Name: Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e diferenciá-las na linhagem muscular esquelética. Este método garante alta viabilidade celular com mínima contaminação endotelial.

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Agradecemos ao Sr. Ojas Tikoo pela ajuda nas filmagens e produção de vídeo. Também reconhecemos a ajuda recebida da equipe do GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinar de Pesquisa Avançada e Resultado de Nascimento-DBT-Índia), enfermeiros e altos oficiais de pesquisa do Gurugram Civil Hospital e do Dr. Pallavi Kshetrapal para ajudar na logística. Este trabalho foi apoiado por subvenções concedidas a Suchitra Gopinath do Departamento de Biotecnologia da Índia (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

O uso de tecido do cordão umbilical neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa de Células-Tronco (IC-SCR), pelo Comitê de Ética Institucional, Instituto Translacional de Ciência e Tecnologia em Saúde (IEC-THSTI), pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Civil, Gurugram, Haryana e pelo Comitê de Biossegurança Institucional, THSTI. Amostras de tecido do cordão humano foram colhidas a partir de partos a termo no momento do nascimento. O consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.
1. Isolamento de MSCs do tecido do cordão umbilical
<ol><li>No momento da entrega, corte pelo menos 5 cm de cabo, de preferência mais próximo da placenta, e esterilize o cabo limpando a superfície externa com 70% de etanol. Transfira o pedaço do tecido do cordão um tubo de coleta de 50 mL contendo soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para outro contendo o mesmo. Transporte o tubo de coleta com o nome do sujeito no gelo para o laboratório dentro de 1h. NOTA: Para um estudo maior, pode ser útil fazer código de barras nas amostras para permitir seu rastreamento ao longo do estudo. É importante ressaltar que todo o pessoal que manuseia tecidos humanos deve ser oferecido o regime completo da vacina contra hepatite B.</li>
	<li>No laboratório, ligue o UV por 25 min no capô BSL-2 para esterilizar instrumentos autoclaved e pipetas antes de usar.</li>
	<li>Transfira a peça do tecido do cabo do tubo de coleta para um prato tratado com cultura de tecido de 10 cm2 contendo PBS enriquecido com 5 g/L de glicose, 50 μg/mL gentamicina, 2,5 μg/mL de anfotoricina B, penicilina U/mL e 100 μg/mL streptomicy (esquema na Figura 1).</li>
	<li>Usando um bisturi, corte o tecido do cordão verticalmente ao longo de seu eixo longitudinal para obter duas peças cilíndricas. Devido à torção do cordão e à superfície mucoide, fixe o tecido com um par de fórceps presos na outra mão.</li>
	<li>Neste ponto, observe as artérias umbilicais e a veia e remova os vasos sanguíneos usando um bisturi para raspá-los em uma direção da superfície. Enxágüe o tecido do cordão umbilical mais uma vez em PBS para remover todo o sangue residual associado ao tecido. Certifique-se de que a raspagem é suave para preservar a integridade das células no WJ ao redor dos vasos.</li>
	<li>Pique cada metade do tecido do cordão em fragmentos do tamanho de 0,5 cm3 e coloque os fragmentos com a superfície luminal voltada para baixo sobre o prato. Incubar o prato brevemente por 10 min em uma câmara umidificada de 37 °C contendo 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, inunde o prato contendo as peças de tecido do cordão com 20 mL de médio contendo MEM Alpha Modification sem L-glutamina, ribo-e desoxyribonucleosídeos, 15% soro bovino fetal (não inativado pelo calor) e 50 μg/mL gentamicina. Adicione o meio de crescimento suavemente ao longo dos lados para evitar que as explantas teciduais sejam desalojadas de sua orientação. Adicione o excesso de meio para contabilizar uma fração que será absorvida pelas explantas teciduais durante a incubação.</li>
