De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olá, meu nome é Matt Lui. Sou pós-doutorando no laboratório de Leslie Sal na Universidade Rockefeller. E hoje eu gostaria de falar sobre os experimentos que temos feito para estudar a quimiotaxia larval.

O problema em que estamos interessados é bastante simples. Na verdade, ele está representado aqui nesta configuração. Acabei de transferir um grupo de larvas de Joseph nesta superfície de agros.

Este ambiente é bastante hostil e eles estão perto de morrer de fome. De alguma forma, esses animais precisarão encontrar o caminho para a fonte de alimento mais próxima e aqui estão alguns Este ambiente não é ideal para estudar o comportamento da quimiotaxia, então a primeira melhoria será substituir a banana por um produto químico.

Este produto químico é acetato de iso e é um dos sabores predominantes na banana. Portanto, este é o nosso sabor artificial e, ao usá-lo, temos um controle muito melhor do estímulo olfativo. A próxima melhoria é usar um ambiente fechado e tentar evitar de tal forma a flutuação na outra distribuição.

Então, aqui está o ensaio que usamos no laboratório há muito tempo. Esta é uma placa de Petri com uma superfície de agarro na parte inferior. O Agarro é ideal para larvas de ataques de quimioterapia porque as mantém hidratadas.

Nos dois lados da placa, você encontra uma outra tampa feita de Teflon e o que vamos fazer agora é introduzir acetato de isam de um lado e nenhuma ordem do outro lado. Feito isso, a ideia é fechar a placa de petróleo, esperar um pouco de tempo para oodor se difundir e depois abrir a placa. Introduza um animal aqui e deixamos o animal se mover por um certo período de tempo.

Este ensaio baseia-se na suposição de que, ao introduzir oodoro em um lado do prato, temos um gradiente que é estabelecido rapidamente e permanecerá estável durante o período do teste. Agora, o principal problema é que ninguém jamais demonstrou que o gradiente existe na placa. Pode muito bem ser que muito rapidamente após a adição do oodoro, você tenha uma distribuição homogênea do oodoro na placa de tal forma que o gradiente seja muito raso ou pode ser que vários minutos sejam necessários para que o gradiente seja estabelecido.

É claro que isso dependerá principalmente da pressão de vapor doodor que está sendo usado. A segunda questão está relacionada ao que é quantificado durante o experimento. Imagine que um animal começa a partir daqui, o X e depois de três minutos é encontrado nesta placa final, o X vermelho.

Uma coisa que você pode fazer é registrar a posição final do animal apenas após um certo período de tempo, três ou cinco minutos. Então, a única informação que você capturaria é a posição do início e, e acreditamos que é importante ter uma boa resolução sobre o comportamento do animal ao longo do tempo. Por exemplo, um animal dificilmente poderia ter se movido da posição inicial para a posição final, como aqui, ou poderia muito bem ter visitado a região ao redor do theodor por uma parte significativa do tempo e devolvê-lo antes do final do teste.

A conclusão que tiraríamos dessas duas situações é muito diferente. Em um caso, o animal pode não ter respondido ao estímulo, enquanto no outro caso certamente sim. As duas melhorias que tentamos alcançar são, primeiro, controlar a forma e a estabilidade do outro gradiente na arena.

Em segundo lugar, acompanhe o comportamento do animal em tempo real e guarde todas essas informações. Na próxima sequência, Sylvia apresentará como preparamos a diluição do pedido. Meu nome é S ti.

Sou assistente de pesquisa no laboratório de VAs trabalhando para material lui. Hoje vou mostrar como preparar os materiais para o sistema de câmara que usamos para rastrear animais. O principal problema com nosso sistema de câmara é que estamos usando odor disperso no ar.

Isso significa que, por exemplo, se as placas agros que usamos não forem planas, você poderá obter flutuações e concentrações entre os experimentos, o que introduzirá ruído no sistema. Então, vou mostrar e dar pequenas dicas para tentar reduzir o ruído no sistema. Portanto, os materiais para preparar a diluição do odor são um frasco de vidro, de preferência vidro escurecido, caso você esteja usando odores reativos leves com uma alíquota do odor de seu interesse.

