Name: Isolamento da artéria intrapulmonar e das células musculares lisas para investigar as respostas vasculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a isolar artérias intrapulmonares e células musculares lisas vasculares de ratos para estudar respostas vasculares usando a técnica de banho de órgãos. Este método permite avaliar efeitos de fármacos na fisiologia vascular.

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Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Nacional de Pesquisa da Tailândia, ao Centro de Excelência para Inovação em Química (PERCH-CIC) e à Rede Internacional de Pesquisa (IRN61W0005) por fornecer apoio financeiro, e ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Naresuan, pelo apoio às instalações de pesquisa.

Os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Naresuan (NUACUC), número de protocolo NU-AE620921, para o cuidado e uso de animais para fins científicos.
1. Composição das soluções fisiológicas
<ol><li>Formular a solução de Krebs dissolvendo produtos químicos em água destilada para atingir as concentrações finais da seguinte forma: 122 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, 5 mM de KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO4, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl 2e 11 mM de glicose8. Ajustar o pH da solução a 7,3 com 1 M de NaOH e pré-aquecer a 37 °C antes da utilização.</li>
	<li>Preparar a solução fria de Krebs de forma semelhante, tal como mencionado no passo 1.1. para uso como meio de isolamento do IPA, conforme descrito na etapa 2.</li>
</ol>2. Isolamento da artéria intrapulmonar (AIP)
<ol><li>Anestesiar ratos Wistar machos de 8 semanas de idade com injeção intraperitoneal de tiopental sódico (100 mg/kg)9. Verifique os ratos quanto à sua reação a estímulos dolorosos no sono profundo usando pinça presa aos pés e, em seguida, certifique-se de que os ratos não tenham uma reação de puxar o pé antes de eutanasiá-los na etapa 2.2.</li>
	<li>Abra o tórax médio do rato e o terminal cardíaco com uma tesoura (tamanho 14 cm). Em seguida, localize a raiz do pulmão com uma tesoura (tamanho 14 cm). Colha todo o pulmão cortando com tesoura e mergulhe-o em solução fria de Krebs10,11.</li>
	<li>Corte um único lobo do pulmão com uma tesoura (tamanho 11 cm) e coloque em uma placa de Petri (tamanho 9 cm) com o lado/raiz medial do pulmão voltado para cima (Figura 2A, B). Observe e identifique o alinhamento da veia, brônquios e artéria de cima para baixo (Figura 2B).</li>
	<li>Corte o brônquio longitudinalmente com uma tesoura (tamanho 11 cm). Em seguida, use a pinça (tamanho 11 cm) para agarrar a ponta do brônquio. Disseque suavemente e remova o brônquio e as veias para fora do pulmão. Note que o IPA está sempre alinhado anatomicamente abaixo do brônquio.</li>
	<li>Depois disso, o IPA principal pode ser visualizado (Figura 2C). Use a pinça (tamanho 11 cm) para pegar a ponta do IPA e dissecá-lo cuidadosamente para fora do tecido pulmonar com uma tesoura (tamanho 11 cm).</li>
	<li>Manter o IPA isolado em solução fria de Krebs até que o conjunto do banho do órgão esteja configurado (pH 7,3 e temperatura 4 °C)1 1.</li>
</ol>3. Isolamento das células musculares lisas vasculares (VSMCs)
<ol><li>Isole o IPA conforme descrito anteriormente na etapa 2. Cortar longitudinalmente o ramo principal do IPA longitudinalmente com uma tesoura (tamanho 11 cm) e cortar em pequenas tiras (2 mm) (Figura 3A).</li>
	<li>Imergir as tiras de IPA em um meio de dissociação (DM)10,12 contendo 110 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaH 2 PO4, 10 mM de NaHCO3, 10 mM de HEPES, 0,03 mM de vermelho de fenol, 10 mM de taurina, 0,5 mM de EDTA, 2 mM de MgCl 2, 11 mM de glicose e 0,16 mM de CaCl 2, e ajustar o pH para 7,0 com 1 M de NaOH. Incubar as tiras por 1 h a 4 °C em MS contendo 1 mg/mL de papaína, albumina sérica bovina (BSA) a 0,04% e 0,4 mM 1,4- ditiotreitol (TDT), e incubar a 37 °C por 15 min. Adicionar 1 mg/ml de colagenase tipo 1A em MS e incubar a 37 °C durante 5 min. NOTA: O DM é uma solução utilizada para preservar a viabilidade celular. A papaína e a colagenase tipo 1A são enzimas que quebram as proteínas da matriz extracelular para isolar células individuais. A BSA é uma proteína de albumina sérica usada para a estabilização de enzimas durante o armazenamento e reações enzimáticas. A TDT é um agente redutor utilizado para estabilizar e promover a atividade das enzimas durante o processo de isolamento celular. A taurina é o ácido aminossulfúrico usado para estabilizar a membrana celular e a integridade celular.</li>
