Name: Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a avaliar a função mitocondrial em nervos ciáticos por respirometria de alta resolução. Este método permite medir simultaneamente o consumo de oxigênio e a produção de ROS in situ, auxiliando no estudo de neuropatias e potenciais terapias.

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O estudo foi financiado pelo Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecemos ao Dr. Antonio Galina Filho, à Dra.

O presente protocolo é aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) e Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais experimentais. O nervo ciático é isolado de camundongos C57BL/6 machos de quatro meses de idade, eutanizados por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais. As etapas do protocolo são otimizadas para evitar a deterioração mitocondrial. Portanto, neste protocolo, a calibração dos sensores polarográficos de oxigênio foi realizada antes da dissecção do tecido nervoso ciático do camundongo e da permeabilização.
1. Preparação de reagentes
<ol><li>Prepare o Tampão de Preservação do Tecido (Tampão TP).<ol>
<li>Prepare os seguintes reagentes na solução de água ultrauso: 10 mM de tampão Ca-EGTA com 0,1 μM de cálcio livre, 20 mM de imidazol, 20 mM de taurina, 50 mM de K-MES, 0,5 mM de DTT, 6,56 mM de MgCl2, 5,77 mM de ATP, 15 mM de fosfocreatina (ver Tabela de Materiais), pH 7.1. Armazene a -20°C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o Tampão de Respiração mitocôndria (Buffer MR).<ol>
<li>Prepare os seguintes reagentes na solução de água ultrauso: 0,5 mM de K2EGTA, 3 mM de MgCl2, 60 mM de MES, 20 mM de taurina, 10 mM de KH2PO4, 20 mM de HEPES, 110 mM de D-sacarose, 1 mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos) (ver Tabela de Materiais), pH 7.4. Armazenar a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a solução de estoque de saponin dissolvendo 5 mg de saponina (ver Tabela de Materiais) em 1 mL de Tampão TP (passo 1.1) e mantenha-a no gelo. Saponina está preparada recentemente.</li>
	<li>Prepare o Amplex Red reutilizando o pó (ver Tabela de Materiais) com DMSO para obter uma concentração de estoque de 2 mM e armazenar a -20 °C em um frasco protegido contra a luz. NOTA: Para evitar o desgaste da sonda congelando e descongelando, faça pequenas alíquotas para armazenamento não superior a 6 meses25.</li>
</ol>2. Calibração de sensores polarográficos de oxigênio para respirometria de alta resolução (HRR)
<ol><li>Limpe as câmaras hrr do instrumento e das seringas (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Abra as câmaras hrr, encha com água destilada até o topo e mexa por 5 min 3x. Repita com etanol e depois novamente com água. Lave rolhas e seringas com água/etanol/água 3x cada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique as seguintes configurações de calibração no software HRR (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>No controle de software HRR, adicione a temperatura experimental (37 °C), os parâmetros para sensor de oxigênio (ganho, 2; tensão de polarização, 800 mV) e para sensor amperométrico (ganho, 1000; tensão de polarização, 100 mV).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrar os sensores de oxigênio.<ol>
<li>Pipeta 2,1 mL de Mr Buffer (passo 1.2) em cada câmara. Feche com as rolhas e desenhe ar para dentro da câmara até formar uma bolha. Mexa a 37 °C por 1 h no modo de calibração até que o fluxo de oxigênio por massa esteja estável.</li>
		<li>Realize uma calibração de ar dos sensores polarográficos de oxigênio no software de acordo com o protocolo24 do fabricante. NOTA: A etapa de calibração só é realizada uma vez antes de um experimento. Experimentos adicionais no mesmo meio de respiração e temperatura podem ser realizados após mera lavagem de câmaras (etapa 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissecção e permeabilização do nervo ciático
<ol><li>Remova o nervo ciático seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Eutanize o animal por deslocamento cervical depois de remover de sua gaiola e suavemente contido para descansar no banco.</li>
		<li>No animal eutanizado, faça uma incisão com uma tesoura na parte inferior das costas, começando perto da coluna e descendo a coxa em direção ao pé. Remova a pele e o músculo ligados ao nervo, e depois corte e remova todo o nervo ciático.</li>
		<li>Pesar o tecido imediatamente e colocá-lo em um frasco cheio de tampão de TB frio (4 °C). Faça as etapas 3.2-3.3 no gelo. NOTA: O peso do tecido molhado é usado para normalizar o consumo de oxigênio e o fluxo de produção de ROS nas etapas seguintes. Se o tecido não puder ser pesado imediatamente, conserva-o em tampão frio de TB. O procedimento é realizado em tecido fresco e não deve ser congelado para evitar danos mitocondriais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a preparação do tecido, coloque o nervo ciático em uma placa de Petri com tampão TP suficiente para cobri-lo. Segure uma extremidade do nervo com fórceps, e com outro par de fórceps, puxe os feixes nervosos horizontalmente. NOTA: Este procedimento precisa ser feito em menos de 10 minutos para evitar a deterioração do tecido. O tecido estará pronto quando puder ser visualizado como camadas nebulosas transparentes, em frente ao tecido opaco branco anterior (Figura 1).</li>
