Modelo de Epilepsia de Etiologia Infecciosa utilizando o Vírus da Encefalomielite Murina de Theiler
23 de junho de 2022
A infecção intracerebral com o vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) em camundongos C57BL/6 replica muitos dos sintomas clínicos iniciais e crônicos da encefalite viral e subsequente epilepsia em pacientes humanos. Este artigo descreve a infecção viral, sintomas e histopatologia do modelo TMEV.
O modelo TMEV é uma das primeiras plataformas experimentais a permitir a investigação dos mecanismos de desenvolvimento de crises como consequência da infecção do SNC. As infecções do SNC aumentam significativamente o risco de epilepsia. Este modelo ajuda a identificar potenciais alvos terapêuticos e compostos para pacientes em risco.
Os experimentadores devem ser treinados para trabalhar com camundongos. A injeção do vírus pode ser muito bem praticada injetando corante em animais mortos para alcançar precisão e rotina suficientes. Quem demonstrará o procedimento será Laura Bell, aluna de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, remova a tampa da seringa de insulina e adicione tubos de polietileno como um colar ao redor da agulha para garantir uma profundidade de injeção adequada de 2,5 milímetros. Em seguida, submerja a seringa em etanol por 30 minutos e coloque a seringa sob luz UV por 30 minutos. Em seguida, coloque a tampa de volta na agulha e envolva a seringa em uma bolsa esterilizante.
Tape a bolsa para fechá-la e rotule com a data de preparo. Para realizar a injeção de vírus, obtenha alíquotas da cepa Daniels de TMEV do freezer de 80 graus Celsius negativos. Descongelar o vírus e mantê-lo no gelo.
Em seguida, carregue a seringa com a suspensão do vírus. Depois, limpe a bancada com desinfetante e trabalhe sob um absorvedor de fumos. Transfira o camundongo anestesiado da caixa de anestesia sob o capô e verifique a tolerância cirúrgica realizando uma pinça do dedo do pé.
Em seguida, limpe a cabeça do animal com uma almofada de álcool e incline a cabeça do rato ligeiramente para a esquerda para que o local de injeção esteja apontando para cima. Puxe a pele um pouco para trás e insira a agulha na cabeça. Em seguida, injetar 20 microlitros por via intracorídica a uma profundidade de 2,5 milímetros na região temporal do hemisfério direito.
Deixe a seringa no lugar por cinco a 15 segundos e verifique se há vazamento da injeção ou se bolhas de ar são vistas, em seguida, prepare uma nova seringa. Ao retirar cuidadosamente a seringa, gire-a ligeiramente. Em seguida, transfira o animal para uma nova gaiola, que é colocada meio ligado, metade de uma almofada de aquecimento durante a recuperação da anestesia.
E não deixe os animais desassistidos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Primeiro, leve todas as gaiolas para o banco e observe os animais para convulsões duas vezes ao dia durante a fase leve. Pontuar a atividade convulsiva por uma escala de corrida modificada e relatar o número e a intensidade das crises.
Em seguida, deslize uma caneta pela gaiola para fazer algum barulho e transfira cada animal para outra caixa e vice-versa. Para animais que não se agarraram espontaneamente ou após agitação suave da gaiola, desencadeie convulsões por manuseio mais intenso enquanto vira cuidadosamente o rato, virando-o em sua cauda da esquerda para a direita. Observe novamente o comportamento das crises em cada animal e repita o processo para as gaiolas subsequentes.
As crises comportamentais foram registradas se ocorreram durante injeções de drogas ou durante as sessões subsequentes de monitoramento do manuseio das crises. Os dados observados foram apresentados como um mapa de calor criado pela representação dos estágios convulsivos em diferentes cores. Através do registro do EEG, vários eventos epilépticos podem ser identificados na fase crônica, meses após a infecção por TMEV.
A quantificação da degeneração hipocampal e dos camundongos infectados com TMEV epiléptico mostra uma diminuição significativa na área hipocampal e um aumento correspondente na área ventricular de camundongos TMEV em comparação com controles. A análise imuno-histológica pode fornecer informações sobre vários parâmetros, como a presença de células inflamatórias. Neste caso, cortes contendo o hipocampo foram corados com anticorpos para marcar linfócitos T.
Animais infectados simulados não mostram infiltração de células T, enquanto infiltração moderada foi observada na maioria dos camundongos infectados com TMEV. Alguns dos camundongos infectados apresentam infiltração severa de linfócitos T. Nem todos os animais apresentam convulsões durante cada período de observação.
Além disso, a maior incidência de convulsões ocorre nos dias cinco e seis após a inoculação. Usamos o modelo TMEV para testar a eficácia de novos medicamentos anticonvulsivantes contra convulsões induzidas por infecção. Ensaios que investigam alterações comportamentais comórbidas e alterações eletrofisiológicas também podem ser avaliados.
O modelo TMEV forneceu à comunidade de pesquisa em epilepsia o primeiro modelo de epilepsia do lobo temporal induzido por infecção do SNC, permitindo a investigação dos mecanismos subjacentes da epileptogênese após infecção.