Pipetas de vidro para preparar esta alíquota e um auxiliar mecânico de pipeta adequado. Em seguida, pontas de pipeta de óleo de parafina, seu pipetador padrão e pequenos frascos para a diluição. Mais uma vez, eles precisam ser de vidro e, de preferência, escurecidos e, em seguida, uma balança para fazer medições precisas e reduzir o ruído entre os experimentos.

Como os odores são altamente voláteis e alguns deles são tóxicos, eles são feitos dentro de um capuz. O primeiro passo para reparar uma diluição de odor é alíquota do odor que você vai diluir. Para preparar diluições precisas e minimizar a variação entre os experimentos, é necessário pesar tudo.

Então comece rotulando, fazendo uma concentração de um molar de butirato de etila. Primeiro, você prepara o óleo de parafina. O óleo de parafina é muito viscoso, por isso é importante tentar mergulhar a ponta da pipeta o mínimo possível no óleo de parafina, apenas o suficiente para poder sugar o óleo de parafina sem gerar bolhas.

Então é bom limpar o óleo paren extra na lateral da garrafa. Mais uma vez, como o óleo de paren é viscoso, é muito importante deixá-lo sair lentamente para o frasco. Depois de pipetar o óleo para em sua garrafa, não jogue fora a ponta imediatamente, pois mais se acumulará na parte inferior da ponta.

É bom preparar uma folha de cálculos antes de começar a diluir onde você já mediu o volume de óleo paren que você vai adicionar e também o peso, e depois fazer o mesmo também para o seu odor com também o peso. Dessa forma, você pode verificar a escala que você tem, todo o óleo de parafina que você precisa e todo o odor também. Se necessário, você despeja mais óleo paren e mede novamente até obter o peso certo.

Depois de ter o peso correto do óleo paren, tudo o que você precisa fazer é adicionar odorante usando os mesmos princípios. Está bem. Aqui vou mostrar como preparar larvas para rastreamento.

Costumamos usar larvas com seis dias de idade. Fazemos isso porque eles são grandes o suficiente para serem facilmente captados pelo nosso software e também ainda são muito ativos para saber se suas larvas são muito velhas para uso no rastreamento, você só precisa verificar se há larvas subindo pelas paredes. Se houver larvas subindo pela parede, elas são muito velhas e não serão particularmente ativas.

O primeiro passo para preparar suas larvas é mergulhá-las em 15% de sacarose. A razão pela qual usamos 15% de sacarose é que as larvas serão Boyd nesta solução e a comida se dissolverá parcialmente nela ou cairá para o fundo. Você derrama sacarose suficiente para que fique a cerca de, eu sei, um pouco menos de uma polegada do topo do seu, de sua garrafa ou frasco.

Então você pega uma espátula. Você já pode ver as larvas flutuando e você gentilmente cava a comida para desalojar todos os animais que estão cavando a comida, gire um pouco para separá-los da comida e depois sente-se por alguns minutos. Depois que a comida e as larvas se separarem adequadamente, pegue uma placa de Petri pré-rotulada e despeje-as na parte do bipe.

Mantenha a parte superior da placa de Petri, pois você a encherá com água e use-a como um receptáculo para larvas rastreadas, para que você possa separar quais você rastreou e quais não rastreou. Agora que você despejou as larvas na placa de Petri, é preciso esperar 30 minutos para que elas se adaptem à sacarose e atinjam o estado de fome. Isso significa que eles se comportarão melhor na configuração de rastreamento durante os 30 minutos aos quais a larva está se adaptando.

A sacarose é um bom momento para preparar as placas para rastreamento. Portanto, esses são topos de placas de 96 poços. Você pode comprá-los separadamente e esta é uma solução 3%aros que já foi aquecida.

Usamos 3% porque evita que as larvas cavem, mas também é denso o suficiente para que elas possam andar sobre ele e permanecer umidificados em cada topo da placa. Você deseja pipetar 25 mils de agros. É importante tentar evitar a formação de grandes bolhas no gel.