	<li>Primeiro, transfira o tecido jogado em um pequeno prato contendo 1 mL de TP Buffer para permeabilização tecidual. Para iniciar a permeabilização, transfira o tecido com fórceps para um prato contendo 1 mL de TP Buffer e 10 μL de saponina (a partir da solução de estoque, passo 1.3).<ol>
<li>Agite em um agitador de microplaca suavemente por 30 minutos, depois transfira o tecido com fórceps para um prato fresco contendo MR Buffer (1 mL) e agite suavemente por 10 minutos. Transfira o tecido com fórceps para uma câmara HRR calibrada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Consumo de oxigênio e determinação da produção de ROS
<ol><li>Encha as câmaras hrr com 2,1 mL de Buffer MR, adicione Amplex Red (passo 1.4) a uma concentração final de 5 μM e peroxidase a 2 U/mL, e adicione o nervo ciático permeabilized (passo 3).<ol>
<li>Conecte os sensores de fluorescência do instrumento, desligue as luzes na seção de controle do software e pressione Conecte-se ao oxígrafo. Em "protocolos de edição" no software, insira o peso do tecido medido na etapa 3.1.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Vá para "layout", escolha a opção "fluxo específico por amostra de unidade" e selecione Plots para acessar simultaneamente a leitura do consumo de oxigênio e, se desejar, a produção H2O2 . Espere ~10 min. NOTA: Este tempo é necessário para estabilizar o fluxo basal do consumo de oxigênio sem substrato adicionado (basal). Antes de novas injeções, certifique-se de que o fluxo de oxigênio esteja estabilizado.</li>
	<li>Injete dois pulsos de H2O2, cada um a uma concentração final de 260 μM, para calibração posterior na câmara.</li>
	<li>Injete 20 μL de succinato (ver Tabela de Materiais), um substrato complexo mitocondrial II, para ativar o sistema de transporte de elétrons mitocondrial. NOTA: Diferentes substratos mitocondriais podem ser adicionados neste momento para avaliar a função mitocondrial por diferentes complexos. Os resultados representativos com substratos variados para os complexos mitocondriais I e II são mostrados nas Figuras 2 e Figura 3. Neste ponto, observa-se um aumento no consumo de O2 e H2O2 , simultaneamente, na Figura 3.</li>
	<li>Adicione 20 μL de difosfato de adenosina (ADP) para ativar a síntese de triptosfato de adenosina (ATP). NOTA: A ADP estimula a síntese de ATP e reduz o potencial da membrana. Espera-se que seja observado um aumento no consumo de O2 e uma diminuição na produção de H2O2.</li>
	<li>Em sequência, adicione 5 μL de citocromo c (ver Tabela de Materiais) como um indicador de integridade da membrana. NOTA: Se o tecido estiver bem preparado e permeabilizado, o citocromo c não deve aumentar o consumo de oxigênio em mais de 15%. Se ocorrer, verifique se há recomendações na seção de solução de problemas.</li>
	<li>Titulação com alíquotas de 0,2 μg/mL de oligomicina (ver Tabela de Materiais) até que não seja observada nenhuma diminuição adicional no consumo de O2 . NOTA: A oligomicina age inibindo a síntese de ATP levando a uma diminuição no fluxo O2 e um aprimoramento na formação H2O2 favorecida pelo potencial de alta membrana26,27.</li>
	<li>Titrate com alíquotas de 0,5 μmol/L de cianeto carbonil 4-(trifluorometoxy)fenilhydrazone (FCCP) (ver Tabela de Materiais), o uncoupler mitocondrial, até que seja possível não observar nenhum aumento adicional no consumo de O2 . Para terminar o experimento, injete 2 μl de antimicina A até uma concentração final de 5 μM e aguarde a estabilização do fluxo. NOTA: Observa-se uma diminuição na produção de H2O2 devido à dissipação potencial da membrana após a injeção de FCCP. A antimicina A inibe o complexo III, impedindo assim o fluxo de elétrons. Portanto, o consumo de O2 dependente de mitocôndrias é prejudicado, diminuindo o fluxo de oxigênio por massa e estimulando o vazamento de elétrons, aumentando a produção de H2O2 2 26,27.</li>
	<li>Vá para a barra de comando, procure por "multissensorial" no software, clique em Controle > Salvar arquivo e Desconecte. NOTA: A adição de outros substratos e inibidores pode ser realizada de acordo com a questão em estudo. Um exemplo é descrito nos resultados representativos. A calibração H2O2 é realizada após o término do experimento, de acordo com o protocolo28 do fabricante.</li>
	<li>Abra o arquivo salvo e selecione o traço "Fluxo de Oxigênio por Massa" para obter os resultados experimentais de consumo de oxigênio. Selecione manualmente a janela entre as injeções pressionando shift + botão esquerdo do mouse.<ol>
<li>Vá para Marks > Statistics para visualizar os resultados de cada injeção de substrato/inibidores/protocolo desacoplado. Para a produção de H2O2 , realize o mesmo procedimento com o traço "Amp-Slope". NOTA: Ao selecionar a janela, evite artefatos de injeções de volume escolhendo uma janela onde o oxigênio (ou H2O2) é mais estável e constante. Exemplos de janelas selecionadas são representados por aparelhos pretos nos resultados representativos (Figura 2 e Figura 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Várias doenças ou condições que acompanham neuropatias têm disfunção mitocondrial como fator de risco. A avaliação da função mitocondrial nos nervos periféricos é essencial para elucidar como as mitocôndrias agem nessas condições neurodegenerativas. A avaliação da função mitocondrial é trabalhosa devido à dificuldade do método de isolamento e à escassez de material. Assim, o desenvolvimento de técnicas de permeabilização tecidual que não requerem o isolamento das mitocôndrias é essencial.
Para...

