Name: Fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Aprenda a fabricar microgéis de quitosana sem emulsão tóxica para engenharia de tecidos. Este método controla o tamanho das partículas e permite liberação sustentada de moléculas terapêuticas.

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A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticos e de Pele do Instituto Nacional de Saúde sob os números de premiação R03AR068087 e R21AR071585 e pela Fundação Boettcher (#11219) para MDK. CBE foi apoiado pelo NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Colorado Denver. Foram utilizados ratos de 6 semanas de idade, Sprague-Dawley. O modelo de lesão da placa de crescimento de ratos foi criado após um relatório publicado anteriormente30.
1. Preparação do polímero chitosano
<ol><li>Obter chitosan de baixo peso molecular purificado e liofilizado (LMW) de fontes comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicione 495 mL de água dupla destilada (ddH2O) e uma barra de mexida a um béquer de 1 L. Adicione 5 g de chitosan (Passo 1.1.) e misture bem. NOTA: Chitosan é apenas solúvel com moderação em uma solução aquosa no pH fisiológico, de modo que o chitosan não se dissolverá facilmente nesta etapa.</li>
	<li>Adicione 5 mL de ácido acético glacial à solução quitosana acima preparada.</li>
	<li>Mexa coberto a 300 rpm por 18 h com o béquer definido em um banho de água mantido a 50 °C.</li>
	<li>Utilizando um frasco e funil Büchner, filtrar a solução chitosana através de tamanhos decrescentes de papel filtro: 22 μm, 8 μm e 2,7 μm (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicione a solução de chitosan filtrada ao tubo de diálise de celulose (ver Tabela de Materiais) e deixe dialisar em ddH2O em temperatura ambiente por 4 dias, alterando o ddH2O todos os dias. NOTA: Use água ddH2O ultrapura para a última alteração.</li>
	<li>Transfira a solução de chitosan dialisada para um béquer e ajuste o pH para 8.0 usando 1 M NaOH.</li>
	<li>Alíquotar o quitosan em tubos de centrífuga e centrífuga a 4000 x g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decante o supernatante para um fluxo de resíduos e resuspense o quitosan em ddH2O, repetindo 2x.</li>
	<li>Congele e lisephilize a pelota de chitosan.<ol>
<li>Todos os dias, remova o produto liofilizado e grave a massa. NOTA: Quando a massa do produto liofilizado não está mais mudando, o produto está totalmente seco e pode ser armazenado a -20 °C até estar pronto para uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fabricação de hidrogel chitosano
<ol><li>Adicione 2 mL de ácido acético de 6% e 120 mg de quitosan purificado (Passo 1) a uma seringa luer-lock de 10 mL para formar uma solução chitosana de 6% w/v.</li>
	<li>Conecte a seringa luer-lock a outra seringa idêntica usando um conector luer-lock feminino feminino e misture a solução para 30 s, ou até que o quitosano tenha totalmente dissolvido no ácido acético.</li>
	<li>Antes de cruzar, adicione qualquer agente terapêutico ou bioativo à solução chitosana (se necessário). Para o presente estudo, foram adicionados 200 ng de SDF-1a e TGF-b3 (ver Tabela de Materiais). NOTA: SDF-1a e TGF-b3 são agentes bioativos relevantes para a regeneração do tecido da placa de crescimento. O SDF-1a promove a migração de células-tronco mesenquimais para o local do defeito, e o TGF-b3 serve como um fator condrogênico para induzir a diferenciação dessas células-tronco pela linhagem condrogênica31. NOTA: Misture novamente o quitosano entre as seringas para incorporar totalmente o terapêutico.</li>
	<li>Prepare 100 mM de solução de crosslinker de estoque de genipin (ver Tabela de Materiais) em 100% etanol.</li>
	<li>Adicione 100 μL da solução genipin preparada (Passo 2.4.) à seringa contendo chitosan, e misture novamente entre seringas por 30 s.</li>
	<li>Extrude a mistura da seringa em uma placa de Petri de 35 mm, cubra-a com filme de parafina e incuba-a a 37 °C durante a noite em uma atmosfera umidificada. NOTA: A solução ficará azul-escura, indicando que ocorreu a reação transfronteiriça entre o quitosano e o genipin, levando à formação de microgel chitosano.</li>
	<li>Filtre o microgel chitosan preparado seguindo as etapas abaixo.<ol>
<li>Quebre suavemente o hidrogel em pedaços menores usando uma espátula. NOTA: As peças devem ser pequenas o suficiente para serem transferidas para a parte de trás de uma seringa de 10 mL, ~1-2 cm de diâmetro.</li>
		<li>Coloque um filtro do tamanho da malha desejada na parte de trás de uma seringa limpa de 10 mL. NOTA: A faixa de tamanho típica para microgels é entre 50-200 μm.</li>
		<li>Transfira as peças de gel quebradas para a seringa equipada com o filtro e adicione 6 mL de ddH2O. NOTA: O gel de chitosan vai inchar significativamente no meio aquoso, de modo que uma grande mudança no volume de gel é esperada.</li>
		<li>Conecte a seringa através de um conector Luer-lock a outra seringa limpa de 10 mL.</li>
		<li>Force a mistura gel + água através da seringa com o filtro para criar microgels com um diâmetro máximo especificado.<ol>
<li>Após a primeira filtragem, abra a parte de trás da seringa contendo o filtro e extrude a mistura de volta para esta seringa.</li>
			<li>Substitua a parte de trás da seringa e force a mistura através do filtro novamente.</li>
			<li>Repita a filtragem 5-6x ou até que haja pouca resistência através do filtro.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enxágüe e purifique os microgéis filtrados.<ol>
<li>Transfira a mistura de gel filtrada para um tubo cônico de 50 mL, leve o volume total até 20 mL com ddH2O e, em seguida, o vórtice da mistura para garantir a dispersão homogênea.</li>
		<li>Centrifugar os microgel a 100 x g por 5 min em temperatura ambiente e decantar a fase aquosa superior.</li>
		<li>Resuspenja os microgels em 10 mL de 70% de etanol, vórtice, e coloque sob luz UV por 1h para esterilizar.</li>
		<li>Centrifugar os microgel a 1.000 x g por 5 min à temperatura ambiente, descartar o etanol e enxaguar 3x com ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação de microgéis para aplicações in vitro ou in vivo
NOTA: Para o presente estudo, a regeneração da cartilagem nas lesões da placa de crescimento foi estudada em um modelo de rato. Para mais detalhes, consulte a referência31.
<ol><li>Resuspend as pelotas de microgel 1:1 no ddH2O. Os microgels podem ser armazenados por até 1 mês suspensos em ddH2O a 4 °C. Se um agente bioativo for usado, os microgels devem ser usados imediatamente.</li>
	<li>Crie o local da lesão no animal após um relatório publicado anteriormente30.</li>
	<li>Lave o local da lesão com soro fisiológico e mantenha o animal sem tratamento (para estudo de controle) ou injete apenas os microgésis chitosanos ou os microgéis carregados com os agentes bioativos (Passo 3.2.).</li>
	<li>Feche a ferida no animal e administre analgésicos pós-cirúrgicos30.</li>
	<li>Nos dias 7 ou 28 pós-cirurgia, eutanize o rato por overdose de CO2 , extirpar os membros e realizar histologia para avaliar a reparação tecidual no local da lesão31.</li>
</ol>