	<li>Transfira os tecidos para DM fresco e disperse por trituração suave usando uma pipeta Pasteur de vidro (Figura 3B). Manter a trituração até que os VSMCs isolados se tornem visíveis na solução de banho ao microscópio (Figura 3C). NOTA: VSMCs recém-isolados podem ser usados para estudar fisiologia / fisiopatologia vascular, juntamente com várias investigações experimentais, como modulação por agentes farmacológicos, análise eletrofisiológica patch-clamp, imagens de cálcio, etc. No entanto, o presente estudo enfoca apenas o vasorelaxamento da APP isolada utilizando a técnica de banho de órgãos.</li>
</ol>4. Técnica de banho de órgãos
<ol><li>Isole o IPA conforme descrito anteriormente na etapa 2. Corte o ramo principal do IPA em anéis de ~2 mm de comprimento (Figura 2D)13.</li>
	<li>Afixar os anéis IPA nas câmaras de banho do órgão (Figura 4) rosqueando-os em dois fios de aço inoxidável de 40 μm de diâmetro (Figura 2E)11,13,14.</li>
	<li>Anexe fios de aço inoxidável montados com anéis IPA aos transdutores de força isométricos conectados ao dispositivo de aquisição de dados e ao sistema de computador instalado com o software fisiológico adequado para gravação e análise de dados e, em seguida, eleve suavemente a tensão do anel IPA para 1 g11.</li>
	<li>Deixe que os segmentos do vaso se equilibrem por cerca de 45 minutos a uma tensão de repouso de 1 g. Durante o período de equilíbrio, certifique-se de que a solução de Krebs é trocada regularmente a cada 15 minutos. Após esse período de equilíbrio, testar a viabilidade dos vasos medindo sua vasoconstrição a solução extracelular alta de K+ (80 mM) contendo 47,4 mM de NaCl, 80 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO4, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl 2 e 11 mM de glicose10,11.</li>
	<li>Avalie a presença ou ausência de endotélio calculando a resposta de relaxamento à acetilcolina (1 x 10−5 M) em anéis pré-contraídos com fenilefrina (PE, 1 x 10−5 M) (Observe que as contrações vasculares permanecem estáveis por 1 h após a adição de EP). Considere os anéis como intactos do endotélio se eles quantificarem para mais de 70% de relaxamento (Figura 5A). Se tiverem menos de 10% de relaxamento, considere os anéis como desnudados do endotélio13 (Figura 5B). Remova mecanicamente o endotélio esfregando suavemente dentro do vaso com um pequeno fio para induzir o desnudamento.</li>
	<li>Novamente equilibrar os anéis arteriais por 30 min antes do início dos experimentos de teste.</li>
</ol>5. Resposta vasorelaxante ao extrato vegetal
<ol><li>Investigue o efeito relaxante do extrato vegetal pré-contraindo anéis IPA com PE (1 x 10−5 M).</li>
	<li>Em seguida, adicione cuidadosamente o extrato da planta (1-1.000 μg/mL) cumulativamente aos anéis intactos do endotélio e aos anéis desnudos do endotélio para induzir vasorelaxamento (Figura 6A, B) e adquirir uma curva de resposta dependente da concentração (Figura 6C).</li>
	<li>Certifique-se de que o efeito do dimetilsulfóxido (DMSO) usado como solvente também seja avaliado de forma semelhante para servir como um controle negativo (Figura 6C).</li>
</ol>6. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal através do endotélio
<ol><li>Avaliar o mecanismo de ação vasorelaxante do extrato vegetal via vias endotelial óxido nítrico sintase (eNOS), ciclo-oxigenase (COX)13 e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF) incubando os anéis IPA intactos do endotélio por 30 min com os seguintes inibidores (Figura 7A): 1 x 10−4 M éster metílico NG-nitro-L-arginina (L-NAME, um inibidor da eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacina (um inibidor da COX)9, ou uma combinação de 1 x 10−7 M apamin (um pequeno bloqueador dos canais de potássio ativado por cálcio) e 1 x 10−7 M charybdotoxin (um bloqueador dos canais de potássio ativado por cálcio intermediário e de grande condutividade), antes de induzir contrações de IPA com 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Em seguida, após as contrações para a estabilização do PE, adicione concentrações cumulativas (0,1-1.000 μg/mL) do extrato da planta.</li>
	<li>Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis de AIP na presença de inibidores em comparação com a resposta dos anéis de AIP sem inibidores (Figura 7B-D) e construir a curva concentração-resposta.</li>