Visão Geral
Este estudo investiga o modelo do vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) em camundongos C57BL/6, que replica sintomas de encefalite viral humana e epilepsia. A pesquisa tem como objetivo compreender os mecanismos de desenvolvimento de convulsões resultantes de infecções no SNC e avaliar possíveis alvos terapêuticos para o manejo da epilepsia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Virologia
- Pesquisa em Epilepsia
Contexto
- A infecção por TMEV leva a sintomas significativos agudos e crônicos em camundongos.
- Infecções no SNC aumentam o risco de desenvolver epilepsia.
- O modelo TMEV facilita a investigação dos mecanismos subjacentes às convulsões.
- É necessário treinamento para as técnicas adequadas de manipulação e injeção do vírus.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o modelo de TEV para epilepsia induzida por infecção no SNC.
- Identificar gatilhos de crise e candidatos terapêuticos.
- Compreender as alterações comportamentais e eletrofisiológicas após a infecção.
Métodos Utilizados
- A plataforma experimental principal envolve a injeção do vírus TMEV em camundongos C57BL/6.
- O modelo biológico foca nas respostas do SNC à infecção viral.
- As lesões e intervenções incluem o monitoramento da atividade convulsiva após a infecção.
- Os passos principais envolvem a preparação do vírus, a injeção e o monitoramento da atividade convulsiva.
- A eletroencefalografia (EEG) é utilizada para avaliar as características das convulsões.
Resultados Principais
- Evidências mostram degeneração significativa do hipocampo em camundongos infectados com TMEV.
- A caracterização da infiltração de linfócitos T no hipocampo revelou graus variados de resposta inflamatória.
- O modelo ilustra o início e os gatilhos das crises epilépticas, culminando na identificação da eficácia de medicamentos anticonvulsivantes.
- A frequência de crises atinge o pico por volta dos dias cinco e seis após a inoculação.
Conclusões
- Esta pesquisa estabelece o modelo TMEV como uma plataforma essencial para estudos de epilepsia.
- Os resultados destacam implicações para a compreensão dos mecanismos da epilepsia induzida por infecção no SNC.
- Os conhecimentos obtidos podem influenciar estratégias terapêuticas para o manejo da epilepsia após infecção.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem da epilepsia de etiologia infecciosa com a plataforma TMEV permite a desmistificação mecanicista e a validação de alvos para epileptogênese induzida por infecção do SNC. Este modelo oferece confiança preditiva na descoberta inicial e na pesquisa translacional ao replicar fenótipos de crises agudas e crônicas relevantes para a doença humana. Seu uso facilita a triagem e a priorização de portfólios de novos compostos anticonvulsivantes para populações de pacientes de alto risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos epileptogênicos induzidos por infecção e a elucidação de vias associadas.
- Apoia a desmistificação biológica por meio da modelagem de fenótipos de convulsão clinicamente relevantes após infecção no SNC.
- Facilita a validação funcional de alvos para candidatos a fármacos anticonvulsivantes em um sistema relevante à doença.
- Oferece confiança preditiva para o avanço de compostos direcionados à epilepsia induzida por infecção.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara modelos animais validados para monitoramento quantitativo de convulsões e testes de eficácia de compostos.
- Padroniza a pontuação de convulsões e leituras baseadas em EEG para obter resultados de ensaio reproduzíveis.
- Permite triagem em larga escala de novos terapêuticos contra convulsões induzidas por infecção.
- Oferece avaliação confiável dos efeitos dos compostos sobre parâmetros comportamentais e eletrofisiológicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se ao desenvolvimento de biomarcadores translacionais por meio de desfechos histopatológicos e neuroinflamatórios.
- Garante a continuidade da descoberta mecanicista até a validação pré-clínica na epilepsia induzida por infecção.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para terapêuticas direcionadas ao SNC.
- Oferece desvio preditivo de riscos biológicos tardios em portfólios de epilepsia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo TMEV integra desde a descoberta inicial até a identificação de alvos e validação pré-clínica para epilepsia induzida por infecção.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a ligação entre infecção e epileptogênese, bem como a análise de vias mecanicistas.
- Triagem: Oferece quantificação reprodutível de crises e saídas padronizadas de comportamento e EEG para triagem de compostos.
- Análises: Fornece métricas quantitativas de frequência e intensidade de crises, além de métricas histopatológicas para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais a estudos pré-clínicos de biomarcadores e eficácia em um contexto relevante para a doença.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para pesquisas contínuas sobre anticonvulsivos e neuroinflamação em diversos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de epilepsia induzida por infecção.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho padronizados, escaláveis e reprodutíveis para monitoramento de crises e testes de compostos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao focar em desfechos clinicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos terapêuticos direcionados ao sistema nervoso central.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em modelos de infecção no SNC de camundongos e técnicas de monitoramento de convulsões.
- Exige acesso a instrumentação especializada para análise de EEG e histopatológica.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de pontuação de convulsões e de relato de dados.
- A adaptação entre linhagens de camundongos ou modelos de infecção pode exigir otimização do protocolo.
- As limitações práticas incluem a variabilidade animal e a necessidade de treinamento rigoroso em procedimentos de injeção.
