificados mostraram que a distribuição geral de amostras saudáveis e de doenças foi semelhante com baixa flutuação dos valores médios. Apenas 3,39% dos metabólitos tinham mais de 30% dos valores faltantes.
O enredo de análise de componentes de princípios das amostras de ambos os grupos mostrou que metaX aumentou notavelmente a proporção dos metabólitos com CV inferior a 0,3. Um diagrama de Venn de metabólitos detectados diferencialmente a partir de três métodos de teste estatísticos revelou 119 metabólitos comuns. O tempo de retenção e a massa por distribuição de carga de todos os metabólitos anotados foram plotados com uma falsa taxa de descoberta inferior a 0,01, mostrando seis metabólitos significativos e detectados diferencialmente.
É importante limitar o tempo para testes de fluxo de trabalho. Lembre-se, não selecione muitas amostras para análise e mantenha pelo menos duas amostras em cada grupo. Esta técnica permite o controle de qualidade da identificação metabolizada a partir de dados independentes de aquisição de dados, construindo uma biblioteca espectral de espectro de referência mais robusta usando os resultados de correspondência de espectro com base no controle FDR.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo permite a análise qualitativa e quantitativa do metaboloma não direcionado utilizando controle de qualidade de FDR para reduzir falsos positivos na identificação de metabólitos. O fluxo de trabalho integra o XY-Meta para uma avaliação mais precisa do FDR por meio de uma estratégia alvo-armadilha.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Metabolômica
- Análise bioquímica
- Controle da taxa de falsa descoberta
Antecedentes
- A metabolômica não direcionada é crucial para a descoberta de biomarcadores.
- O controle de FDR é essencial para a identificação precisa de metabólitos.
- O XY-Meta utiliza uma estratégia alvo-armadilha para melhorar a análise.
- O MetaX é empregado para a quantificação de metabólitos após a identificação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um fluxo de trabalho robusto para análise metabolômica não direcionada.
- Aprimorar a precisão na identificação de metabólitos.
- Fornecer um protocolo que possa ser replicado por pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Integração do XY-Meta e do metaX para análise metabolômica.
- Geração de uma biblioteca espectral falsa a partir de espectros de acesso aberto.
- Aplicação do controle de FDR para filtrar falsos positivos.
- Quantificação de metabólitos utilizando o metaX após identificação.
Resultados Principais
- O fluxo de trabalho reduz efetivamente os falsos positivos na identificação de metabólitos.
- Os pesquisadores podem descobrir biomarcadores de forma confiável usando este método.
- A estratégia alvo-falsificado melhora a robustez da análise.
- Recomenda-se várias execuções do pipeline com os parâmetros padrão.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem abrangente à análise metabolômica.
- Ele aumenta a confiabilidade da identificação de metabólitos.
- Recomenda-se que os pesquisadores utilizem este fluxo de trabalho em seus estudos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A metabolômica não direcionada de alto rendimento gera vastos conjuntos de dados espectrais, o que desafia a qualidade dos dados e aumenta o risco de falsos positivos na identificação de metabólitos. A integração do controle de FDR por meio de uma estratégia alvo-decoy aumenta a confiança preditiva e apoia a descoberta robusta de biomarcadores em estágios críticos iniciais de descoberta e identificação de compostos promissores. Este fluxo de trabalho permite análise escalável e reprodutível do metaboloma, impactando diretamente a triagem de portfólios e a continuidade da pesquisa translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogar rigorosamente vias metabólicas por meio da identificação controlada por FDR.
- Reduz a ambiguidade mecanicista ao filtrar falsos positivos em conjuntos de dados não direcionados.
- Apoia a validação funcional de alvos e a priorização de biomarcadores candidatos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara painéis validados de metabólitos para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Padroniza resultados quantitativos para avaliação reprodutível de compostos.
- Facilita o desenvolvimento de ensaios escalonáveis com métricas robustas de controle de qualidade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a anotação de metabólitos com sistemas relevantes para doenças, visando a descoberta translacional de biomarcadores.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, integrando dados qualitativos e quantitativos.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco com base em perfis de metabólitos de alta confiança.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho integrado abrange a fase inicial de descoberta até a pesquisa pré-clínica, apoiando a verificação de hipóteses, a elucidação de vias e a identificação robusta de biomarcadores.
- Biologia da Descoberta: Fornece identificação de metabólitos controlada por FDR para esclarecer mecanismos biológicos.
- Triagem: Fornece dados quantitativos reprodutíveis de metabólitos para prontidão de ensaios.
- Análises: Gera medidas estatísticas, como gráficos de PCA e distribuições de CV, para comparação de condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta perfis de metabólitos anotados a modelos de doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e acessível pela nuvem para análises repetidas e escaláveis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz descobertas falsas na identificação de metabólitos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho e permite a reprodutibilidade em grandes conjuntos de dados.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos a biomarcadores.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de dados de espectrometria de massas e análise estatística.
- Necessita de acesso a bibliotecas espectrais, plataformas de análise baseadas em nuvem e software compatível (XY-Meta, metaX).
- Exige padronização entre equipes nos formatos de dados e configurações de parâmetros.
- Adaptável a diversos tipos de amostras e sistemas modelo com configuração apropriada.
- A produtividade da análise e o tamanho da amostra devem ser gerenciados para garantir eficiência do fluxo de trabalho e qualidade dos dados.
