Investigando os efeitos aliviadores da administração de Bacillus cereus na colite por meio da modulação da microbiota intestinal

Este protocolo permite avaliar o efeito regulador bidirecional da suplementação de probióticos na saúde e resultados estáveis e reprodutíveis. Um modelo alternativo de colite induzida por DSS foi estabelecido usando camundongos pseudo livres de germes, a fim de evitar algumas limitações laboratoriais no uso de camundongos livres de germes como receptores de probióticos. Para explorar os efeitos benéficos dos probióticos nesta técnica, é uma abordagem promissora para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para aliviar os sintomas de distúrbios inflamatórios crônicos associados.

Para começar, prepare um coquetel de antibióticos dissolvendo ampicilina, sulfato de neomicina, metronidazol e vancomicina na água potável. Após a dissolução completa, armazene as soluções a quatro graus Celsius. Coloque as soluções de coquetel de antibióticos em uma garrafa de água.

Certifique-se de usar frascos marrons ou embrulhe os frascos com papel alumínio para proteger as soluções antibióticas da luz. Coloque a garrafa em cima da gaiola do rato. Para fazer uma solução de sulfato de sódio a 2,5% de dextrano, dissolva 2,5 gramas de DSS em 100 mililitros de água destilada.

Substitua a água potável pela solução 2,5% DSS no grupo de camundongos modelo de colite. Para avaliar o efeito positivo do B cereus no alívio da colite, atribua aleatoriamente os camundongos aos três grupos a seguir, o grupo controle, o modelo de colite induzida por DSS e a suplementação de probiótico B cereus para camundongos induzidos por DSS. Para explorar o papel da microbiota intestinal na regulação dos efeitos probióticos do B cereus na colite induzida por DSS, atribua aleatoriamente os camundongos nos três grupos a seguir, ABX / controle, ABX / DSS e ABX / B cereus mais DSS.

Registre o peso corporal dos camundongos como o peso basal após a administração do coquetel de antibióticos. Trate imediatamente os camundongos machos C 57 BL seis com solução de 2,5% de DSS em água potável por sete dias. Prepare oito tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro cheios de 900 microlitros de solução salina normal estéril.

Pipetar 100 microlitros de crescimento logarítmico B cereus e dissolver em 900 microlitros de solução salina normal estéril. Diluir B cereus em série com tubos. Coloque 40 microlitros de cada diluição na respectiva placa de ágar LB rotulada com a razão de diluição.

Repetir três vezes para cada razão de diluição. Cultive as placas em uma incubadora de temperatura constante de 37 graus Celsius por 16 horas. Selecione as placas com aproximadamente 20 a 70 colônias para contagem.

Após a quantificação de B cereus, recolher um mililitro de meio B cereus contendo um vezes 10 elevado ao nono UFC e centrifugar a 8 000 G durante 10 minutos. Em seguida, lavar as células bacterianas duas vezes com água estéril por centrífuga a 8 000 g durante 10 minutos e retirar o sobrenadante. Diluir o B cereus concentrado com solução salina normal estéril até uma concentração final de duas vezes 10 elevado ao oitavo UFC por 200 microlitros.

Pipetar repetidamente a diluição para cima e para baixo para adquirir uma suspensão dispersa de B cereus. Limpe a parte externa da agulha de gavagem com etanol a 70% e mantenha a aplicação adequada da dose. Para conter os ratos, pegue-os pela cauda e segure a pele solta das costas firmemente com a ponta da cauda fixada entre os dois últimos dedos do manipulador.

Mantenha os ratos na posição vertical. Em seguida, insira a agulha de gavagem com cuidado e suavidade pela boca até o esôfago. Administre a solução B cereus, retire a agulha suavemente e retorne o camundongo à sua gaiola.

Meça o peso corporal dos camundongos diariamente e colete as amostras de fezes imediatamente em um tubo de centrífuga esterilizado. Determine o sangue oculto nas fezes pelo papel de teste de sangue oculto nas fezes. Colete 10 miligramas de amostra de fezes em um aplicador.

Coloque a amostra no cartão de teste e aplique uma esfregaço fino no cartão. Abra a aba traseira e aplique o revelador sobre o esfregaço. Fixe os camundongos em decúbito dorsal na mesa de operação e abra a cavidade peritoneal.

Separe todo o cólon cirurgicamente e meça o comprimento com uma régua. Em seguida, lave suavemente o cólon com uma seringa de cinco mililitros cheia de PBS pré-resfriado. Descere e hidrate as seções do cólon.

Em seguida, core as seções do cólon com hematoxilina e eosina. Deixemos dois experimentadores independentes avaliarem os escores histológicos da amostra sob um microscópio de luz, a coloração de hematoxilina e eosina revelou que o tecido do cólon dos camundongos modelo de colite apresentou perda de cripta, dano às células caliciformes, infiltração de células inflamatórias e perda de epitélio. O tratamento com B cereus melhorou o dano histopatológico induzido pelo DSS.

Os escores histopatológicos dos camundongos com colite foram significativamente maiores do que no grupo controle. No entanto, os escores histopatológicos no grupo B cereus foram significativamente menores do que nos camundongos com colite. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos, a perda de peso corporal, os escores DAI e os escores histopatológicos foram maiores e o comprimento do cólon foi menor no grupo ABX / DSS em comparação com os camundongos no grupo ABX / controle.

A perda de peso corporal, o comprimento do cólon, os escores DAI e os escores histopatológicos não foram estatisticamente diferentes entre os grupos ABX/DSS e ABX/B cereus mais DSS. Os presentes resultados sugerem indiretamente que a microbiota intestinal desempenha um papel fundamental nos efeitos positivos do B cereus na colite. Um dos passos mais importantes é usar o Bacillus cereus pelo método de gavagem para construir a modelagem da colite em camundongos.

O tratamento de Bacillus cereus eliminou a colite induzida por DSS, o que levou a uma base para o estudo de acompanhamento de probióticos para o tratamento da colite.