</ol>7. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal via canais K+ do músculo liso vascular
<ol><li>Pré-incubar anéis IPA desnudados de endotélio por 30 min com 1 x 10−3 M 4-aminopiridina (4-AP), um bloqueador do canal de potássio dependente de voltagem (KV) (Figura 8A), 1 x 10−5 M glibenclamida, um bloqueador do canal de potássio sensível a ATP (KATP), ou 1 x 10−7 M de iberiotoxina, um bloqueador de grande condutância Ca2+ canais K+ ativados (KCa), antes de induzir contrações de AIP com 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Em seguida, adicione concentrações cumulativas do extrato da planta.</li>
	<li>Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis de IPA com inibidor em comparação com os anéis de IPA sem inibidor (Figura 8B-D) e construir a curva de concentração-resposta.</li>
</ol>8. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal via inibição do influxo extracelular de cálcio (Ca2+) em CMVS
<ol><li>Pré-incubar anéis de IPA desnudados com endotélio por 30 min em solução de Krebs livre de Ca2+ contendo 1 mM de etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) (Figura 9A).</li>
	<li>Em seguida, substitua a solução de banho por uma solução de Ca2 + livre-80 mM K+ por 10 min para despolarizar os VSMCs, que então abrem os VOCCs (Figura 9A).</li>
	<li>Adicionar cumulativamente CaCl2 (0,01-10 mM) para induzir vasoconstrição da AFI e construir a curva concentração-resposta (Figura 9A).</li>
	<li>Repetir este protocolo nos mesmos anéis IPA, mas pré-incubá-los com extracto vegetal ou 1 μM de nicardipina (bloqueador de canais Ca 2+ tipo L) em solução de Ca2+ contendo 80 mM K+ durante 10 minutos, seguida da adição cumulativa de CaCl28.</li>
	<li>Por fim, compare a resposta contrátil com a contração máxima anteriormente provocada pelos desafios de CaCl2 de controle (Figura 9B).</li>
</ol>9. Mecanismo de vasorelaxamento induzido por extrato vegetal via inibição da liberação intracelular de cálcio (Ca2+) do retículo sarcoplasmático (SR)
<ol><li>Expor os anéis IPA desnudados de endotélio a uma solução K+ de 80 mM por aproximadamente 5 min, despolarizando os VSMCs, abrindo os VOCCs e, finalmente, gerando a carga de Ca2+ no SR (Figura 10A).</li>
	<li>Substitua a solução de banho por 10 min por uma solução de Krebs isenta de Ca2+ contendo 1 mM EGTA (Figura 10A).</li>
	<li>Em seguida, desafie os anéis IPA com 1 x 10−5 M PE, que ativa a via da fosfolipase C/IP3 , liberando Ca2+ da SR e evocando uma contração transitória da IPA (Figura 10A).</li>
	<li>Repita o mesmo protocolo para verificar contrações igualmente transitórias para EP.</li>
	<li>Desafie os anéis IPA novamente com uma solução de K+ de 80 mM por cerca de 5 minutos e, em seguida, substitua a solução de banho por uma solução de Krebs livre de Ca2+ contendo EGTA de 1 mM com ou sem o extrato da planta por 10 minutos.</li>
	<li>Novamente, desafie os anéis IPA com 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Comparar as contrações de AIP induzidas pela EP entre a condição com e sem o extrato vegetal (Figura 10B).</li>
</ol>10. Análise estatística
<ol><li>Compare esses ±valores usando o teste t de Student de Student ou analise por uma análise de variância (ANOVA) seguida do teste post hoc de Tukey-Kramer usando um software estatístico adequado. Considere-se estatisticamente significativas as diferenças em p < 0,05. Aqui, havia n = 6 ratos/protocolo experimental. NOTA: O registro de vasoconstrição e vasorelaxamento pode ser avaliado com software adequado instalado no computador. Por exemplo, a Figura 5A mostra que, quando os vasos sanguíneos são estimulados pela EP causando contração, isso pode ser observado a partir do aumento da tensão do traçado original. O traçado se estabilizará em 20-30 min, o que é considerado uma contração de 100%. Depois disso, o ACh estimula os vasos sanguíneos, causando relaxamento, o que pode ser observado a partir da diminuição da tensão do traçado original. Assim, a tensão reduzida é calculada como a porcentagem em comparação com a contração de 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+Implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614(2017).</li>
<li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Clinics%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li>