Também é importante colocar as placas em uma superfície plana, caso contrário, você pode aros géis que estão em um declive e podem afetar o comportamento das larvas. Depois que o aros endurece, empilhamos as tampas e as embrulhamos em filme plástico para evitar que sequem. Isso deve mantê-los em um bom estado para rastreamento por vários dias.

Nesta sequência, vou apresentar nosso ensaio comportamental, que difere um pouco do ensaio de prato de gasolina, sobre o qual falei anteriormente. O que você precisará são cabos de placas de 96 poços, bem como aqueles que contêm a camada agrícola. Os ensaios são compostos por três tampas, que são empilhadas.

O primeiro lábio não contém nada, está vazio e é usado apenas para isolar o sistema da superfície em que se encontra. A segunda camada contém Diego agro superfície. Aqui os animais serão colocados na superfície e agora, como mostrarei a seguir, introduzimos oodor no prato.

É importante usar uma tampa nova e nova toda vez que carregar oodoro. Isso é para evitar qualquer contaminação de um experimento para outro. Você também precisará de outra diluição.

Normalmente não usamos um corante para carregar o odor, mas aqui vou usá-lo para fins de ilustração. Esta é uma alta concentração de theodor. Embora este seja muito diluído, meu objetivo será criar um gradiente ao longo de uma linha.

Diga essa linha e queremos que a concentração aumente da esquerda para a direita. Para conseguir isso, usarei várias gotículas de ordem colocadas no anel de condensação com concentração crescente. Começo com a concentração mais alta, que será colocada na extremidade.

É importante dispersá-lo no anel. Agora prossigo com a próxima concentração, que é diluída duas vezes em relação à primeira, e coloco neste anel. Então não, eu tenho seis gotículas.

O primeiro contém uma concentração de, digamos, um. A segunda concentração de 0,5, duas vezes menor que a primeira. O terceiro é a concentração, 0,25, e assim por diante.

Portanto, temos uma série geométrica ao longo da linha. O próximo passo consiste em inverter esta tampa na superfície AAL e agora por tensão superficial, todas as gotículas permanecem suspensas na parte superior da tampa. Desenvolvemos uma técnica baseada em espectroscopia de infravermelho para medir toda a concentração na placa.

Ao aplicar essa técnica, conseguimos mostrar que, se você tiver uma série geométrica ao longo da linha do desodorante aqui, acabará com uma concentração de oodoro ao longo do comprimento que aumenta exponencialmente, conforme mostrado aqui, e ao longo da largura da placa. Temos um perfil que atingiu o pico logo abaixo da linha de odor. Aqui está a aparência da geometria real do gradiente.

Se você considerar a concentração doodor no ar, o bom é que conseguimos mostrar que o gradiente sua geometria é estável por pelo menos 15 minutos. Após a introdução da tampa superior, esperamos 30 segundos para permitir que o gradiente seja estabelecido. Em seguida, introduzimos o animal na arena.

O animal é introduzido sob a outra linha final entre as posições três e quatro, usamos um pequeno pino para transferir as larvas da solução de sacarose para a superfície agrícola. A transferência é feita pescando uma larva ao redor da cabeça da unha. Abrimos rapidamente a tampa, a larva é depositada na superfície do agarro.

Em seguida, fechamos a tampa. É importante minimizar o tempo que a tampa permanece aberta. Em seguida, você registra o movimento do animal por três ou cinco minutos.

A gravação real é feita. Com essa configuração de rastreamento, temos uma câmera conectada a um computador. O software de rastreamento de imagem que usamos é o Aton Vision da Nordis para coletar as informações sobre o movimento do animal e armazená-las como um arquivo digital.

Agora estamos prestes a iniciar o experimento comportamental. Temos a tampa com a camada aro. Temos as diluições.

Diego está preso na primeira tampa. Antes de carregar oodoro, é importante vórtice cada frasco. Usamos nossa diluição com a menor à esquerda e a mais alta aqui à direita.