Mitocôndrias são essenciais para manter a viabilidade celular e desempenham inúmeras funções celulares, como metabolismo energético (glicose, aminoácido, lipídio e metabolismo de nucleotídeos). Como local principal da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as mitocôndrias são centrais em diversos processos de sinalização celular, como apoptose e participam da síntese de aglomerados de ferro-enxofre (Fe-S), importação e maturação de proteínas mitocondriais, e manutenção de seu genoma e ribossomos 1,2,3. A rede de dinâmica da membrana mitocondrial é controlada por processos de fusão e fissão, e também possui máquinas para controle de qualidade e mitofagia 4,5,6.
A disfunção mitocondrial está associada ao aparecimento de várias condições patológicas, como câncer, diabetes e obesidade7. Distúrbios na função mitocondrial são detectados em distúrbios neurodegenerativos que afetam o sistema nervoso central, como na doença de Alzheimer 8,9, doença de Parkinson10,11, esclerose lateral amiotrófica12,13 e doença de Huntington14,15 . No sistema nervoso periférico, a perda da função mitocondrial em axônios é observada em neuropatias imunológicas, como a síndrome de Guillain-Barré16,17, e em associação com a alta produção de ROS mitocondrial em axônios, esses eventos levam à ativação do MAP Kinase em células schwann18. Isso demonstra que a fisiologia mitocondrial pode ser essencial não apenas para uma célula específica do local, mas para um tecido inteiro. Na polineuuropatia sensorial distal associada ao HIV (HIV-DSP), as mitocôndrias têm um papel no mecanismo pelo qual o trans-ativador da proteína de transcrição (HIV-TAT) permite que o HIV se replique eficientemente, bem como vários outros papéis na patogênese de infecção pelo HIV19,20.
A avaliação da fisiologia mitocondrial do nervo ciático emergiu como um alvo essencial para investigar a neuropatia 7,21,22. Na neuropatia diabética, análises proteômicas e metabolômicas sugerem que a maioria das alterações moleculares no diabetes afetam a fosforilação oxidativa do nervo ciático e o metabolismo lipídico7. Essas alterações também parecem ser sinais precoces de diabetes induzido pela obesidade21. Em um modelo de camundongos de neuropatia dolorosa induzida pela quimioterapia, o comprometimento mitocondrial no nervo ciático é detectado como uma diminuição na fosforilação oxidativa22, e uma redução das atividades de complexos mitocondriais, potencial de membrana e conteúdo ATP23. No entanto, embora vários grupos tenham citado disfunção mitocondrial em neuropatias, esses estudos estão limitados às medições de atividade em complexos mitocondriais sem preservação das membranas mitocondriais, sem avaliação da integridade mitocondrial ou medições de conteúdo ATP como parâmetro para a produção mitocondrial da ATP. Em geral, uma avaliação adequada do consumo mitocondrial de oxigênio e da produção de ROS requer o isolamento das mitocôndrias por centrifugação diferencial em um gradiente percoll/sacarose. O isolamento das mitocôndrias também pode ser um fator limitante para o tecido nervoso ciático devido à grande quantidade de tecido necessário e à perda e perturbação das mitocôndrias.
O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para medir a fisiologia mitocondrial como consumo mitocondrial de oxigênio e produção de ROS no nervo ciático, preservando membranas mitocondriais e sem a necessidade de isolar mitocôndrias. Este protocolo é adaptado a partir de medidas de consumo de oxigênio em fibras musculares permeabilizadas24 por respirometria de alta resolução (HRR). As vantagens desse procedimento são a possibilidade de avaliar mitocôndrias em pequenas quantidades de tecido, como o nervo ciático e avaliar parâmetros mitocondriais in situ, preservando assim o ambiente mitocondrial, estrutura e perfil bioenergésico, para obter um resultado fisiologicamente confiável. Os estados respiratórios mitocondriais foram determinados com substratos e inibidores após a permeabilização do nervo ciático para avaliar adequadamente o bioenergetics mitocondrial e o coeficiente c citocromo para a integridade da membrana mitocondrial, fornecendo um guia para etapas da avaliação do sistema de transporte eletrônico mitocondrial (ETS) e cálculo de parâmetros essenciais. Este estudo pode fornecer ferramentas para responder a perguntas em mecanismos fisiopatológicos nos quais o metabolismo do nervo ciático está implicado, como neuropatias periféricas.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5' trifosfato dissódico sal hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato de sódio</td><td>sal Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Reagent</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>A12222</td><td>Amplex Red é preparado em DMSO de acordo com a ficha técnica do produto</td></tr><tr><td>Antimicina A (de Streptomyces sp.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>fração de choque térmico, livre de protease, livre de ácidos graxos, essencialmente livre de globulina, pH 7, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>Carbonato de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6763</td><td></td></tr><tr><td>Cianeto de carbonila 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td> <td>(do coração equino; pequena hemeproteína)</td></tr> <tr><td>DataLab versão 5.1.1.91</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria</td><td></td><td>Copyright (c) 2002 - 13 por Dr. Erich Gnaiger</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas orbital digital 120V</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>88882005</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>EGTA sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Hamilton Sigma-Aldrich</td><td>HAM80075</td><td>10 uL, 25 uL e 50 uL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogênio solução de peróxido 30% P/A</td><td>Merck</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>L-(&menos;)-Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>MES sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação, curva</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação, reta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>O2K - Conjunto de filtros Amplex Red</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria</td><td>44321-01</td><td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometria: produção de HRR e H2O2 em mitocôndrias cerebrais de camundongos. Rede Fisiol Mitocôndr 17.17.</td></tr><tr><td>O2K - Fluorescência LED2 - componente do módulo Sensor de fluorescência Verde</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria</td><td>44210-01</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td> <td>(de Streptomyces diastatochromogenes; mistura de oligomicinas A, B e C</td></tr><tr><td>OROBOROS Oxygraph-2k</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Áustria</td><td>http://www.oroboros.at</td><td></td></tr><tr><td>Palmitoilcarnitina (Palmitoil-DL-carnitina-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4509</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, poliestireno</td><td>MERCK</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de sal dissódico de fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Monobásico de di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1330</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de</td> <td>potássioSigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAE0073</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio dibásico hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

