Name: Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda o ensaio SiMPull para quantificar fosforilação de proteínas em nível de molécula única. Este método otimiza marcação de anticorpos e reduz autofluorescência, superando técnicas tradicionais como western blot.

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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 para DSL. A EMB foi apoiada através do programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e jar pelo programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos o uso do recurso compartilhado de microscopia de fluorescência do Centro de Câncer Integral da Universidade do Novo México, apoiado pelo NIH P30CA118100. Queremos reconhecer os Drs. Ankur Jain e Taekijip Ha, cujo desenvolvimento original do SiMPull inspirou este trabalho. ES-C apresentar endereço: Grupo de Imunodinâmica, Laboratório de Imunologia Integrativa do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional de Câncer, Bethesda

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
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<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui foi otimizado para permitir medições quantitativas de fosforilação receptora no nível único da proteína. Várias modificações simples, mas importantes no protocolo SiMPull foram desenvolvidas que melhoraram a confiabilidade da medição para detecção de fosfo-tyrosina, incluindo redução da autofluorescência com tratamento NaBH4 e pós-fixação da amostra para evitar a dissociação de anticorpos. O uso da máscara de canal verde para identificar os locais do receptor para o cálculo da colocal...

A sinalização associada à membrana é ajustada por uma combinação de ativação do receptor de membrana induzida por ligante e recrutamento de proteínas acessórias a jusante que propagam o sinal. A fosforilação das tyrosinas-chave nas caudas citoplasmáticas receptoras é fundamental para iniciar a formação de complexos de sinalização, ou signalossomos 1,2. Portanto, uma questão importante na biologia é como os padrões de fosforilação são criados e mantidos para recrutar parceiros de sinalização e ditar resultados celulares. Isso inclui compreender a heterogeneidade da fosforilação receptora, tanto em abundância quanto nos padrões específicos de fosfotimosina que podem fornecer um meio de manipular saídas de sinalização ditando a composição do sinalosome 3,4,5,6,7. No entanto, existem limitações nos métodos atuais para interrogar a fosforilação proteica. A análise de manchas ocidentais é excelente para descrever tendências de fosforilação proteica, mas é semi-quantitativa8 e não fornece informações sobre a heterogeneidade do sistema porque milhares a milhões de receptores são mediados juntos. Embora as manchas ocidentais permitam sondar uma amostra usando anticorpos específicos do fosfo para tirasinas específicas, elas não podem fornecer informações sobre padrões de fosforilação multisite dentro da mesma proteína. A fosfoproteômica quantitativa relata a abundância de fosfotyrosina, mas há limitações para detectar fosforilação multisite, pois os resíduos de interesse precisam estar localizados dentro do mesmo peptídeo (tipicamente 7-35 aminoácidos) que é gerado pela digestão enzimática 9,10,11.
Para superar as limitações mencionadas acima, o ensaio de uma única molécula pull-down (SiMPull) foi adaptado para quantificar os estados de fosforilação de receptores intactos no nível de molécula única. O SiMPull foi demonstrado pela primeira vez como uma poderosa ferramenta para interrogar complexos macromoleculares por Jain et al.12,13. No SiMPull, os complexos macromoleculares foram imunoprecipitados (IP) em tampas de vidro funcionalizadas por anticorpos e, em seguida, analisados através de microscopia de molécula única para número de subunidade proteica e co-IP com componentes complexos12. Uma modificação de Kim et al.14, denominada SiMBlot, foi a primeira a usar uma variação de SiMPull para analisar a fosforilação de proteínas desnaturadas. O protocolo SiMBlot baseia-se na captura de proteínas de superfície celular biotinilada usando tampas revestidas de NeutrAvidin, que são então sondadas para fosforilação com rotulagem de anticorpos específicos do fosfo14. Apesar desses avanços, foram necessárias melhorias para tornar a quantificação da modificação pós-transinal mais robusta e aplicável a uma gama mais ampla de proteínas.
O presente protocolo descreve uma abordagem simpull otimizada que foi usada para quantificar padrões de fosforilação do receptor de fator de crescimento epidérmico intacto (EGFR) em resposta a uma série de condições de ligantes e mutações oncogênicas15. Embora este trabalho se concentre no EGFR, essa abordagem pode ser aplicada a qualquer receptor de membrana e proteínas citosóicas de interesse (POI), para as quais anticorpos de qualidade estão disponíveis. O protocolo inclui etapas para reduzir a autofluorescência da amostra, um projeto de matriz de amostra que requer volume mínimo de amostra com preparação simultânea de até 20 amostras e otimização das condições de rotulagem e fixação de anticorpos. Algoritmos de análise de dados foram desenvolvidos para detecção e quantificação de proteínas fosfoiladas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Tampão</td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultura de tecidos</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Armazenamento de vidro/matrizes gravadas piranha</td></tr><tr><td>15 mL tubo</td><td></td><td></td><td></td>cônico</tr><tr><td>16% Paraformaldeído Aquoso