Name: In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda a combinar hibridização in situ com imunohistoquímica em embriões de zebrafish crioseccionados para detectar simultaneamente mRNA e proteínas. Este método é essencial para estudos de expressão gênica em neurociência e biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado pela Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), pela Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e pela Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Todos os protocolos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nantong (nº S20191210-402).
1. Coleta de embriões de peixe-zebra
<ol><li>Configure um par de peixes-zebra em tanques de reprodução na noite anterior à coleta dos ovos, um peixe-zebra transgênico e o outro um peixe-zebra selvagem AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type ou Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (veja a Tabela de Materiais). Use uma divisória de plástico diagonal para separar o macho e a fêmea para impedir o acesso físico. No dia seguinte, encaixe a parte superior do tanque de reprodução em uma parte inferior limpa cheia de água doce e remova o divisor do tanque de reprodução. Deixe o peixe acasalar por 10-20 min, e colete os ovos depois que eles afundaram no fundo do tanque de reprodução.</li>
	<li>Cultivar os embriões em meio embrionário E3 (ver Tabela de Materiais) contendo azul de metileno (1 mL de azul de metileno a 0,05% em 1 L de meio embrionário E3) a 28,5 °C.</li>
	<li>Tratar os embriões 24 h após a fertilização (hpf) com feniltioureia (PTU, ver Tabela de Materiais) para evitar a formação de pigmentos. NOTA: Animais de ambos os sexos são usados em experimentos.</li>
</ol>2. Hibridização in situ
NOTA: A água utilizada para os passos 2.1-2.11 é a água tratada com pirocarbonato de dietilo (DEPC) (consulte a Tabela de Materiais).
<ol><li>Fixar ~10 embriões com 0,5-1 mL de paraformaldeído fresco a 4% (PFA, veja a Tabela de Materiais) em um tubo de microfuga de 1,5 mL a 4 °C durante a noite por 12-14 h. NOTA: O protocolo para hibridização in situ é ligeiramente modificado em relação à literatura previamentepublicada12. O PFA deve ser preparado na hora e armazenado a 4 °C no prazo de uma semana após a utilização ou durante um mês a -20 °C. Todas as etapas seguintes de hibridização in situ foram realizadas utilizando tubos de microfuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Use pinças para remover a pele apenas de embriões com mais de 48 hpf. NOTA: A pele é removida para facilitar a penetração de sondas de RNA na região do tronco de embriões com mais de 48 hpf.</li>
	<li>Desidratar gradualmente os embriões lavando com metanol a 25%, 50% e 75% em solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,1% sucessivamente (PBST, ver Tabela de Materiais) por 5 min cada à temperatura ambiente. Em seguida, lavar os embriões por 5 min em metanol 100% à temperatura ambiente. Incubar os embriões em metanol a 100% a -20 °C durante pelo menos a noite durante 12-14 horas. NOTA: Embriões desidratados podem ser armazenados em metanol 100% a -20 °C por 6 meses.</li>
	<li>Reidratar gradualmente os embriões lavando com 75%, 50% e 25% de metanol em PBST sucessivamente por 5 min cada um à temperatura ambiente. Lavar o embrião três vezes com PBST por 5 min cada em temperatura ambiente.</li>
	<li>Digerir os embriões com 10 μg/ml de proteinase K (ver Tabela de Materiais) em PBST à temperatura ambiente (ver Tabela 1).</li>
	<li>Lave os embriões com PBST por 5 min. Execute esta etapa de lavagem três vezes.</li>
	<li>Refixar os embriões lavados em PFA a 4% por 15 min à temperatura ambiente. NOTA: Esta etapa interrompe a digestão porque o PFA inativa a proteinase K. Certifique-se de que a amostra seja misturada suavemente para expor todos os embriões ao PFA; Os tubos podem ser colocados em seus lados para distribuir uniformemente os embriões na solução. Este PFA não precisa ser fresco (pode ser refrigerado por até 2 semanas).</li>
	<li>Lave o embrião três vezes com PBST, incubando por 5 min durante cada lavagem.</li>
	<li>Realizar a pré-hibridização dos embriões incubando com solução de pré-hibridização (preHYB, ver Tabela de Materiais) a 65 °C por 5 min. Substitua o preHYB por uma solução de hibridização (HYB, consulte a Tabela de Materiais) e pré-hibridize por pelo menos 4 h em HYB. NOTA: Antes de proceder à pré-hibridização, pré-aqueça as soluções a 65 °C. A formamida (ver Tabela de Materiais) é usada para manter a forma e a estrutura do tecido. A formamida também impede a ligação de fragmentos não homólogos a baixas temperaturas.</li>