A disfunção mitocondrial nos nervos periféricos acompanha várias doenças associadas à neuropatia periférica, que podem ser desencadeadas por múltiplas causas, incluindo doenças autoimunes, diabetes, infecções, doenças hereditárias e tumores. Avaliar a função mitocondrial nos nervos periféricos do camundongo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho da amostra, a um número limitado de mitocôndrias presentes no tecido e a presença de uma bainha de mielina. A técnica descrita neste trabalho minimiza esses desafios usando um protocolo único de permeabilização adaptado de um usado para fibras musculares, para avaliar a função mitocondrial do nervo ciático em vez de isolar as mitocôndrias do tecido. Medindo a produção fluormétrica de espécies reativas com Amplex Vermelho/Peroxidase e comparando diferentes substratos mitocondriais e inibidores em nervos de saponina-permeabilized, foi possível detectar estados respiratórios mitocondriais, espécies reativas de oxigênio (ROS) e a atividade de complexos mitocondriais simultaneamente. Portanto, o método aqui apresentado oferece vantagens em relação à avaliação da função mitocondrial por outras técnicas.

O consumo mitocondrial de oxigênio pelo nervo ciático permeabilizado está representado na Figura 2. O traço vermelho representa o fluxo O2 por unidade em pmol/s.mg. Após registrar um consumo basal de oxigênio com substratos endógenos (respiração de rotina), o succinato (SUCC) é injetado para registrar a respiração complexa II (succinato deshidrogenase), resultando em um aumento na taxa de consumo de oxigênio. Em sequência, adiciona-se uma concentração saturada de ADP, ativando a s...

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Este protocolo permite a avaliação da função mitocondrial dentro do nervo por parcelamento das mitocôndrias isoladas, um procedimento desafiador em um pequeno tecido que contém um número limitado de mitocôndrias. A técnica oferece a possibilidade de analisar funções mitocôndrias como o consumo de oxigênio e a produção de ROS simultaneamente em uma mitocôndria preservada in situ. Com vários substratos, inibidores e protocolos de design desacopladores.Várias doenças compartilham a função mitocondrial, em particular neuropatias induzidas pelo diabetes tipo dois ou quimioterapia. Nessas doenças, os prejuízos da fosforilação oxidativa mitocondrial é o único sinal que dita o desenvolvimento da doença. Este método fornece insights sobre neurobiologia, bioquímica e farmacologia, com a investigação de mecanismos de doença mitocondrial, busca de terapias, como reforços mitocondriais ou dor neuropática amenizada.Para começar, calibrar os sensores de oxigênio tubondo 2,1 mililitros de amortecedor MR em cada câmara. Feche-a com as rolhas e desenhe ar para dentro da câmara até formar uma bolha. Mexa a 37 graus Celsius durante uma hora em modo de calibração até que o fluxo de oxigênio por massa se estabilize.O software HRR realiza uma calibração de ar dos sensores polarográficos de oxigênio de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação do tecido, coloque o nervo ciático em uma placa de Petri com tampão TP suficiente para cobri-lo. Segure uma extremidade do nervo com fórceps e com outro par de fórceps puxe os feixes nervosos horizontalmente.Primeiro, transfira o tecido exibido para um pequeno prato contendo um amortecedor TP mililitro para permeabilização tecidual. Para iniciar a permeabilização, transfira o tecido com fórceps para outro prato contendo um mililitro de tampão TP, contendo 50 microgramas por mililitro de saponina. Coloque a placa em um agitador de microplacos e deixe-a mexer suavemente por 30 minutos.Em seguida, transfira o tecido com fórceps para um prato fresco contendo um amortecedor MR mililitro, e deixe-o mexer suavemente por 10 minutos. Transfira o tecido com fórceps para uma câmara HRR calibrada. Encha as câmaras HRR com 2,1 mililitros de buffer MR.Adicione Amplex Vermelho e peroxidase a