<li>Ruan, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li>
<li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li>
<li>Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li>
<li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling%3A+The+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li>
<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Traditional+and+Complementary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li>
<li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243(2019).</li>
<li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167(2000).</li>
<li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2%2C+N4-disubstituted+quinazoline+2%2C+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281(2019).</li>
<li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent%2C+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li>
<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li>
<li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste manuscrito, descrevemos a técnica de isolamento de IPA e VSMCs de ratos. Vários protocolos experimentais têm sido empregados para investigar a resposta vascular da AIP in vitro, que podem ser utilizados para caracterizar o efeito farmacológico e a base mecanicista do vasorelaxamento da AIP induzido pelo extrato vegetal.
Em relação à ação vasodilatadora endotélio-dependente do extrato vegetal, vários bloqueadores como L-NAME (eNOS), indometacina (COX) e apamina+caribdotoxina (EDH...

A vasculatura pulmonar é um sistema vascular de baixa pressão em que a principal função é entregar sangue desoxigenado para a área de troca de gases dos pulmões. As artérias pulmonares nos pulmões estão dispostas em ramos paralelos à árvore brônquica, formando uma extensa rede de capilares que é contínua sobre vários alvéolos e, finalmente, juntando-se em vênulas e veias. O tônus vascular da artéria pulmonar é controlado por diversos fatores, envolvendo a interação entre o endotélio e as células musculares lisas vasculares (CMVS)1.
Neste estudo, enfocamos o vasorelaxamento dependente e independente do endotélio da artéria intrapulmonar (AIP). Com relação ao vasorelaxamento dependente do endotélio, vários mecanismos que ocorrem na superfície das células endoteliais podem aumentar a concentração intracelular de Ca2+ (por exemplo, a acetilcolina [ACh] se liga ao receptor muscarínico [M3]), levando à formação de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (Figura 1 ). O NO é o principal fator relaxante derivado do endotélio sintetizado a partir da L-arginina pela óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)2, que então se dissocia das células endoteliais para VSMCs (Figura 1) e estimula a enzima guanililciclase solúvel (sGC); essa enzima transforma o trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), que ativa a proteína quinase G (PKG) e reduz os níveis citosólicos de Ca2+, causando vasorelaxamento (Figura 1). O PGl2 é sintetizado por células endoteliais através da via ciclo-oxigenase (COX) 3,4. Liga-se ao receptor de prostaciclina (IP) em VSMCs e estimula a enzima adenilil ciclase (AC), que então converte o trifosfato de adenosina (ATP) em monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (Figura 1)3,4. O AMPc ativa a proteína quinase A (PKA), reduzindo os níveis citosólicos de Ca2+ e causando vasorelaxamento5 (Figura 1). A via EDHF também participa do vasorelaxamento dependente do endotélio através de vários mediadores endoteliais e eventos elétricos. A ativação da via EDHF leva à hiperpolarização dos CMVS, fechando assim os canais de Ca 2+ operados por voltagem (VOCCs), reduzindo os níveis intracelulares de Ca 2+ e induzindo vasorelaxamento 6. O vasorelaxamento independente do endotélio ocorre diretamente nos CMVS por meio de vários mecanismos, como a redução do nível intracelular de Ca 2+, a inibição da miosina quinase de cadeia leve (MLCK), a ativação da fosfatase de cadeia leve da miosina (MLCP) e a redução da sensibilidade de Ca2+ à maquinaria contrátil dos VSMCs. Neste estudo, enfocamos o vasorelaxamento causado pela abertura de vários canais K+, o bloqueio de VOCCs e a inibição da liberação de Ca 2+ do retículo sarcoplasmático7, o que leva à redução dos níveis intracelulares de Ca2+, diminuindo assim a fosforilação da cadeia leve da miosina VSMC e a ligação miosina-actina ou formação de ponte cruzada, respectivamente, em última análise, resultando em vasorelaxamento.