	<li>Aquecer a sonda (Insm1a ou 5-HT2C) em HYB durante 5 min a 95 °C antes de adicionar aos embriões. Use a sonda a 1 μg/mL HYB. Remova o máximo possível de preHYB sem deixar os embriões entrarem em contato com o ar e adicione sonda pré-aquecida em HYB ao tubo que contém os embriões. NOTA: Uma sonda de RNA marcada pode ser usada para hibridizar com uma sequência de mRNA alvo nos embriões. Portanto, a sonda pode ser usada para detectar a expressão de um gene de interesse e a localização do RNAm.</li>
	<li>Permitir que a sonda hibridize durante a noite (12-14 h) a 50-70 °C. NOTA: A temperatura de hibridização difere para diferentes sondas.</li>
	<li>No dia seguinte, aspirar a solução da sonda com uma pipeta e armazená-la em um tubo a -20 °C para que possa ser reutilizada muitas vezes.</li>
	<li>Lave os embriões da seguinte forma:<ol><li>Lavar os embriões durante 15 min com 100% de HYB a 65 °C.</li>
		<li>Lavar os embriões sequencialmente com 75%, 50% e 25% de HYB em 2x citrato salino padrão contendo 0,1% de Tween-20 (SSCT, ver Tabela de Materiais) por 15 min cada a 65 °C.</li>
		<li>Lavar os embriões durante 15 min em 2x SSCT a 65 °C.</li>
		<li>Lavar os embriões durante 15 min em 0,2x SSCT a 65 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar os embriões duas vezes durante 10 minutos em tampão de ácido maleico contendo 0,02% de Tween-20 (MABT, ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloquear os embriões hibridizados e lavados durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente com solução de bloqueio a 2% 1 (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Substitua a solução de bloqueio-1 por antidigoxigenina AP (diluição de 1:4.000, consulte a Tabela de Materiais) em uma solução de bloqueio de 2% nova-1 e agite durante a noite por 12-14 h a 4 °C.</li>
	<li>Lavar os embriões quatro vezes por 30 min em MABT à temperatura ambiente. NOTA: Retire o BM roxo (consulte a Tabela de Materiais) da geladeira durante a terceira lavagem e agite-o ocasionalmente durante as lavagens subsequentes.</li>
	<li>Lavar os embriões duas vezes por 10 min em NTMT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, Tween-20 1%, ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Use uma pipeta para remover o máximo possível de NTMT dos embriões. Substitua pelo substrato BM purple AP e core os embriões à temperatura ambiente no escuro. Monitore as mudanças de cor a cada 30 min para controlar o grau de tingimento. OBS: O tempo específico de tingimento é diferente e precisa ser ajustado de acordo com cada sonda. A incubação dos embriões a 37 °C pode acelerar a reação. A incubação dos embriões a 4 °C pode aumentar o tempo de reação e pode ser feita durante a noite.</li>
	<li>Uma vez que é desenvolvido na extensão desejada, pare a reação enxaguando brevemente com NTMT duas vezes. Após hibridização in situ , enxaguar os embriões com PBST três vezes por 20 min.</li>
</ol>3. Incorporação
<ol><li>Imergir os embriões em sacarose a 5% em 1x PBS (ver Tabela de Materiais) durante a noite durante 12-14 h a 4 °C.</li>
	<li>Trocar a solução que cobre os embriões para 15% de sacarose em 1x PBS e incubar durante a noite por 12-16 h a 4 °C.</li>
	<li>Trocar a solução que cobre os embriões para 30% de sacarose em 1x PBS e incubar por 1-2 dias a 4 °C. NOTA: Incubar nesta solução até que os embriões afundem no fundo do tubo.</li>
	<li>Preencha um criomold com temperatura de corte ideal (OCT) (consulte a Tabela de Materiais). Transferir os embriões em sacarose a 30% para o criomolde com meio OCT. Mexa-os para retirar a sacarose dos embriões.</li>
	<li>Transfira os embriões para um novo criomolde para tecido e preencha-o suavemente com meio OCT, evitando a formação de bolhas.</li>
	<li>Submergir cada embrião, empurrando-o para o fundo do criomold, e colocar cada embrião na orientação desejada (dorso-ventral ou lateral). Mantenha os embriões em linha reta. NOTA: Recomenda-se vivamente a colocação de apenas um embrião em cada criomolde (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque os embriões embebidos em criomoldes em banho de etanol de gelo seco.</li>
	<li>Conservar a -80 °C pelo menos durante a noite durante 12-14 h. NOTA: Os criomoldes podem ser mantidos a -80 °C por pelo menos um mês.</li>
</ol>4. Criosecção
<ol><li>Ajustar as criossecções com um criostato a -20 °C.</li>
	<li>Retire o bloco da amostra do criomold e coloque-o no criostato. Coloque o meio OCT na base do mandril resfriado e coloque o bloco por cima.</li>
	<li>Certifique-se de que o bloco da amostra esteja paralelo à lâmina de barbear. Corte cuidadosamente o excesso de meio OCT ao redor do espécime.</li>
	<li>Corte em secções de 12-20 μm de espessura utilizando um criostato. Transfira rapidamente as seções para lâminas de vidro para que cada lâmina tenha de 3 a 4 seções. Permitir que as amostras atinjam a temperatura ambiente e armazenar as secções numa caixa deslizante selada a -80 °C para utilização posterior.</li>
</ol>5. Imunomarcação
NOTA: A coloração GFP é realizada nas seções.