	<li>Após 3 dias de incubação, adicione meio fresco às culturas. Certifique-se de que as culturas estão protegidas contra choques e movimento das explantas enquanto manuseam os pratos.</li>
	<li>Após 1 semana, remova os fragmentos de tecido individualmente usando fórceps estéreis e descarte usando sacos de risco biológico apropriados para descarte. Mantenha o meio existente e adicione 10 mL de meio de crescimento fresco. Substitua o meio de crescimento a cada 4 dias até que colônias individuais atinjam uma confluência de 70%. NOTA: É provável que as células não sejam distribuídas uniformemente por todo o prato, pois haverá colônias proliferativas individuais que precisam ser monitoradas para confluência com o tempo. Geralmente, dentro de um mês, um prato de 10 cm2 gera células suficientes para ser dividido em um prato separado.</li>
	<li>Colher as células aderentes usando a solução trypsin/EDTA (1x 0,25% trypsin e 0,02% EDTA em Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugar a suspensão celular a 470 × g por 5 min a 25 °C e resuspensar a pelota celular em meio de crescimento.</li>
</ol>2. Imunofenoftipagem e propagação de uMSCS
<ol><li>Prossiga para a imunofenoftipagem uma vez que as células aderentes atingiram 50%-60% de confluência e estão bem espalhadas. Não realize análises de marcadores MSC em culturas totalmente confluentes, pois isso tende a causar a queda dos principais marcadores MSC.</li>
	<li>Após a trypsinização, distribua uma suspensão celular de 1 × 106 células/mL em tubos FACS (1 × 105 células/tubo) e colorir com anticorpos ligados ao fluoróforo apropriados (todas as 1:50 diluição) em combinação: não manchadas; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoróforo comum); controles de isótipo para cada fluoróforo. Registo de um número total de eventos de pelo menos 10.000 no citômetro de fluxo para análise posterior. NOTA: Uma vez que as células são analisadas para cada marcador de superfície separadamente, o gating em subconjuntos celulares não é necessário.</li>
	<li>Além dos marcadores acima, confirme a presença de marcadores de superfície positivos e negativos nas linhas uMSC criadas a partir de amostras individuais de tecido do cordão (Tabela 1).</li>
	<li>Analise as células rotuladas por citometria de fluxo e determine a porcentagem das células CD105+CD90+ e CD105+CD73++ Analise as células CD105+ e CD34-CD45− separadamente.</li>
</ol>3. Diferenciação de uMSCs em músculo esquelético
<ol><li>Placas de cultura de tecido de revestimento com 0,01% de colágeno e 20 μg/mL laminina na PBS. Cubra estas placas por um mínimo de 4h em temperatura ambiente.</li>
	<li>UMSCs de placa a uma densidade de 10.000 células/cm2 em meio de crescimento.</li>
	<li>Quando as células são 70% confluentes, aspiram o meio de crescimento e enxaguam as culturas 2x com PBS. Adicionar meio de diferenciação miogênica (M1) composto por DMEM + 5% de soro de cavalo + 0,1 μM dexametasona + 50 μM hidrocortisona aos uMSCs. Para determinar a cinética da progressão miogênica, adicione m1 médio a cada dois dias às culturas.</li>
	<li>Para determinar a cinética da progressão miogênica, analise uMSCs para pax7, myogenina e myhc expressão em 2 dias, 4-5 dias, 6-7 dias e 10-14 dias, respectivamente.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Passos críticos Um passo crítico neste protocolo é a coleta de tecido em condições assépticas, desde o momento da entrega até a manutenção de culturas estéreis, durante toda a duração da propagação. Durante a coleta do cabo, é essencial que o cabo não toque em nenhuma superfície não esterilizada e seja examinado externamente com 70% de etanol antes da coleta em tubos contendo PBS complementados com antibióticos. É importante limitar o tempo entre a coleta do cabo e o processamento do tecido para o iso...