A técnica para avaliar as medidas de vasoconstrição e vasorelaxamento em TIP isolada está bem estabelecida para roedores, mas os dados variaram dependendo dos protocolos experimentais. O presente estudo descreve o método utilizado para avaliar as reatividades vasculares de preparações de AIP in vitro de ratos, que foram realizadas na ausência de fatores externos moduladores da resposta vascular in vivo, como sinais nervosos, hormônios, citocinas, pressão arterial, etc.
Empregamos vários protocolos experimentais utilizando o extrato vegetal como exemplo para o estudo das reatividades vasculares da AIP. Vários bloqueadores (Figura 1) foram utilizados para identificar os mecanismos de vasorelaxamento endotélio-dependente e independente induzido pelo extrato vegetal. No entanto, os mesmos protocolos podem ser adaptados para avaliar as respostas vasculares da AIP a quaisquer fármacos, extratos ou fitoquímicos utilizados para o tratamento de várias patologias pulmonares.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632 Nº CAS 348-12-3</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina (4-AP)</td><td>Aldrich Chemical</td><td>A78403 Nº CAS 504-24-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetilcolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625 Nº CAS 60-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Nº</td> CAS <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9459 Nº CAS 24345-16-2</td><td></td></tr><tr><td>Bovino albumina sérica (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153 CAS NO. 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA960 CAS NO. 1707055184</td><td></td></tr><tr><td>Charybdotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7802 CAS NO. 95751-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891 CAS NO. 9001-12-1</td><td>De Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>D (+) - Glicose monohidratada</td><td>Millipore Corporation</td><td>K50876942 924 Nº CAS 14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Nº CAS 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-Ácido tetracético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889 Nº CAS 67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 CAS NO. 60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps 11 cm.</td><td>Pinça Dumoxel</td><td></td><td></td> sem ferrugem</tr> <tr><td>14 cm.</td><td>Rustless Dumoxel-Glibenclamide</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6039 CAS NO. 16673-34-0</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism program</td><td>Software versão 5.0 (San Diego, CA, EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 CAS NO. 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5904 CAS NO. 1002546960</td><td>recombinante de Mesobuthus tamulus</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378 CAS NO. 53-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Software de Programa Labchart</td><td>versão 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Austrália).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Ajax Finechem</td><td>296 Nº CAS 1506254995</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Wistar machos</td><td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Tailândia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG-nitro-L-arginina éster metílico (L-NAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751 Nº CAS 51298-62-5</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510 Nº CAS 54527-84-3</td><td></td></tr><tr><td>Banho de órgão 15 mL.</td><td>-</td><td>-</td><td>Ordem específica pelos pesquisadores</td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762 Nº CAS 9001-73-4</td><td>FromPapaya Latex</td></tr><tr><td>Phenal red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5530 Nº CAS 34487-61-1</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126 Nº CAS 61-76-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Kemaus</td><td>KA383 Nº CAS. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Aldrich Chemical</td><td>EC231-913-4 Nº CAS 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>S+A2: Cloreto de E36odio</td><td>Kemaus</td><td>KA465 Nº CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura 11 cm.</td><td>Tesoura de aço inoxidável</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spall 14 cm.</td><td></td><td></td> Bicarbonato de <td></td></tr><tr><td>sódio</td> inoxidável <td>Ajax Finechem</td><td>475 CAS NO. 912466</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio</td><td>Aldrich Chemical</td><td>33,198-8 CAS NO. 7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Ajax Finechem</td><td>482 CAS NO. 1506196602</td><td></td></tr><tr><td>Tiopental de sódio</td><td>Anesthal</td><td>JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625 Nº CAS 107-35-7</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria WBU 45</td><td>Memmert</td><td>2766 Nº CAS -</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento da artéria intrapulmonar e das células musculares lisas para investigar as respostas vasculares