Solução</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>Tubo</td></tr><tr><td></td><td></td><td>cônico perigoso de 50 mL</td><td>Funcionalizado Armazenamento de vidro / reutilização de KOH</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7,2 / 150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>Componente tampão de lise</td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% Glutaraldeído Solução aquosa</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Acetona Perigosa (C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Perigoso</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>EGF Humano Recombinante Livre de Animais</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>EGFR Anti-Humano (Domínio Externo) &ndash; Biotina</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p-Tyr Anticorpo (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bath-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotina-PEG-SVA, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>de soro bovinoGold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Tyrode's Buffer</td></tr><tr><td>Component Buchner funnel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode's Buffer</td></tr><tr><td>Component Cell Scraper</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Filtragem Cônica</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 60 #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>Câmera emCCD</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>Fusion 360 inativado</td> por calor software <td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfato</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (CH3COOH)</td> <td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>perigoso</td></tr><tr>Pipetas <td></td><td></td><td></td><td>sorológicas de vidro</td></tr><tr><td>Glass Stir Rod</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode's Buffer</td></tr><tr><td>Component Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Lysis Buffer Component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>TyrodeÁcido</td></tr><tr><td>clorídrico (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Peróxido</td></tr><tr><td>de hidrogênio perigoso (H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Componente de tampão de lise</td></tr><tr><td>ImmEdge Caneta de barreira hidrofóbica</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F óleo de imersão</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>linha</td><td></td><td></td><td></td>de vácuo interna</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnessium hexahidratado (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning toolbox</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Água</td></tr><tr><td>Milli-Q</td> <td>perigosa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits de rotulagem de anticorpos de corante CF Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Kit de conjugação sugerido</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-succinimidil valerato, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>N- (2-aminoetil) -3-aminopropiltrimetoxissilano</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>Nanogrid</td></tr><tr><td></td><td>Perigoso Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotina Proteína de Ligação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio (gás comprimido)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA GPU com CUDA</td><td></td><td></td><td>Procure compatibilidade em https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Microscópio Olympus iX71 Filme</td> de Vedação <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Placa Quente Analógica</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Receptor Fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) Tecnologia</td><td>de Sinalização de Células</td> mAb de Camundongo <td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Componente Tampão Tyrode</td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>Perigoso</td></tr><tr><td>Premium PLA Filament, 1,75 mm de diâmetro</td><td>Elevação 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>Faixa de temperatura de impressão: 205-235 &deg; C</td></tr><tr><td>Pro2 Impressora 3D</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L copo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 mL garrafas de armazenamento</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>CH3OH/C3H6O reutilização</td></tr><tr><td>Pyrex 250 mL béqueres</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 4 L Quad-view</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imagem Splitter</td><td>Photometrics</td><td>Modelo QV2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de emissão Semrock: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), vermelho (600/37 nm), vermelho distante (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipeta sorológica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sorológicas atingem o pacote</td><td></td><td></td> de análise de molécula única <td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Borohidreto de Sódio Perigoso (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Componente tampão</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Ativar por ciclo sucessivo de calor e pH</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio (Na3VO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico perigoso (H2SO4)</td><td>Microesferas</td><td>TetraSpeck Perigosas</td>Millipore Sigma <td>258105</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>multifluorescentes</td></tr><tr><td>base Tris (Trizma)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