<ol><li>Lave as lâminas contendo as seções com PBS por 5 min.</li>
	<li>Aqueça o tampão citrato para ferver no micro-ondas.</li>
	<li>Coloque as lâminas no tampão e continue a aquecer para manter a solução perto da ebulição por aproximadamente 20 min. Observação : esta etapa ajuda na recuperação de antígeno. O tecido permanece intacto mesmo em altas temperaturas, o que melhora a qualidade da coloração, evitando dobramento, dano ou descolamento dos tecidos.</li>
	<li>Deixe as amostras arrefecerem lentamente até à temperatura ambiente antes do passo seguinte. Escorra o excesso de solução, seque cuidadosamente a área ao redor de cada seção com um pedaço de tecido e desenhe um círculo ao redor da seção com uma caneta repelente de água (consulte a Tabela de Materiais) para formar uma barreira hidrofóbica. Tenha cuidado para não secar as seções de tecido.</li>
	<li>Lave as lâminas duas vezes com PBS, incubando por 10 min durante cada lavagem.</li>
	<li>Bloquear durante 2 h em solução de bloqueio-2 (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipetar a solução de anticorpos primários (α GFP monoclonal de ratinho, 1:250, ver Tabela de Materiais) por lâmina e incubar as lâminas numa caixa húmida imunohistoquímica a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lave as lâminas três vezes com PBS, incubando por 10 min durante cada lavagem.</li>
	<li>Drene o excesso de PBS. Incubar as lâminas com o anticorpo secundário apropriado (1:400, ver Tabela de Materiais) por 1 h à temperatura ambiente em PBS.</li>
	<li>Lave as lâminas três vezes com PBS, incubando por 10 min durante cada lavagem.</li>
	<li>Escorra o PBS excedente, pipete o meio de montagem no escorregador e monte com uma tampa deslizante.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
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<li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos+and+larvae+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Garbage+in%2C+garbage+out%3A+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este protocolo propõe uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, um passo importante nos experimentos de colocalização em embriões de zebrafish. Este método serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Hibridização in situ e coloração de anticorpos foram realizadas em embriões de zebrafish. Em contraste com vários protocolos publicadosanteriormente14,15,16, ...

O zebrafish é um poderoso modelo de vertebrado para estudos de desenvolvimento egenética1,2. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética (70% dos genes são compartilhados com o genoma humano), o que permite seu uso como modelo para doenças humanas3. No peixe-zebra, é bastante comum detectar os padrões de expressão de dois genes e sua relação espacial. A imuno-histoquímica foi utilizada pela primeira vez em 1941 para detectar patógenos em tecidos infectados por meio da aplicação de anticorpos marcados com FITC4. A proteína-alvo na seção de tecido é primeiramente marcada com um anticorpo primário, e a seção é então marcada com um anticorpo secundário contra a imunoglobulina da espécie hospedeira do anticorpo primário. A coloração de anticorpos é uma abordagem robusta para detectar a localização de proteínas, que oferece alta resolução óptica em nível intracelular. No entanto, o número de anticorpos disponíveis é muito limitado em peixes-zebra. Um estudo recente mostra que aproximadamente 112.000 anticorpos estão comercialmente disponíveis para camundongos; no entanto, muito poucos anticorpos demonstraram ser confiáveis em zebrafish5.