uma concentração final de cinco micromolar, e duas unidades por mililitro, respectivamente. Em seguida, adicione o nervo ciático permeável. Anexar os sensores fluorescentes do instrumento.Em seguida, desligue as luzes na seção de controle do software e clique em conectar-se ao oxígrafo"Vá editar protocolos" no software e insira o peso do tecido. Vá para o layout e escolha a opção de fluxo por unidade específica". Em seguida, selecione parcelas para acessar simultaneamente a leitura do consumo de oxigênio e, se necessário, a produção de peróxido de hidrogênio.Espere aproximadamente 10 minutos. Injete dois pulsos de peróxido de hidrogênio, cada um até uma concentração final de 260 micromolar para calibração da câmara. Injete 20 microliters de succinato, um substrato do complexo mitocondrial II, para ativar o sistema de transporte de elétrons mitocondrial.Adicione 20 microliters de ADP para ativar a síntese ATP. Em sequência, adicione cinco microlitadores de citocromo c como um indicador de integridade da membrana. Titrate com alíquotas de 0,2 microgramas por mililitro de oligomicina até que não seja observada mais diminuição no consumo de oxigênio.Titular com alíquotas de 0,5 micromoles por litro FCCP, o uncoupler mitocondrial, até que não seja observado mais aumento no consumo de oxigênio. Para terminar o experimento injete dois microliters de antimicina A, faça uma concentração final de cinco milimiliar e espere o fluxo estabilizar. Vá para a barra de comando.Procure por multissensorial"no software. Clique no controle", em seguida, pressione salvar arquivo" e desconecte. Abra o arquivo salvo e selecione o fluxo de oxigênio por bandejas em massa para obter os resultados experimentais de consumo de oxigênio.Selecione manualmente a janela entre as injeções pressionando o botão do mouse esquerdo mais o botão esquerdo do mouse. Vá para marcas e selecione estatísticas para visualizar os resultados de cada injeção de substratos, inibidores e protocolo de desacoplamento. Para produção de peróxido de hidrogênio, realize o mesmo procedimento com o traço de inclinação de amplificador.A diminuição do potencial de membrana promovida pela atividade de sythase atp acelerou o consumo de oxigênio. A adição de citocromo exógeno C promoveu apenas uma estimulação mínima da respiração, certificando a integridade da membrana externa mitocondrial para esta preparação. Foram registrados fluxos absolutos de oxigênio e observado apenas um aumento de 6,3% na respiração, indicando boa qualidade da preparação do tecido.O consumo de oxigênio e a produção de ROS foram medidos simultaneamente na presença de diferentes substratos que fornecem combustível para o sistema de transporte de elétrons. A adição de piruvato e malato para complexo mitocondrial eu aumentei a respiração. E a adição adicional de succinato para o complexo II também aumenta o consumo de oxigênio.Portanto, outros substratos poderiam ser testados. A produção de ROS também aumentou, indicando o vazamento de oxigênio do sistema de transporte de elétrons. A adição de difosfato de adenosina na concentração saturada aumentou o consumo de oxigênio impulsionando a formação de ATP e diminuindo a produção de ROS.Em contrapartida, a titulação do oligo diminuiu o consumo de oxigênio e aumentou a produção de ROS. Isso sugere que o nervo ciático do tamanho permeablado poderia replicar a relação padrão na fisiologia mitocondrial. A adição de FCCP e retinone, alinhada com as mudanças esperadas do fluxo de oxigênio, confirmam que a fisiologia mitocondrial e o perfil bioenergéstico foram preservados no nervo ciático do tamanho permeablístico.O passo mais importante é preparar suavemente a seção tecidual, garantir que todas as aberturas das câmaras sejam devidamente limpas. Alterações na função mitocôndria podem ser devido a disfunção ou um número mitocondrial mais baixo. portanto, recomenda-se a atividade de synthase e a confirmação do conteúdo de DNA mitocondrial pelo PCR.