A fosforilação é uma modificação pós-transinal necessária que regula a função proteica e direciona os resultados da sinalização celular. Os métodos atuais para medir a fosforilação proteica não podem preservar a heterogeneidade na fosforilação entre proteínas individuais. O ensaio de tração única de moléculas (SiMPull) foi desenvolvido para investigar a composição de complexos macromoleculares através da imunoprecipitação de proteínas em um deslizamento de vidro seguido de imagem de molécula única. A técnica atual é uma adaptação do SiMPull que fornece quantificação robusta do estado de fosforilação de receptores de membrana de comprimento total no nível de molécula única. A imagem de milhares de receptores individuais dessa forma permite quantificar padrões de fosforilação de proteínas. O presente protocolo detalha o procedimento SiMPull otimizado, desde a preparação da amostra até a imagem. A otimização dos protocolos de preparação de vidro e fixação de anticorpos melhora ainda mais a qualidade dos dados. O protocolo atual fornece código para a análise de dados de molécula única que calcula a fração de receptores fosforilados dentro de uma amostra. Enquanto este trabalho se concentra na fosforilação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o protocolo pode ser generalizado para outros receptores de membrana e moléculas de sinalização citostónica.

Um desenho animado retratando o processo SiMPull é mostrado na Figura 1A. As manchas são funcionalizadas usando NeutrAvidin como uma âncora para anticorpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisatos totais de proteínas. Após a lavagem da proteína não ligada, os receptores fosforilalatados são rotulados com um anticorpo anti-fosfotyrosina (anti-PY)15. A Figura 1B mostra uma imagem da matriz hidrofóbica, onde várias amostras p...