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

A artéria intrapulmonar (AIP) e as células musculares lisas vasculares (CMVS) isoladas dos pulmões de ratos podem ser usadas para estudar os mecanismos subjacentes de vasoconstrição e vasorelaxamento. Após o isolamento da AIP e dos CMVS, as características das respostas vasculares em condições fisiológicas e patológicas podem ser avaliadas na ausência de fatores extrínsecos, como sinais nervosos, hormônios, citocinas, etc. Assim, o IPA e o VSMCs servem como excelentes modelos para o estudo da fisiologia / fisiopatologia vascular, juntamente com várias investigações experimentais, como modulação por agentes farmacológicos, análise eletrofisiológica patch-clamp, imagens de cálcio, etc. Aqui, utilizamos uma técnica de isolamento da AFI para investigar as respostas vasculares em uma configuração de banho de órgão. Os segmentos de AFI foram montados na câmara de banho do órgão através de fios intraluminais e estimulados por vários agentes farmacológicos. As alterações no tônus vascular da AIP (isto é, vasoconstrição e vasorelaxamento) foram registradas por meio de um transdutor de força isométrico e de um programa de análise de dados fisiológicos. Implementamos diversos protocolos experimentais, que podem ser adaptados para investigar os mecanismos de vasorelaxamento/vasoconstrição para o estudo das atividades farmacológicas de drogas fitoquímicas ou sintéticas. Os protocolos também podem ser usados para avaliar o papel dos medicamentos na modulação de várias doenças, incluindo a hipertensão arterial pulmonar. O modelo IPA permite investigar a curva concentração-resposta, que é crucial na avaliação dos parâmetros farmacodinâmicos dos fármacos.

O protocolo do presente estudo foi desenvolvido para determinar as condições experimentais ótimas para a mensuração de fenômenos fisiológicos observados nas respostas vasculares de preparações isoladas de AIP. Os experimentos piloto foram realizados para descrever os potenciais desfechos que auxiliam na compreensão dos efeitos vasculares e da base mecanicista da ação vasorelaxante do extrato vegetal, conforme a seguir.
Efeito vasorelaxante do extrato vegetal Como mostra a F...

As respostas vasculares da circulação arterial pulmonar podem ser exploradas usando a artéria intrapulmonar (AIP) e as células musculares lisas vasculares (CMVS). O presente estudo descreve detalhadamente o isolamento da AFI e os protocolos utilizados para investigar o vasorelaxamento em resposta a estímulos fisiológicos.

Isolamento da artéria intrapulmonar e das células musculares lisas para investigar as respostas vasculares

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Este estudo descreve o isolamento da artéria intrapulmonar de ratos e das células musculares lisas vasculares. Vários protocolos experimentais foram empregados, como o uso da técnica de banho de órgãos para investigar a resposta vascular da artéria intrapulmonar. As artérias intrapulmonares e as células musculares lisas vasculares são excelentes modelos para estudar a fisiologia e a fisiopatologia vasculares.Adaptações desta técnica poderiam avaliar as respostas vasculares de quaisquer drogas, extratos ou fitoquímicos. A montagem do anel arterial intrapulmonar isolado em um banho de órgão permite o uso de artérias intrapulmonares isoladas para avaliar o papel de uma droga na modulação de várias doenças, incluindo a hipertensão pulmonar. Os protocolos experimentais são tecnicamente viáveis, mas as etapas cruciais são complicadas e essenciais para o sucesso, portanto, ter uma demonstração visual facilita a compreensão e o acompanhamento.Demonstrando o procedimento estará Kittiwoot To-on, um estudante de mestrado em fisiologia do Laboratório da Unidade de Pesquisa Cardiovascular, Departamento de Fisiologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Naresuan. Comece cortando um único lobo do pulmão com uma tesoura de 11 centímetros e colocando-o em uma placa de Petri de nove centímetros com o lado medial, ou raiz do pulmão, voltado para cima. Observe e identifique o alinhamento da veia, brônquios e artéria de cima para baixo.Corte o brônquio longitudinalmente com uma tesoura. Em seguida, use a pinça de 11 centímetros para agarrar a ponta do brônquio. Disseque suavemente e remova o brônquio e as veias para fora do pulmão.Use o fórceps para agarrar a ponta da artéria intrapulmonar e dissecá-la cuidadosamente para fora do tecido pulmonar com uma tesoura. Mantenha a artéria intrapulmonar isolada em solução fria de Krebs até que o conjunto do banho do órgão seja configurado. Após o isolamento da artéria intrapulmonar, corte longitudinalmente o ramo principal da artéria intrapulmonar com a tesoura de 11 centímetros e corte em tiras de dois milímetros.Imergir as tiras da artéria intrapulmonar em DM e, em seguida, incubá-las por uma hora a quatro graus Celsius em MS contendo um miligrama por mililitro de papaína, 0,04% BSA e 0,4 milimolar DTT. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione um miligrama por mililitro de colagenase Tipo IA em DM e incube novamente a 37 graus Celsius por cinco minutos.Transfira os tecidos para DM fresco e disperse por trituração suave usando uma pipeta Pasteur de vidro. Continue triturando até que as células musculares lisas vasculares isoladas se tornem visíveis na solução de banho sob o microscópio. Isole a artéria intrapulmonar, como demonstrado anteriormente, e corte o ramo principal da artéria intrapulmonar em anéis de aproximadamente dois milímetros de comprimento.Afixe os anéis da artéria intrapulmonar nas câmaras de banho do órgão, enfiando-os em dois fios de aço inoxidável de 40 micrômetros de diâmetro. Anexar fios de aço inoxidável montados com anéis da artéria intrapulmonar aos transdutores de força isométricos conectados ao dispositivo de aquisição de dados e ao sistema de computador instalado com o software fisiológico adequado para registro e análise de dados. Em seguida, aumente suavemente a tensão do anel da artéria intrapulmonar para um grama.Permita que os segmentos do vaso se equilibrem por cerca de 45 minutos a uma tensão de repouso de um grama. Durante o período de equilíbrio, certifique-se de que a solução de Krebs é trocada regularmente a cada 15 minutos. Após o equilíbrio, testar a viabilidade dos vasos medindo sua vasoconstrição para solução de potássio extracelular alta.Avaliar a presença ou ausência de endotélio calculando a resposta de relaxamento à acetilcolina em anéis pré-contraídos com EP. Remova mecanicamente o endotélio esfregando suavemente o interior do vaso com um pequeno fio para induzir o desnudamento. Em seguida, equilibre os anéis arteriais por 30 minutos antes do início dos experimentos de teste. Investigar o efeito relaxante do extrato vegetal pré-contraindo anéis da artéria intrapulmonar com EP. Em seguida, adicione cuidadosamente 0,1 a 1000 microgramas por mililitros do extrato da planta cumulativamente aos anéis intactos do endotélio e aos anéis desnudos do endotélio para induzir vasorelaxamento e adquirir uma curva de resposta dependente da concentração.Certifique-se de que o DMSO eficaz usado como solvente também seja avaliado de forma semelhante para servir como um controle negativo. Avaliar o mecanismo vasorelaxante de ação do extrato vegetal conforme mencionado no texto manuscrito. Em seguida, após as contrações para estabilizar PE, adicione concentrações cumulativas do extrato da planta.Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis da artéria intrapulmonar na presença de inibidores em comparação com a resposta dos anéis da artéria intrapulmonar sem inibidores e construir a curva de concentração-resposta. Na artéria intrapulmonar intacta do endotélio, o extrato da planta provocou uma resposta de vasorelaxamento dependente da concentração. A erradicação do endotélio reduziu profundamente o vasorelaxamento induzido pelo extrato vegetal, como refletido pelo aumento da CE50 em 2,2 vezes, a inibição da eNOS e do EDHF evidentemente diminuiu a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal.Isso deslocou a curva de resposta à concentração para a direita e aumentou a CE50 sem alterar os valores de E máx. Pelo contrário, a indometacina não mostrou efeito sobre a resposta vasorelaxante ao extrato da planta. Nos anéis da artéria intrapulmonar desnudados pelo endotélio, os bloqueadores dos canais de potássio ativados por cálcio diminuíram a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal.Enquanto os bloqueadores dos canais de potássio dependentes de voltagem ou sensíveis ao ATP não apresentaram desvio. A pré-incubação com o extrato da planta inibiu a contração induzida pelo cloreto de cálcio. Os anéis da artéria intrapulmonar desnudados com endotélio pré-incubados com solução de Krebs livre de cálcio e EP renderam uma contração transitória.Em comparação com o veículo, os extratos vegetais reduziram significativamente a contração induzida pela EP. Durante o procedimento, deve-se identificar claramente veia, brônquios e artéria no início. Cortar ou danificar a artéria reduzirá seu comprimento e afetará as respostas vasculares. Essa técnica pode ser adaptada para investigar compostos que possam servir como protótipos para tratamentos de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar.

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