Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Este protocolo SiMPull permite uma quantificação da fosforilação proteica melhorando as condições de rotulagem e fixação de anticorpos, reduzindo a autofluorescência encontrada no canal verde e fornecendo algoritmos robustos de análise de moléculas únicas. A principal vantagem do SiMPull é que ele nos permite interrogar o estado de fosforilação de proteínas intactas individuais. Com este método, podemos obter novas informações que não são acessíveis através de técnicas tradicionais, como manchas ocidentais e análise de especificações de massa.

Temos uma equipe de pesquisadores para ajudar a demonstrar o protocolo. Primeiro, Julian Rojo mostrará como gravar o vidro da capa. Rachel Grattan, então, mostrará os passos para o revestimento do vidro da capa.

E Elizabeth Bailey mostrará como desenhar a matriz e amostras de imagens. Para começar, a piranha grava a tampa agitando suavemente o béquer de reação a cada cinco minutos por 30 minutos. Neutralizou a solução de piranha, adicionando gradualmente uma base fraca.

Com uma haste de vidro, transfira a tampa gravada em um funil Buchner e enxágue por cinco minutos em água dupla destilada. Em seguida, coloque a tampa em um frasco de vidro Coplin e cubra com metanol. Sele a tampa com um filme de vedação e sonicate de banho por 10 minutos.

Após a sônicação, esvazie o metanol em uma garrafa de armazenamento de vidro. Repita este passo com acetona. Enxágüe os deslizamentos da tampa três vezes com água dupla destilada no frasco de Coplin.

Escorra a água dos deslizamentos de cobertura e seque-os acenando através da chama de um queimador bunsen. Coloque os deslizamentos de tampa em um frasco de Coplin seco. Em seguida, adicione solução de amino silano ao frasco coplin para realizar a silanização de deslizamento de tampa.

Cubra e aplique um filme de vedação para proteger contra a luz. Enxágüe os deslizamentos de cobertura com metanol e descarte a solução usada. Novamente, enxágue os deslizamentos de cobertura três vezes com água dupla destilada por dois minutos cada.

Afaste o excesso de umidade e o ar seque completamente por 10 minutos. Em seguida, desenhe a matriz de grade com uma caneta de barreira hidrofóbica. Marque um identificador no deslizamento da tampa para identificar a orientação adequada.

Depois que a tinta secar, coloque a tampa em uma câmara umidificada. Resuspende 153 miligramas de mPEG e 3,9 miligramas de biotina-PEG em 609 microlitres de 10 milimólars de bicarbonato de sódio e vórtice. Centrifugar a 10.000 x g de um minuto à temperatura ambiente para remover bolhas.

Aplique de 10 a 15 microlitadores desta solução por quadrado para cobrir completamente a matriz sem transbordar. Armazene os deslizamentos de cobertura na câmara de umidade no escuro por três a quatro horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave os deslizamentos de cobertura mergulhando-os por 10 segundos sequencialmente em três béquers cheios com água dupla destilada.

Remova toda a umidade da tampa usando gás nitrogênio. Guarde os deslizamentos de cobertura para trás em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de nitrogênio e vedação com um filme de vedação. Enrole o tubo com filme de vedação e coloque-o a menos 20 graus Celsius.

Remova as matrizes funcionalizadas biotina-PEG do congelador e equilibre-as à temperatura ambiente. Coloque o deslizamento de tampa com a matriz voltada para cima sobre um prato de cultura de tecido de 100 milímetros forrado com filme de vedação. Incubar cada quadrado da matriz com 10 miligramas por mililitro de boroidido de sódio na PBS por quatro minutos em temperatura ambiente.

Lave três vezes com PBS. Em seguida, incubar com 0,2 miligramas por mililitro de NeutrAvidin em T50 por cinco minutos, seguido de lavagem três vezes com T50 BSA. Repita a incubação com dois microgramas por mililitro de anticorpo específico POI biotinitado em T50 BSA por 10 minutos seguido de lavagem.

Primeiro, degelo misture o lise por pipetação. Diluir um microliter do lysate em 100 microliters de gelo T50 BSA PPI. Incubar o lise na matriz por 10 minutos, seguido de lavagem.

Prepare o anticorpo antifosfotyrosina conjugado AF647 no PPI T50 BSA gelado e incuba na matriz por uma hora. Deposite uma gota de óleo no objetivo. Coloque a nanogrid no palco para imagens.

Usando luz branca transmitida, concentre-se no padrão da grade. Adquira uma série de 20 imagens da grade, garanta que os pixels não estejam saturados e salve a série de imagens como fiduciária. Desfoque a nanogrid para criar um padrão arejado, adquira uma série de 20 imagens para obter calibrações e salvar a imagem como ganho.

Em seguida, adquira uma série de 20 imagens para deslocamento da câmera bloqueando toda a luz para a câmera e salve o fundo das imagens. Para adquirir imagens simples, primeiro, limpe o objetivo do óleo e deposite óleo adicional no objetivo. Fixar a matriz de deslizamento de tampa no estágio do microscópio.

Adquira imagens para cada amostra, primeiro no canal vermelho distante, seguido por arremessos de comprimento de onda mais baixos. Verifique o nível do buffer a cada 30 a 45 minutos e reabasteca conforme necessário. Utilizando esta técnica, o EGFR-GFP foi capturado a partir de lises totais de proteínas.

A autofluorescência da tinta hidrofóbica foi usada como guia para encontrar o plano focal da amostra. Imagens de dados brutos foram adquiridas com canais espectrais separados no chip da câmera. Uma sobreposição dos canais verde e vermelho foi examinada para aquisição de dados.

O registro do canal foi realizado em imagens adquiridas da nanogrid. Uma sobreposição de imagens fiduciárias mostrou registro incompleto. O alinhamento foi feito aplicando uma transformação média ponderada local nas coordenadas do canal vermelho e verde, que foi usada para registrar os dados subsequentes do SiMPull.

Emitedores únicos acima da contagem de fótons de fundo dos canais GFP e AF647 foram encaixotados e a localização gaussiana foi realizada para identificar os locais. A colocalização do EGFR-GFP em um F647 foi feita para identificar receptores fosforilalatados. E a porcentagem de colocalização foi usada para determinar a fração de receptores fosfoilados.

As detecções de fundo foram reduzidas quando o vidro gravado de piranha foi tratado com boroidido de sódio. A ligação robusta de EGFR-GFP no lysate foi observada com uma ligação PY99-AF647 mínima não específica, mostrando retenção da funcionalização da superfície utilizando essa técnica. O SiMPull fornece informações sobre fosforilação de proteínas e pode abordar uma ampla gama de questões de auto-sinalização.

Isso pode melhorar nossa compreensão da sinalização em estados normais e de doenças.