Em vez disso, em peixes-zebra, a hibridização in situ tem sido amplamente aplicada para análise de padrões de expressão gênica. Esse método foi utilizado pela primeira vez para avaliar a expressão gênica em embriões de Drosophila na década de 19806,7 e, desde então, essa tecnologia vem sendo continuamente desenvolvida e aprimorada. Inicialmente, sondas de DNA radiomarcadas foram usadas para detectar transcritos de RNAm; no entanto, a resolução espacial foi relativamente baixa, e houve riscos potenciais à saúde causados pela radioatividade. Posteriormente, a hibridização in situ depende das sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) ou fluoresceína (Fluo), que são conjugadas à fosfatase alcalina (FA) ou detectadas por amplificação fluorescente do sinal da tiramida (TSA)8,9. Embora a TSA tenha sido usada para detectar dois ou três genes, a marcação DIG de sondas de RNA e o anticorpo conjugado antiDIG AP ainda são abordagens altamente sensíveis, estáveis e amplamente utilizadas para hibridização in situ. Portanto, anticorpos comercializados combinados com sondas in situ marcadas com DIG são úteis para fornecer informações sobre a localização e expressão de proteínas de um gene.
Embriões de montagem total não podem revelar a relação espacial entre genes devido à baixa resolução óptica, embora os embriões de peixe-zebra sejam pequenos e transparentes10. Assim, o corte é necessário para analisar os padrões de expressão de genes em nível intracelular. A criossecção tem sido amplamente utilizada em peixes-zebra, pois é de fácil execução e pode efetivamente preservar o antígeno. Portanto, a hibridização in situ combinada com imunohistoquímica em criossecções de peixe-zebra oferece uma maneira poderosa de analisar os padrões de expressão de dois genes. Uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica foi aplicada ao zebrafish11. No entanto, o tratamento com proteinase K foi usado para aumentar a penetração da sonda em detrimento da integridade do antígeno. Para superar essa limitação, este protocolo utiliza o aquecimento para induzir a recuperação antigênica. Este protocolo não só é aplicável a embriões de diferentes estágios e cortes de tecidos de várias espessuras (cortes de cabeça de 14 μm e cortes medulares de 20 μm), mas também foi verificado usando genes expressos em dois órgãos, incluindo a cabeça e a medula espinhal.
Este artigo descreverá como combinar hibridização in situ e coloração de anticorpos em embriões de zebrafish em criossecções. A versatilidade deste protocolo é demonstrada pelo uso de várias combinações de hibridização in situ-imunohistoquímica, incluindo sondas de hibridização in situ para dois neurônios diferentes. Este método é adequado para detectar mRNA e proteína em diferentes regiões e embriões de diferentes idades, bem como os padrões de expressão de dois genes.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo secundário Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina AP Fragmentos de Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td> Reagente <td>de bloqueio de MAB3580</td><td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio-1</td><td>fabricada em laboratório</td><td>N/A</td><td>Dissolva o reagente de bloqueio em 1X MAB até uma concentração final de 10% (peso / vol). Autoclave e armazene a -20 &#176; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Solução de bloqueio-2</td><td>fabricada em laboratório</td><td>N / A</td><td>0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% soro de cabra em 1x PBS</td></tr><tr><td>BM roxo</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tampão citrato</td><td>Leagene</td><td>IH0305</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold para tecido, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>Head Biotechnology</td><td>H4566</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada</td> com <td>DEPC Sangon</td><td>Biotech B501005</td> Câmera <td></td></tr><tr><td>digital, microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>NI-SSR 931479</td><td></td></tr><tr><td>E3 meio embrionário</td><td>feito em laboratório</td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr> <tr><td>Formamida</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal de sódio</td><td>J & K Scientific</td><td>542858</td><td></td></tr><tr><td>HYB</td><td>feito em laboratório</td><td>N/A</td><td>preHYB mais 50 &micro; g/mL de sal de heparina sódica, 100 &micro; g/mL de sal de dietilaminoetanol de ácido ribonucléico</td></tr><tr><td>Caixa úmida imuno-histoquímica</td><td>Mkbio</td><td>MH10002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas leica de baixo perfil</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>MABT (1x)</td> <td>fabricado em laboratório</td><td>N/A</td><td>0,1 M ácido maleico, 0,15 M NaCl, 0,02% Tween-20, pH 7,5</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J& K