O cordão umbilical humano foi creditado por possuir um robusto reservatório de células-tronco mesenquimais, que atualmente estão sendo exploradas para terapias regenerativas devido às suas robustas taxas de proliferação e diferenciação, propriedades imunomodulatórias e capacidade de gerar células de todas as três camadas germinativas1. O tecido do cordão umbilical consiste em múltiplos compartimentos, como o sangue do cordão umbilical, o subendotélio da veia umbilical e a geleia de Wharton (WJ), que por si só abrange três regiões indistintas - a zona perivascular, a zona intervascular e o subameamento ou o revestimento do cordão (CL)2. Embora os MSCs possam ser isolados de todas essas diferentes regiões e expressem amplamente os principais marcadores MSC, não há clareza sobre se esses compartimentos contêm a mesma população de uMSCs ou apresentam diferenças em suas potências de diferenciação3. Assim, os protocolos para o isolamento dos UMSCs requerem maior precisão em seu modo e região de isolamento, a caracterização robusta de potenciais de diferenciação e, finalmente, uma análise comparativa de diferentes compartimentos do cabo. 
Nesse contexto, poucos estudos demonstraram diferenças nos potenciais proliferativos e diferenciais do UMSC entre diferentes partes do cabo. Destes, análises comparativas entre os RCSS isolados das regiões cl e WJ revelaram maior potencial de proliferação em UMSCsderivados da CL 3,4. Em um estudo separado, os UMSCs derivados do WJ tiveram melhor desempenho em ensaios de proliferação em comparação com células perivasculares (HUCPV)5. Ao examinar diferenças entre os UMSCs derivados do sangue do cordão e os UMSCs derivados do tecido do cordão desprovidos de contaminação vascular, foi relatada expressão diferencial dos principais marcadores MSC entre os dois compartimentos, bem como o aumento das taxas de proliferação nos UMSCs derivados do tecido do cordão6.
Dos diversos estudos que examinam os potenciais de diferenciação dos MICOSCs principalmente em tecidos da linhagem de mesoderm, como linhagenia, adipogênica e linhagenia, muito poucos forneceram protocolos detalhados para diferenciação miogênica e caracterização subsequente, bem como análises comparativas entre vários compartimentos de cordão. Neste contexto, desenvolvemos um robusto protocolo de diferenciação muscular e observamos que os uMSCs derivados do tecido do cordão apresentam capacidades de diferenciação miogênica superiores em comparação com o sangue do cordãoumbilical 6. Aqui, um protocolo stepwise é detalhado para o isolamento de uMSCs de todo o tecido do cordão umbilical desprovido de células associadas à vasculatura, sua caracterização e sua diferenciação na linhagem miogênica.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Solução antibiótica 100x Líquido, endotoxina testada (10.000 U de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL em solução salina normal a 0,9%)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MyHC (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MyoD (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo antimiogenina (Clone F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Camundongo anti-clone CD90 humano 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II ou FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal, qualificado Brasil</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>não ser inativado</td></tr><tr><td>por calor FITC Mouse anti-humano Clone CD106 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-clone CD14 humano M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-clone CD31 humano WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-clone CD34 humano 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-clone CD45 humano HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Clone anti-humano CD49D do camundongo FITC 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>Clone anti-humano CD90 do rato FITC 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-humano HLA-A, B, C do rato FITC G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>clone anti-humano G18-145 do rato FITC</td> Software BD <td>Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modificação sem L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos</td><td>Hyclone</td><td>SH30568. FS</td><td>Meio basal para uMSCs</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-clone CD105 humano 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-clone CD44 humano 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-clone CD49E humano llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse anti-clone IgG humano G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse anti-humano CD73 CLONE AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH = 7,4</td><td>Solução de</td> tripsina / EDTA HiMedia <td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>(1x 0,25% de tripsina e 0,02% de EDTA em solução salina balanceada Hanks (HBSS)</td> <td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de células-tronco mesenquimal do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Explorar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais depende da facilidade de isolamento, potência em direção à diferenciação e confiabilidade e robustez da fonte. Descrevemos aqui um protocolo stepwise para o isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano (uMSCs), sua imunofenofoteca, e a propagação de tais culturas ao longo de várias passagens. Neste procedimento, a viabilidade dos MOSCs é alta porque não há digestão enzimática. Além disso, a remoção dos vasos sanguíneos, incluindo as artérias do cordão umbilical e a veia, garante que não haja contaminação de células de origem endotelial. Usando citometria de fluxo, os uMSCs no isolamento são CD45-CD34−, indicando ausência de células da linhagem hematopoiética. É importante ressaltar que eles expressam marcadores de superfície chave, CD105, CD90 e CD73. Após o estabelecimento de culturas, este artigo descreve um método eficiente para induzir a diferenciação nesses FUSÕES na linhagem muscular esquelética. Uma análise detalhada da progressão miogênica em uMSCs diferenciados revela que os uMSCs expressam Pax7, um marcador para progenitores miogênicos nos estágios iniciais de diferenciação, seguido pela expressão de MyoD e Myf5, e, finalmente, um marcador de diferenciação terminal, cadeia pesada de miosina (MyHC).