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Este protocolo SiMPull permite uma quantificação da fosforilação proteica melhorando as condições de rotulagem e fixação de anticorpos, reduzindo a autofluorescência encontrada no canal verde e fornecendo algoritmos robustos de análise de moléculas únicas. A principal vantagem do SiMPull é que ele nos permite interrogar o estado de fosforilação de proteínas intactas individuais. Com este método, podemos obter novas informações que não são acessíveis através de técnicas tradicionais, como manchas ocidentais e análise de especificações de massa.Temos uma equipe de pesquisadores para ajudar a demonstrar o protocolo. Primeiro, Julian Rojo mostrará como gravar o vidro da capa. Rachel Grattan, então, mostrará os passos para o revestimento do vidro da capa.E Elizabeth Bailey mostrará como desenhar a matriz e amostras de imagens. Para começar, a piranha grava a tampa agitando suavemente o béquer de reação a cada cinco minutos por 30 minutos. Neutralizou a solução de piranha, adicionando gradualmente uma base fraca.Com uma haste de vidro, transfira a tampa gravada em um funil Buchner e enxágue por cinco minutos em água dupla destilada. Em seguida, coloque a tampa em um frasco de vidro Coplin e cubra com metanol. Sele a tampa com um filme de vedação e sonicate de banho por 10 minutos.Após a sônicação, esvazie o metanol em uma garrafa de armazenamento de vidro. Repita este passo com acetona. Enxágüe os deslizamentos da tampa três vezes com água dupla destilada no frasco de Coplin.Escorra a água dos deslizamentos de cobertura e seque-os acenando através da chama de um queimador bunsen. Coloque os deslizamentos de tampa em um frasco de Coplin seco. Em seguida, adicione solução de amino silano ao frasco coplin para realizar a silanização de deslizamento de tampa.Cubra e aplique um filme de vedação para proteger contra a luz. Enxágüe os deslizamentos de cobertura com metanol e descarte a solução usada. Novamente, enxágue os deslizamentos de cobertura três vezes com água dupla destilada por dois minutos cada.Afaste o excesso de umidade e o ar seque completamente por 10 minutos. Em seguida, desenhe a matriz de grade com uma caneta de barreira hidrofóbica. Marque um identificador no deslizamento da tampa para identificar a orientação adequada.Depois que a tinta secar, coloque a tampa em uma câmara umidificada. Resuspende 153 miligramas de mPEG e 3,9 miligramas de biotina-PEG em 609 microlitres de 10 milimólars de bicarbonato de sódio e vórtice. Centrifugar a 10.000 x g de um minuto à temperatura ambiente para remover bolhas.Aplique de 10 a 15 microlitadores desta solução por quadrado para cobrir completamente a matriz sem transbordar. Armazene os deslizamentos de cobertura na câmara de umidade no escuro por três a quatro horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave os deslizamentos de cobertura mergulhando-os por 10 segundos sequencialmente em três béquers cheios com água dupla destilada.Remova toda a umidade da tampa usando gás nitrogênio. Guarde os deslizamentos de cobertura para trás em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de nitrogênio e vedação com um filme de vedação. Enrole o tubo com filme de vedação e coloque-o a menos 20 graus Celsius.Remova as matrizes funcionalizadas biotina-PEG do congelador e equilibre-as à temperatura ambiente. Coloque o deslizamento de tampa com a matriz voltada para cima sobre um prato de cultura de tecido de 100 milímetros forrado com filme de vedação. Incubar cada quadrado da matriz com 10 miligramas por mililitro de boroidido de sódio na PBS por quatro minutos em temperatura ambiente.Lave três vezes com PBS. Em seguida, incubar com 0,2 miligramas por mililitro de NeutrAvidin em T50 por cinco minutos, seguido de lavagem três vezes com T50 BSA. Repita a incubação com dois microgramas por mililitro de anticorpo específico POI biotinitado em T50 BSA por 10 minutos seguido de lavagem.Primeiro, degelo misture o lise por pipetação. Diluir um microliter do lysate em 100 microliters de gelo T50 BSA PPI. Incubar o lise na matriz por 10 minutos, seguido de lavagem.Prepare o anticorpo antifosfotyrosina conjugado AF647 no PPI T50 BSA gelado e incuba na matriz por uma hora. Deposite uma gota de óleo no objetivo. Coloque a nanogrid no palco para imagens.Usando luz branca transmitida, concentre-se no padrão da grade. Adquira uma série de 20 imagens da grade, garanta que os pixels não estejam saturados e salve a série de imagens como fiduciária. Desfoque a nanogrid para criar um padrão arejado, adquira uma série de 20 imagens para obter calibrações e salvar a imagem como ganho.Em seguida, adquira uma série de 20 imagens para deslocamento da câmera bloqueando toda a luz para a câmera e salve o fundo das imagens. Para adquirir imagens simples, primeiro, limpe o objetivo do óleo e deposite óleo adicional no objetivo. Fixar a matriz de deslizamento de tampa no estágio do microscópio.Adquira imagens para cada amostra, primeiro no canal vermelho distante, seguido por arremessos de comprimento de onda mais baixos. Verifique o nível do buffer a cada 30 a 45 minutos e reabasteca conforme necessário. Utilizando esta técnica, o EGFR-GFP foi capturado a partir de lises totais de proteínas.A autofluorescência da tinta hidrofóbica foi usada como guia para encontrar o plano focal da amostra. Imagens de dados brutos foram adquiridas com canais espectrais separados no chip da câmera. Uma sobreposição dos canais verde e vermelho foi examinada para aquisição de dados.O registro do canal foi realizado em imagens adquiridas da nanogrid. Uma sobreposição de imagens fiduciárias mostrou registro incompleto. O alinhamento foi feito aplicando uma transformação média ponderada local nas coordenadas do canal vermelho e verde, que foi usada para registrar os dados subsequentes do SiMPull.Emitedores únicos acima da contagem de fótons de fundo dos canais GFP e AF647 foram encaixotados e a localização gaussiana foi realizada para identificar os locais. A colocalização do EGFR-GFP em um F647 foi feita para identificar receptores fosforilalatados. E a porcentagem de colocalização foi usada para determinar a fração de receptores fosfoilados.As detecções de fundo foram reduzidas quando o vidro gravado de piranha foi tratado com boroidido de sódio. A ligação robusta de EGFR-GFP no lysate foi observada com uma ligação PY99-AF647 mínima não específica, mostrando retenção da funcionalização da superfície utilizando essa técnica. O SiMPull fornece informações sobre fosforilação de proteínas e pode abordar uma ampla gama de questões de auto-sinalização.Isso pode melhorar nossa compreensão da sinalização em estados normais e de doenças.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

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