<ol><li>Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+of+the+incidence+of+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis of the incidence of physeal injuries.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).</li>
<li>Mann, D. C., Rajmaira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+physeal+and+nonphyseal+fractures+in+2%2C650+long-bone+fractures+in+children+aged+0-16+years%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).</li>
<li>Eid, A. M., Hafez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+injuries+of+the+distal+femoral+physis.+Retrospective+study+on+151+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases.</a> Injury. 33 (3), 251-255 (2002).</li>
<li>Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+physeal+closure+following+distal+tibia+physeal+fractures%3A+a+new+radiographic+predictor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor.</a> Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).</li>
<li>Shaw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+approaches+for+the+treatment+of+pediatric+physeal+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+growth+arrest%3A+current+practice+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Orthopaedics+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">Management of growth arrest: current practice and future directions.</a> Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).</li>
<li>Williamson, R. V., Staheli, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+physeal+growth+arrest%3A+treatment+by+bridge+resection+and+fat+interposition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).</li>
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<li>Mora-Boza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+generation+of+chitosan+microgels+containing+glycerylphytate+crosslinker+for+in+situ+human+mesenchymal+stem+cells+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation.</a> Materials Science and Engineering: C. 120, 111716(2021).</li>
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<li>Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+kinetics+of+the+crosslinking+reaction+between+biopolymers+containing+primary+amine+groups+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymer+Science+Part+A%3A+Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).</li>
<li>Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+migration+ability+of+mesenchymal+stromal+cells+by+targeting+the+SDF-1%2FCXCR4+axis%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis.</a> BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).</li>
<li>Tang, Q. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B23%3A+A+potential+biological+therapy+for+enhancing+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).</li>
<li>Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+particle+shape+in+size+analysis+and+the+evaluation+of+comminution+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Particulate+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes.</a> Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).</li>
<li>Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+physicochemical+characterization+of+nanoparticles+in+pharmaceutical+product+development%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Fundamentals+of+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development.</a> Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os microgels têm sido amplamente pesquisados nos últimos anos devido ao seu alto nível de aplicabilidade para vários fins, como entrega de medicamentos ou encapsulamentocelular 9. A facilidade de fabricação de construtos de micromateriais é de relevância significativa na engenharia de tecidos, pois permite aos pesquisadores desenvolver estratégias baseadas em hidrogel em um tamanho específico e escala de tempo. No entanto, a maioria dos métodos para fabricar microgels chitosanos exigem equipamento...