O sucesso do isolamento dos UMSCs do tecido do cordão umbilical é &gt;95%, ao contrário das baixas taxas de sucesso do sangue do cordão umbilical. Após o isolamento bem-sucedido dos uMSCs, a análise facs revela que todas as células são CD34−CD45−CD105+CD90+. No entanto, na análise comparativa, os ICSS isolados do sangue do cordão umbilical apresentam populações heterogêneas, em que uma proporção de células mostram CD34+CD45+CD105+ (~15%). Além d...

Descrevemos um protocolo para o isolamento das células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética.

Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Descrevemos nosso protocolo para isolar células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e um método robusto para diferenciá-las em linhagem muscular esquelética. Esta técnica nos permite isolar células-tronco mesenquimais que possuem alta viabilidade e calor, com pouca ou nenhuma contaminação de células de origem endotelial e induzir a diferenciação miogênica de forma eficiente nessas doenças. A torção do cabo e a consistência mucoide dificultam o manuseio do cabo.Mostramos como processar o cordão, não raspar a geleia do Wharton, e excluir células endoteliais da população. Depois de coletar o tecido do cordão umbilical no momento da entrega, transfira a peça de tecido do cordão um tubo de coleta para um prato tratado de cultura de tecido de 10 centímetros quadrados e lave o tecido cuidadosamente com PBS fresco. Para cuidar da torção do cordão e da superfície mucoide, fixar o tecido com um par de fórceps em uma mão.Usando um bisturi, corte o tecido do cordão verticalmente ao longo de seu acesso longitudinal para obter duas peças cilíndricas. Neste ponto, observe as artérias e veias umbilicais. Usando um bisturi, remova os vasos sanguíneos raspando-os em uma direção da superfície e enxágue o tecido do cordão umbilical na PBS para remover todo o sangue residual associado ao tecido.Pique cada metade do tecido do cordão em fragmentos de 0,5 centímetros cúbicos. Coloque os fragmentos com a superfície luminal voltada para baixo sobre o prato e incubar o prato brevemente por 10 minutos. No final da incubação, adicione 20 mililitros de médio contendo modificação MEM Alpha suavemente ao longo das laterais do prato contendo o tecido do cordão umbilical.Certifique-se de que as explantas não sejam desalojadas de sua orientação e adicione o excesso de meio para explicar uma fração que as explantas teciduais absorverão durante a incubação. Em seguida, coloque o prato na incubadora por três dias. Após o término da incubação, adicione meio fresco à cultura e garanta que as culturas estejam protegidas contra choques e movimento das explantas enquanto manuseam os pratos.Após uma semana, usando fórceps estéreis, remova os fragmentos de tecido individualmente e descarte-os usando sacos de risco biológico apropriados para descarte. Mantenha o meio existente e adicione 10 mililitros de meio de crescimento fresco. Substitua o meio de crescimento a cada quatro dias até que colônias individuais atinjam uma confluência de 70% Após a coloração das células descritas no manuscrito, analise as células rotuladas por citometria de fluxo e determine a porcentagem de células positivas CD105 CD90 e CD105 CD73 positivo.Analise as células negativas CD105 e CD34 CD45 em separado. Cubra a placa de cultura tecidual com colágeno de 0,01% e 20 microgramas por mililitro laminina na PBS e coloque-a no roqueiro por um mínimo de quatro horas em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o colágeno e lave a placa com PBS, em seguida, abome os UMSCs a 10.000 células por centímetro quadrado de densidade no meio de crescimento.Uma vez que as células atinjam 70% de confluência, aspire o meio de crescimento e enxágue a placa de cultura duas vezes com PBS. Para determinar a cinética da progressão miogênica, adicione m1 médio a cada dois dias às culturas e analise uMSCs para a expressão de pax7, MyoD, miogenina e miosina cadeia pesada em dois dias, quatro a cinco dias, seis a sete dias, e dez a quatorze dias, respectivamente. os uMSCs exibem a expressão de CD105 e CD90, e não expressam marcadores hematopoiéticos CD34 e CD45.Os uMSCs também foram positivos para a expressão do marcador uMSCs CD73, indicando que os uMSCs expressaram vários marcadores-chave. uMSCs mostraram expressão de pax7 nos dois primeiros dias da adição de M1, seguido pela expressão MyoD nos primeiros quatro dias da adição de M1. As células expressam proteína de miogenina aos seis dias de diferenciação, seguida pela expressão da cadeia pesada de miosina entre 10 dias e 14 dias da indução da diferenciação.970 genes foram regulados em resposta à indução da diferenciação miogênica em comparação com os uMSCs indiferenciados. Mais genes miogênicos foram regulados em uMSCs derivados do tecido do cordão umbilical em comparação com uMSCs derivados do sangue do cordão umbilical. Tanto o tecido do cordão umbilical quanto o sangue do cordão umbilical apresentaram regulação de genes relacionados às proteínas citoesquelletal, associados à ligação de actina e à montagem de sarcomere, transportadores associados à função contratil, manutenção da massa muscular, sinalização de cálcio e função enzimática.Recolher o tecido em condição asséptica e manter a cultura estéril. O cabo deve ser varrido externamente com 70% de etanol e processado o mais rápido possível. Muitas terapias regenerativas requerem um grande número de células de passagens precoces.Também pode ser usado como modelo para imitar todo o ambiente seco e refletir o metabolismo pós-natal.

generation-mesenchymal-stem-cells-from-human-umbilical-cord-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.

Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Aqui, propomos um protocolo para a diferenciação condrogênica das células-tronco pluripotentes induzidas por células derivadas de células mononucleares do sangue do cordão umbilical.

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Cordão umbilical humano (UC) podem ser obtido durante o período perinatal como resultado de pré-termo, termo e postterm entrega. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização de UC-derivado células-tronco mesenquimais (UC-MSCs) de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.

Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e diferenciá-las na linhagem muscular esquelética. Este método garante alta viabilidade celular com mínima contaminação endotelial.

Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética

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