Todas as seis gotículas serão carregadas na placa ao mesmo tempo. Para evitar a perda de odor, estamos usando aqui um Pipeter multicanal de seis mergulhos, 10 microlitros do odor são retirados de cada amostra de diluição e o odor é carregado ao mesmo tempo. Após o carregamento, a tampa agora está invertida na superfície dos agros.

O gradiente foi criado na placa nos últimos 30 segundos, como mostrei antes. Agora vou apresentar um animal na superfície de Diego. Assim que o animal é introduzido, começo a gravação.

O animal está aqui e seu movimento agora está sendo rastreado. Como você pode ver, o animal está seguindo a linha de odor e está indo em direção ao ponto de concentração mais alto do gradiente. Lembre-se de que a concentração aumenta da esquerda para a direita com uma forma exponencial.

Como você pode ver, a direção do movimento é constantemente corrigida. Com relação ao estímulo, o animal atingiu o ponto de concentração mais alto do gradiente e o retiramos da placa. O animal é descartado em outro prato para garantir que não rastreiemos o mesmo indivíduo duas vezes diretamente.

Depois de introduzirmos uma nova larva e iniciarmos uma nova gravação, aqui estão as regras que seguimos para o rastreamento. Paramos o rastreamento assim que o animal atinge a linha de concentração mais alta da placa, que corresponde a esta, esta aqui. Além disso, se um animal bater na parede, o rastreamento é interrompido porque queremos evitar qualquer interferência.

A primeira pergunta que abordamos foi bastante poderia. O que queríamos saber era se um animal podia ou não sentir o cheiro de theodor em uma certa concentração. Para fazer esse teste, o que normalmente fazemos é ter uma única fonte de odor em vez de ter várias.

Isso permite que você tenha um grau de liberdade para alterar a concentração na gota final do odor. Então, aqui, por exemplo, você tem uma gota de alta concentração, e aqui você tem uma gota de baixa concentração. O que normalmente fazemos é introduzir o animal na superfície de Diego logo abaixo da gota de Theodor e ver se o animal é ou não capaz de detectar sua presença e permanecer em sua vizinhança.

Agora eu gostaria de fazer um uso mais avançado do nosso ensaio. Imagine que você tem uma gota de ordem e registra várias trajetórias que são sobrepostas aqui, e você tem três delas. Você tem um indivíduo que gera essa faixa verde.

Você tem essa trilha laranja que é menos central, e então você tem essa trajetória rosa que representa um animal aparentemente circulando ao redor da fonte. Acreditamos que há muita informação para começar sobre os detalhes sobre as trajetórias. Por esse motivo, importamos a trajetória como série de posse para o matlab e realizamos a análise após a análise com o matlab.

Aqui está a distância até a fonte, provavelmente em função do tempo. Para as três trajetórias que foram exibidas anteriormente, você tem a trajetória verde, que permanece muito próxima da fonte. Você tem a trajetória laranja, que exibe significativamente mais ruído.

E então você tem essa trajetória roxa, que curiosamente mostrou que o animal deixou a fonte para ficar à distância, o que provavelmente correspondeu a uma concentração que era ótima. Aqui você vê a ilustração de 10 trajetórias, animais que são incapazes de cheirar. Estes são mutantes ou três mutantes B, que não são ellers.

E como você pode ver, toda essa trajetória ilustra que os animais não conseguiram detectar a fonte do odor e simplesmente a deixaram. Agora, em contraste com as estrelas, registramos aqui 10 trajetórias consecutivas para animais da torneira branca. É claro que esses animais são capazes de cheirar e, como você pode ver, todos eles se acumulam sob a fonte do desodorante.

As 20 trajetórias, que acabamos de apresentar, foram de fato adquiridas sem conhecer a identidade dos animais. Isso demonstra a eficiência e confiabilidade do nosso ensaio. Ao determinar se alguns mutantes são ou não capazes de cheirar aqui usando um gradiente exponencial, geramos várias faixas e queremos ter uma noção de quão bem os animais são capazes de seguir o outro estímulo final.