A placa de crescimento, também conhecida como fise, é a estrutura de cartilagem localizada no final de ossos longos que media o crescimento em crianças. Se a placa de crescimento se machucar, pode ser formado tecido de reparação conhecido como "barra óssea", que interrompe o crescimento normal e pode causar defeitos de crescimento ou deformidades angulares. Dados epidemiológicos mostram que 15%-30% de todas as lesões esqueléticas infantis estão relacionadas à placa de crescimento. A formação da barra óssea ocorre em até 30% dessas lesões, tornando as lesões da placa de crescimento e seu tratamento associado um problema significativo de manifestação clínica 1,2,3,4. Quando ocorre a formação da barra óssea, a avenida de tratamento mais comum envolve a ressecção da barra óssea e a inserção de um material interposicional, como tecido de silício ou adiposo5. No entanto, os pacientes submetidos à cirurgia de ressecção da barra óssea muitas vezes têm um prognóstico ruim para a recuperação completa, já que atualmente não há tratamento que possa reparar totalmente uma placa de crescimentolesionada 6,7,8. Diante dessas deficiências, há uma necessidade crítica de estratégias eficazes para o tratamento de lesões de placas de crescimento, tanto na prevenção da formação de uma barra óssea quanto na regeneração do tecido saudável da cartilagem fiseal.
Micropartículas de hidrogel, ou microgésis, ganharam recentemente interesse como andaimes injetáveis que podem fornecer liberação sustentada de terapêutica9. Devido à sua alta sintonia e biocompatibilidade, os microgésis também são adequados para fator bioativo ou encapsulamento celular. Os microgels podem ser feitos de diversos materiais, desde polímeros sintéticos, como polietileno glicol (PEG), até polímeros naturais como alginato ou quitosan 10,11,12. Chitosan tem mostrado ter vários efeitos benéficos para a engenharia tecidual, como sua capacidade de desestabilizar a membrana externa de bactérias gram-negativas, oferecendo assim atividade antimicrobiana inerente1 3,14. Além disso, o chitosan é econômico, interativo por células e facilmente modificado usando sua estrutura contendo amina. Microgéis baseados em Chitosan prometem uma estratégia de biomaterial para a entrega de medicamentos e sinalização material que pode promover a regeneração tecidual, evitando infecções bacterianas. No entanto, microgels chitosanos são frequentemente fabricados com uma ampla gama de técnicas que requerem equipamentos especiais, técnicas de emulsão ou enxágües de solventes citotóxicos. Por exemplo, alguns estudos fabricaram microgelos chitosanos com métodos baseados em emulsão, mas esses protocolos exigem enxaguantes solventes e crosslinkers citotóxicos, potencialmente negando sua tradução para configurações clínicas15,16. Outros estudos utilizaram microfluidos ou abordagens de eletrospray para fabricar microgels chitosanos, que requerem equipamentos especiais, preparação e treinamento 17,18. Microgéis chitosan também são comumente feitos com um processo dropwise de crosslinker em solução chitosana; no entanto, este método é altamente dependente da viscosidade da solução, concentração de polímeros e taxa de fluxo, dificultando o controle do tamanho e dispersão dos microgésis19,20. Por outro lado, o método de fabricação de microgel descrito aqui não requer equipamentos especializados ou enxaguantes solventes, tornando esses microgésis viáveis para fabricação em quase qualquer laboratório ou configuração. Portanto, esses microgésis representam biomateriais altamente relevantes para um veículo de entrega de medicamentos rápido, econômico e fácil de produzir para muitas aplicações.
Ao modular a composição e características materiais de um microgel, os pesquisadores podem obter controle preciso sobre o microambiente celular, direcionando assim o comportamento celular de forma dependente do material. Os microgels podem ser empregados por conta própria ou combinados com sistemas biomateriais a granel para transmitir funcionalidades específicas, como a liberação estendida de fatores bioativos ou sinalização especial precisa para células nativas ou exógenas. Biomateriais e microgésis surgiram como caminhos de tratamento atraentes para lesões de placas de crescimento. Esforços significativos têm sido dedicados ao desenvolvimento de biomateriais à base de alginato e chitosan para tratar lesões de placas de crescimento 21,22,23,24,25. Devido à natureza temporal dinâmica da ossificação da placa de crescimento e do alongamento ósseo, o mecanismo de formação de barras ósseas não é totalmente compreendido. Por isso, diversos modelos animais foram desenvolvidos para melhor elucidar os mecanismos de ossificação endocondral e formação de barras ósseas, como em ratos, coelhos e ovelhas 26,27,28. Um desses modelos é um modelo de lesão de placa de crescimento de ratos, que usa um defeito de furo na tíbia de rato para produzir uma barra óssea de forma previsível e reprodutível e imita lesões humanas em todas as três zonas da placa de crescimento29,30. Várias estratégias baseadas em biomateriais para o tratamento de lesões de placas de crescimento foram testadas usando este modelo. Além disso, foram desenvolvidos dois métodos diferentes para a fabricação de microgéis chitosanos, que podem ser usados como um sistema biomaterial injetável que libera terapêuticas de forma sustentada10,31. Estes microgels foram empregados em um modelo de lesão fiseal de ratos, e apresentaram melhor regeneração da cartilagem31 ao liberar SDF-1a e TGF-b3. As técnicas fornecidas neste protocolo descrevem métodos desenvolvidos para fabricar esses microgéis chitosanos, que podem então ser empregados em uma ampla variedade de aplicações de engenharia de tecidos. Por exemplo, estudos recentes têm usado microgelis quitosanos termo ou magento-responsivos para aplicações de entrega de medicamentos oncológicos controlados32,33.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>SigmaAldrich</td><td>AX0073</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringa Luer-Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner Funil</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB966F</td><td>100 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Quitosana (baixo peso molecular)</td> <td>SigmaAldrich</td><td>448869</td><td>75-80% de desacetilação</td></tr><tr><td>Tubo de membrana de diálise</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-670-5C</td><td>3500 MWCO</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SigmaAldrich</td><td>493538</td><td></td></tr><tr><td>Genipin</td><td>SigmaAldrich</td><td>G4796</td><td></td></tr><tr><td>Heracell Incubadora 150i</td><td>ThermoFisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano SDF-1a</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano TGF-b3</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papel de Filtro Grau 540</td><td>SigmaAldrich</td><td>Z241547</td><td>tamanho de poro de 8 mm</td></tr><tr><td>Papel de Filtro Whatman Grau 541</td><td>SigmaAldrich</td><td>WHA1541055</td><td>22 mm tamanho de poro</td></tr><tr><td>Whatman Papel de filtro Grau 542</td><td>SigmaAldrich</td><td>WHA1542185</td><td>2,7 mm tamanho de poro</td></tr><tr><td>Peneira de malha de arame</td><td>McMaster-Carr</td><td>9317T86</td><td>No. 100 Mesh</td></tr></tbody></table>

fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Os microgéis chitosanos são de interesse significativo em engenharia de tecidos devido à sua ampla gama de aplicações, baixo custo e imunogenicidade. No entanto, os microgéis chitosanos são comumente fabricados usando métodos de emulsão que requerem enxágües de solventes orgânicos, que são tóxicos e prejudiciais ao meio ambiente. O presente protocolo apresenta um método rápido, não citotóxico, não baseado em emulsão para fabricação de microgéis de genipin chitosano sem a necessidade de enxaguantes orgânicos de solventes. Os microgésis aqui descritos podem ser fabricados com controle de tamanho preciso. Eles exibem a liberação sustentada de biomoléculas, tornando-as altamente relevantes para engenharia de tecidos, biomateriais e medicina regenerativa. Chitosan é interligado com genipin para formar uma rede de hidrogel, em seguida, passou por um filtro de seringa para produzir os microgésis. Os microgésos podem ser filtrados para criar uma variedade de tamanhos, e eles mostram inchaço dependente de pH e degradam-se ao longo do tempo enzimaticamente. Esses microgésis foram empregados em um modelo de lesão de placa de crescimento de ratos e foram demonstrados para promover o aumento da reparação de tecidos de cartilagem e para mostrar degradação completa aos 28 dias in vivo. Devido ao seu baixo custo, alta conveniência e facilidade de fabricação com materiais citocompatíveis, esses microgéis chitosanos apresentam uma tecnologia excitante e única na engenharia de tecidos.