Scientific</td><td>116481</td><td></td></tr><tr><td>azul de metileno</td><td>Macklin</td><td>M859248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NTMT</td><td>feito em laboratório</td><td>N/A</td><td>0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20</td></tr><tr><td>OCT médio</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP caneta</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ADI-950-233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 4%</td> <td>Abbexa</td><td>abx082483</td><td>feito em laboratório em 1x PBS</td></tr><tr><td>PBST (1x)</td> <td>feito em laboratório</td><td>N / A</td><td>1x PBS mais 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Feniltioureia</td><td>Merck</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (10x)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>preHYB</td><td>feito em laboratório</td><td>N / A</td><td>50% formamida, 5x SSC, 9,2 mM de ácido cítrico (pH 6,0), 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ribonucleico dietilaminoetanol sal</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL sem RNase</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20x)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>SSCT (0,2x)</td> <td>fabricado em laboratório</td><td>N/A</td><td>0,2x SSC mais 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (1x)</td> <td>feito em laboratório</td><td>N / A</td><td>1x SSC mais 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr>Centro <td>de Animais de Laboratório de Peixe-Zebra da Universidade de Nantong</td><td>N / A</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hibridização combinada com imunohistoquímica em embriões de zebrafish crioseccionados

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Como vertebrado, o zebrafish tem sido amplamente utilizado em estudos biológicos. Zebrafish e humanos compartilham alta homologia genética, o que permite seu uso como modelo para doenças humanas. O estudo da função gênica baseia-se na detecção de padrões de expressão gênica. Embora a imunohistoquímica ofereça uma maneira poderosa de avaliar a expressão de proteínas, o número limitado de anticorpos comercialmente disponíveis em zebrafish restringe a aplicação de costaína. A hibridização in situ é amplamente utilizada em embriões de peixe-zebra para detectar a expressão de RNAm. Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica para cortes de embriões de peixe-zebra. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. A imuno-histoquímica e a obtenção de imagens de uma única criossecção foram realizadas após hibridização in situ . O protocolo é útil para desvendar o padrão de expressão de dois genes, primeiro pela detecção in situ do transcrito e depois pela imunohistoquímica contra uma proteína na mesma seção.

Este protocolo pode ser usado para examinar simultaneamente o padrão de expressão de um RNAm e uma proteína. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho experimental. O receptor 5-HT2C é um subtipo do receptor 5-HT ligado pelo neurotransmissor serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT). É amplamente distribuída no sistema nervoso central (SNC) e pode regular significativamente uma variedade de funções cerebrais, incluindo apetite, humor, ansiedade e comportamento reprodutivo13....

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Este protocolo utiliza uma combinação de hibridização in situ e imunohistoquímica, e serve como uma maneira fácil e eficiente de analisar simultaneamente um RNAm e uma proteína. Este protocolo é aplicável a embriões em diferentes estágios, cortes de tecidos de várias espessuras e diferentes órgãos. Para começar, fixe aproximadamente 10 embriões com 0,5 a 1 mililitro de paraformaldeído fresco a 4% em um tubo de microfuga de 1,5 mililitro a quatro graus Celsius durante a noite por 12 a 14 horas.Desidratar gradualmente os embriões lavando com 25, 50 e 75% de metanol em PBST sucessivamente por cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Em seguida, lavar os embriões em metanol a 100% por cinco minutos à temperatura ambiente. Incubar os embriões em metanol a 100% a menos 20 graus Celsius durante pelo menos durante a noite, durante 12 a 14 horas.Reidratar gradualmente os embriões lavando com 75, 50 e 25% de metanol em PBST sucessivamente por cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Novamente, lave o embrião três vezes com PBST por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Digerir os embriões com 10 microgramas por mililitro de proteinase K em PBST à temperatura ambiente e lavar os embriões três vezes com PBST durante cinco minutos.Em seguida, refixar os embriões lavados em paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente. Novamente, lave o embrião três vezes com PBST enquanto incuba por cinco minutos durante cada lavagem. Para pré-hibridização dos embriões, incubá-los em solução de