Então, vou mostrar agora 15 trajetórias registradas separadamente e, como você pode ver, os animais fazem um excelente trabalho em seguir o estímulo sob a outra linha final. Agora gostaríamos de prosseguir com um controle simples. Pode muito bem ser que os animais no gradiente exponencial tenham seguido a linha porque houve algum estímulo independentemente de sua concentração, apenas os animais seguiram em frente.

Então, para mostrar que eles estão de fato calculando a concentração ou algo relacionado à concentração e fazendo uso dela para direcionar seu movimento, temos agora essa geometria, que está perto de um telhado. A larva é introduzida aqui como de costume, e o que esperamos é que ela se mova ao longo da linha e então detecte que a concentração está caindo após esse ponto e retorne a ela. Assim, realizamos o teste com cinco animais.

Coletamos as trajetórias e agora as representamos sobrepostas a este slide. E como você pode ver, os animais partiram daqui, seguiram ao longo da linha, depois exploraram a região correspondente à maior concentração e principalmente ficaram lá. Isso sugere fortemente que eles são capazes de calcular outras concentrações em tempo real usando o ensaio de fonte única.

Pudemos fazer principalmente uma grande pergunta. Um cheiro de animal pode detectar um odor em uma determinada concentração usando um dispositivo de várias fontes? Nós somos, temos mais flexibilidade para mudar a forma do gradiente e determinar se um animal é ou não capaz de fazer uso dessas informações.

Eu gostaria de ilustrar essa ideia realizando um experimento simples. Nos gradientes que montamos até agora, tivemos uma forma exponencial ao longo da lente. Agora a questão é, se desafiarmos mais o al fazendo com que a concentração aumente linearmente ao longo da lente, eles ainda são capazes de encontrar seu caminho sob a outra linha final?

Este gráfico representa os dois tipos de gradiente. Testamos o exponencial em roxo e o gradiente linear em verde. Este é o gradiente linear, e vou escrever as diferentes concentrações de acetato de isam diluindo o óleo paren

Esta é uma série aritmética. Temos um gradiente linear que se estabelecerá e, como você pode ver, a inclinação é bastante rasa em comparação com o gradiente exponencial aqui, onde a concentração das extremidades também é de 0,5, mas vai até 0,03. A questão é: os navi são capazes de ataques de quimioterapia quando se deparam com um gradiente tão raso?

Aqui, a concentração real de acetato usada nas seis gotículas para o gradiente exponencial e para o gradiente linear. Como você pode ver, embora a concentração mais alta seja a mesma em ambos os casos para o gradiente linear, a concentração mais baixa aqui é bastante alta. Realizamos o experimento com o gradiente linear, e 15 trajetórias são representadas aqui de animais selvagens, e acreditamos que está bastante claro que esses animais foram capazes de detectar o gradiente linear e seguir esse sinal ao longo da linha do desodorante.

Portanto, acho que nosso ponto é claro. Antes de terminar aqui, gostaria de falar brevemente sobre as direções futuras para essa configuração de rastreamento. Embora essa configuração de rastreamento permita que você faça muitas coisas interessantes, por exemplo, ver um comportamento complexo em larvas por um período de tempo maior e mais longo, ela tem algumas limitações.

Por exemplo, você está limitado ao tamanho da sua placa, o que limita o tempo que você pode rastrear e os comportamentos complexos que você pode observar. Portanto, seria bom se pudéssemos desenvolver um sistema em que a placa fosse maior ou você não estivesse limitado pelos limites de uma placa. Outro problema é que com o software que temos agora, é difícil rastrear mais de um animal ao mesmo tempo, por isso não é possível observar os comportamentos da população em tempo real.

Outro aspecto interessante do comportamento que não podemos testar por meio dessa configuração são os movimentos tridimensionais reais das larvas no espaço. Ao rastrear animais, você verá que, por exemplo, quando eles atingem uma gota de odor, eles podem levantar a cabeça ou varrer a cabeça tentando detectar mudanças na concentração. Possivelmente isso não é possível com nossa configuração específica no momento, então seria bom desenvolver algo que nos permitisse fazer isso.