assessing-mitochondrial-function-sciatic-nerve-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Os cavalos têm uma excepcional capacidade de exercício aeróbio, tornando o músculo esquelético equino um tecido importante tanto para o estudo da fisiologia do exercício equino quanto para a fisiologia mitocondrial de mamíferos. Este artigo descreve técnicas para a avaliação abrangente da função mitocondrial no músculo esquelético equino.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

A análise da função mitocondrial espermática por respirometria de alta resolução permite medir o consumo de oxigênio de espermatozoides que se movem livremente em um sistema de câmara fechada. A técnica pode ser aplicada para medir a respiração em espermatozoides humanos, o que fornece informações sobre as características mitocondriais e integridade dos espermatozoides.

Respirometria de Alta Resolução para Avaliação da Função Mitocondrial em Espermatozoides Humanos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Os métodos para estudar a bioenergética mitocondrial sob concentrações de substrato fisiologicamente relevantes em células imunes são limitados. Fornecemos um protocolo detalhado que usa fluorespirometria de alta resolução para avaliar as mudanças na resposta do potencial da membrana mitocondrial à demanda de energia em células T humanas, monócitos e células mononucleares periféricas.

Fluorespirometria de alta resolução para avaliar mudanças dinâmicas no potencial da membrana mitocondrial em células imunes humanas

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Aprenda a avaliar a função mitocondrial em nervos ciáticos por respirometria de alta resolução. Este método permite medir simultaneamente o consumo de oxigênio e a produção de ROS in situ, auxiliando no estudo de neuropatias e potenciais terapias.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

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