Indução da inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos

Este protocolo descreve sequencialmente as etapas envolvidas na indução da inflamação da superfície ocular e na coleta de órgãos afetados associados envolvidos na disfunção da glândula de Meibom. Este novo modelo de MGD permite a investigação do aspecto imune inato da doença, particularmente a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos ocluindo a glândula de Meibom. A técnica exposta no protocolo pode ser estendida para introduzir intervenções terapêuticas tópicas em estágio pré-clínico.

Além disso, a coleta de exsudados oculares e órgãos reflete a eficácia do tratamento. Para realizar a injeção intraperitoneal da solução de imunógeno, segure o camundongo C57 preto seis não anestesiado de sete a nove semanas de idade suavemente pela cauda enquanto agarra a grade da gaiola. Em seguida, segure firmemente a pele das costas e a região do pescoço entre o polegar e o dedo indicador e fixe a cauda e os membros inferiores entre o anel e o dedo mínimo contra a palma da mão.

Mantendo o rato fixo com a cabeça para baixo, injete 100 microlitros da solução de imunógeno preparada no quadrante direito ou esquerdo da cavidade abdominal inferior. Para realizar um desafio de superfície ocular após a imunização, aplique cinco microlitros de ovalbumina ou óvulos ou soro fisiológico por olho de um rato anestesiado e aguarde cinco minutos para que a gota seja absorvida pelo olho. Em seguida, colete os exsudados oculares aplicando 50 microlitros de solução salina estéril no olho imediatamente após o desafio.

Para a excisão dos tecidos da superfície ocular, coloque o rato sobre uma superfície uniforme e desinfete a área orbital ao redor do olho com um cotonete de etanol a 70%. Para formar uma incisão ao redor do olho, faça uma incisão entre a orelha e o seio retroorbital e ao longo da superfície acima do osso escamoso verticalmente, estendendo a incisão horizontalmente abaixo da pálpebra inferior ao longo do osso maxilar e acima da pálpebra superior ao longo do osso frontal. Segure cuidadosamente o tecido dissecado ao redor do olho usando pinça curva e puxe o tecido e o globo ocular para fora.

Coloque os órgãos excisados em PBS estéril. Em seguida, usando um bisturi sob o microscópio estéreo, corte o excesso de tecido muscular facial ao redor das pálpebras superiores excisadas. Para coletar a conjuntiva coloque a pálpebra superior em uma placa de Petri seca.

Em seguida, usando pinças finas e um bisturi, descasque a camada de muco esbranquiçada suavemente para fora da superfície interna da pálpebra. Ao lado de dissecar a córnea, coloque o globo ocular em uma nova placa de Petri seca em cima do gelo seco. Após três minutos, coloque o prato na superfície do banco em uma posição estável.

Use uma tesoura fina e afiada para fazer uma pequena incisão na borda da córnea ao lado do limbo. Continue a incisão com o bisturi ao redor do globo ocular, separando a esclera da córnea. Em seguida, remova os restos da íris e da lente da parte de trás da córnea, lavando generosamente com solução salina.

Para avaliar a glândula meibomiana e seus orifícios, coloque as pálpebras excisadas em uma posição vertical sob o microscópio estéreo. Em seguida, de acordo com o tempo de exposição da câmera e as configurações ISO, capture imagens sob epiiluminação de luz branca. Para avaliar a área da glândula de Meibom, coloque as pálpebras excisadas em uma posição horizontal e ligue a luz de fundo do microscópio estéreo equipado com uma câmera infravermelha.

Capture imagens ajustando o tempo de exposição de acordo com o ISO da câmera. Camundongos administrados salinamente mostraram superfícies oculares saudáveis com os olhos bem abertos. Em comparação, a aplicação de óvulos induz inflamação grave da superfície ocular, a abertura estreita dos olhos e sinais de quemose.

As pálpebras excisadas apresentavam grandes oclusões obstruindo os orifícios da glândula meibomiana e edema, em contraste com as pálpebras saudáveis mostrando pequenos tampões da glândula que reveste a pálpebra. Um exame mais aprofundado da transiluminação infravermelha da glândula revela a aparência racêmica dos ácinos da glândula meibomiana. As pálpebras de camundongos com solução salina desafiadas mostraram os ácinos redondos.

Em comparação, as aplicações de óvulos induziram a destruição e perda de algumas glândulas com a doença ocular alérgica ou DEA. A análise histológica das pálpebras mostrou glândulas meibomianas dilatadas em comparação com camundongos administrados apenas com soro fisiológico. A incubação do globo ocular em gelo seco permitiu a incisão na córnea ao lado do limbo e a separação da córnea da esclera.

Este estudo facilitou a coleta da córnea. Além disso, a administração de óvulos infligiu inflamação grave à conjuntiva com aparência hiperêmica. Níveis elevados de quimiocina CXCL-1 facilitam o extravasamento de neutrófilos, fagocitose e degranulação, e interleucina-6 mediando a resposta de fase aguda e infiltração de neutrófilos foram observados nos sobrenadantes de camundongos com DEA.

Por outro lado, a concentração de interleucina-10 não mostrou alterações significativas em camundongos ingênuos e com DEA. Este novo modelo permite o desenvolvimento e a avaliação da eficácia de fármacos que visam as vias imunes inatas, e é de grande ajuda na mineração de dados da forma de administração de agentes anti-inflamatórios. Após a coleta apropriada de órgãos, métodos altamente multiplex, como sequenciamento de célula única e citometria de massa por imagem, são compatíveis com esse protocolo.