pré-hibridização a 65 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, substitua a solução de pré-hibridização pela solução de hibridização e pré-hibridize por pelo menos quatro horas. Aqueça a sonda na solução de hibridização por cinco minutos a 95 graus Celsius antes de adicionar aos embriões. Remova o máximo possível de solução de pré-hibridização sem deixar os embriões entrarem em contato com o ar.Ao tubo que contém os embriões, adicione a sonda pré-aquecida na solução de hibridização e deixe a sonda hibridizar durante a noite por 12 a 14 horas a 50 a 70 graus Celsius. No dia seguinte, aspirar a solução da sonda com uma pipeta e armazená-la em um tubo a menos 20 graus Celsius para que possa ser reutilizada muitas vezes. Lavar os embriões com solução de hibridização a 100% seguida de lavagem sequencial com solução de hibridização a 75, 50 e 25% em duas vezes a concentração de SSCT durante 15 minutos a 65 graus Celsius.Em seguida, lave os embriões em duas vezes e 0,2 vezes a concentração de SSCT por 15 minutos a 65 graus Celsius. Lavar os embriões duas vezes por 10 minutos em MABT à temperatura ambiente. Bloquear os embriões hibridizados e lavados por pelo menos duas horas à temperatura ambiente, com solução de bloqueio a 2%-1.Substitua a solução de bloqueio-1 por fosfatase alcalina antidigoxigenina em uma solução de bloqueio a 2%-1 fresca e agite durante a noite por 12 a 14 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, lavar os embriões quatro vezes em MABT por 30 minutos em temperatura ambiente. Novamente, lave os embriões duas vezes em NTMT e remova o máximo possível de NTMT dos embriões usando uma pipeta.Substitua pelo substrato de fosfatase alcalina roxa BM e core os embriões à temperatura ambiente no escuro. Uma vez que a mancha tenha se desenvolvido, pare a reação enxaguando brevemente duas vezes com NTMT. Após hibridização in situ, enxaguar os embriões com PBST três vezes por 20 minutos.Imergir os embriões em sacarose a 5% em PBS durante a noite por 12 a 14 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, troque a solução que cobre os embriões para 15% de sacarose em PBS e incube durante a noite por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius. Novamente, troque a solução que cobre os embriões para 30% de sacarose em PBS e incube por um a dois dias a quatro graus Celsius.Transfira os embriões para um novo criomold para tecido e preencha-o suavemente com meio de temperatura de corte ideal, evitando a formação de bolhas. Em seguida, corte os corpos de prova em seções de 12 a 20 micrômetros de espessura usando um criostato e transfira rapidamente as seções para lâminas de vidro. Permitir que as amostras atinjam a temperatura ambiente e armazenar as secções numa caixa deslizante selada a menos 80 graus Celsius para utilização subsequente.Lave as lâminas contendo as seções com PBS por cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas no tampão e aqueça a solução por aproximadamente 20 minutos para mantê-la próxima à temperatura de ebulição. Escorra o excesso de solução e seque cuidadosamente a área ao redor de cada seção com um pedaço de tecido.Em seguida, desenhe um círculo ao redor da seção com uma caneta hidrorrepelente para formar uma barreira hidrofóbica e bloqueie a seção por duas horas em solução de bloqueio-2 à temperatura ambiente. Pipetar a solução de anticorpos primários por lâmina e incubar as lâminas em uma caixa úmida imunohistoquímica a quatro graus Celsius durante a noite. Lave as lâminas três vezes com PBS enquanto incuba por 10 minutos durante cada lavagem e escorra o excesso de PBS.Em seguida, incubar as lâminas com o anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente em PBS. Novamente, lave as lâminas três vezes com PBS enquanto incuba por 10 minutos durante cada lavagem e escorra o excesso de PBS. Posteriormente, pipete o meio de montagem na corrediça e monte com uma tampa deslizante.A expressão do receptor 5-HT2C no sistema nervoso central foi detectada na linhagem transgênica foxP2 egfp-caax. A expressão simultânea de 5-HT2C foi observada na linhagem transgênica juntamente com os neurônios foxP2, os quais foram marcados pela proteína fluorescente verde fluoresceína. A expressão de insm1a, um fator de transcrição zinco-dedo na medula espinhal e neurônios motores do peixe-zebra, foi detectada na linhagem transgênica.A expressão simultânea de insm1a foi observada na linhagem transgênica juntamente com os neurônios hb9, os quais foram marcados pela proteína fluorescente verde fluoresceína. O peixe-zebra deve ser fixado com paraformaldeído preparado na hora.

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Research

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Neuroscience

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In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

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