A fabricação bem sucedida de microgéis chitosanos depende da reação transversal entre genipin e chitosan, especificamente envolvendo as aminas nas cadeias de polímeros chitosanos. Em contraste com outras técnicas de fabricação de microgel, este método não requer emulsões ou enxaguantes de solventes e pode ser conduzido de forma rápida e fácil com equipamentos baratos. Um indicador marcante para a fabricação bem sucedida de microgel é a mudança de cor distinta de off-white para azul escuro depois que o chitosan e genipin ...

O presente protocolo descreve um método não baseado emulsão para a fabricação de microgéis de genipin quitosano. O tamanho desses microgésis pode ser precisamente controlado, e eles podem exibir inchaço dependente de pH, degradar in vivo, e ser carregados com moléculas terapêuticas que liberam ao longo do tempo de forma sustentada, tornando-os altamente relevantes para aplicações de engenharia de tecidos.

Fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...

Este protocolo permite a fabricação conveniente de microgéis chitosanos sem solventes tóxicos que podem ser usados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e entrega de medicamentos. Esta técnica não requer equipamento especial ou treinamento e não requer técnicas tóxicas de emulsão ou enxágues solventes, tornando-a altamente biocompatível e traduzível para um ambiente clínico. Aplicamos essa técnica como uma estratégia biomaterial para o tratamento de lesões de placas de crescimento.No entanto, acreditamos que essa técnica também será útil em outras aplicações de medicina regenerativa, também. Esta técnica pode ser aplicada a outras aplicações de medicina regenerativa que se beneficiariam de um sistema de andaimes injetáveis, biodegradáveis e biomateriais com potencial para liberação sustentada de medicamentos. Comece adicionando ácido acético e chitosan purificado a uma seringa de bloqueio Luer de 10 mililitros para formar uma solução chitosana de peso por volume de 6%.Usando um conector de bloqueio Luer fêmea fêmea, conecte duas seringas de bloqueio Luer, em seguida, misture a solução para frente e para trás até que o chitosan em tenha totalmente dissolvido no ácido ascético. Agora adicione 100 microliters da solução genipin à seringa contendo quitosan e misture para frente e para trás entre as seringas por 30 segundos, em seguida, ejete a mistura da seringa em uma placa de Petri de 35 milímetros. Cubra a placa de Petri com filme de parafina e incuba-o a 37 graus Celsius durante a noite em uma atmosfera umidificada.Use uma espátula para quebrar o hidrogel em pedaços menores e, em seguida, coloque um filtro do tamanho da malha desejada na parte de trás de uma seringa limpa de 10 mililitros. Transfira as peças de gel quebradas para a seringa equipada com o filtro e adicione 6 mililitros de água dupla destilada. Conecte a seringa através de um conector de travar Luer a outra seringa limpa de 10 milímetros.Force a mistura de gel e água através da seringa com o filtro para criar microgels. Após a primeira filtragem, abra a seringa contendo o filtro e adicione a mistura de volta nesta seringa. Force a mistura através do filtro novamente.Agora, transfira a mistura de gel filtrada para um tubo cônico de 50 mililitros e adicione água dupla destilada para levar o volume a 20 mililitros. Vortex a solução para obter uma solução homogênea. Centrifugar os microgel a 100 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente.Após a centrifugação, remova a fase aquosa superior e resuspenja os microgel em 10 mililitros de 70% de etanol, em seguida, vórtice dos microgésis e coloque-os sob luz UV por uma hora para esterilizar. Agora, centrifugar os microgels a 1000 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente. Descarte o etanol e enxágue 3 vezes com água dupla destilada.Resuspenda as pelotas de microgel em um volume igual de água dupla destilada. Com o aumento do pH, os microgésis apresentaram queda no inchaço, como descrito pela mudança no diâmetro de Feret. Além disso, o tamanho das partículas de microgel depende do tamanho dos poros do filtro utilizado.A malha número 200 produziu pequenas partículas, enquanto a malha número 100 deu origem a grandes partículas. A presença de microgésis no local ferido promoveu a regeneração da cartilagem. A coloração de hematoxilina azul alciano mostrou que microgelados injetados no tecido ferido impediram a formação precoce de barras ósseas e microgésis carregados com agentes bioativos SDF-1a e TGF-B3 promoveram a formação da cartilagem.É importante garantir que o filtro de malha de arame seja colocado corretamente na seringa para que uma filtragem eficaz possa ocorrer. Também é importante repetir a filtragem algumas vezes para garantir uma distribuição homogênea do tamanho do microgel. Esses microgéis podem ser aplicados a uma grande variedade de aplicações de engenharia de tecidos que requerem um substrato de andaimes biomaterial que tem o potencial de liberação sustentada de terapêuticas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um grande obstáculo em terapias com células-tronco atuais é determinar o método mais eficaz para entregar essas células para tecidos do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método de entrega de quitosana-base que é eficiente e simples na abordagem, ao mesmo tempo permitindo que as células-tronco adiposas para manter a sua multipotency.

Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Nós apresentamos um método fácil de fabricar uma plataforma de liberação do fármaco à base de gelatina biodegradável que é magneto-termicamente responsivo. Isto foi conseguido através da incorporação de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético e poli (N-co isopropylacrylamide- -acrilamida) dentro de uma rede de micro-reticulada de gelatina esférica por genipina, em conjunto com um sistema de aplicação do campo magnético alternado.

Alternando microgéis de gelatina híbrido Campo-Responsive magnética para controlada de fármacos de libertação

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

A eletroforese capilar em solução livre é um método analítico rápido, barato e robusto que permite o monitoramento quantitativo de reações químicas em tempo real. Sua utilidade para análise rápida, conveniente e precisa é demonstrada aqui através da análise de enxerto de peptídeo covalente em filmes de quitosana para melhorar a adesão celular.

Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Aqui nós descrevemos uma preparação superficial de hidrogel injetável à base de quitosana usando química imina dinâmico. São apresentados métodos para ajustar a força mecânica do hidrogel e sua aplicação em cultura de células 3D.

Preparação do hidrogel injetável à base de quitosana e sua aplicação em cultura de células 3D

Apresentado aqui é um método para a bioimpressão 3D de gelatina methacriloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Apresentada aqui é uma técnica de impressão 3D leve impulsionada por forças viscosas-inerciais alternadas para permitir a construção de microcarriers de hidrogel. Bicos caseiros oferecem flexibilidade, permitindo fácil substituição para diferentes materiais e diâmetros. Microcarriers de ligação celular com diâmetro de 50-500 μm podem ser obtidos e coletados para posterior cultivo.

Impressão 3D de Microcarriers de hidrogel in vitro alternando jatos de força viscosa-inercial

Este trabalho descreve métodos simples, adaptáveis e de baixo custo para fabricar microgels com fragmentação de extrusão, processar os microgésis em hidrogéis granulares injetáveis e aplicar os hidrogéis granulares como tintas de impressão extrusão para aplicações biomédicas.

Fragmentando hidrogéis a granel e processando em hidrogéis granulares para aplicações biomédicas

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para sintetizar os blocos de construção de microgel para andaime de partículas de annealed microporoso, que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicamentos regenerativos.

Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

Aprenda a fabricar microgéis de quitosana sem emulsão tóxica para engenharia de tecidos. Este método controla o tamanho das partículas e permite liberação sustentada de moléculas terapêuticas.

Fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos

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