Name: Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis usando cromatografia de exclusão de tamanho. Este método simplificado oferece alta produção com mínima contaminação proteica.

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Gostaríamos de reconhecer o apoio do Prêmio Experiencial de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas e do Conselho de Pesquisa Universitária ao NKG e financiamento da ATCC (prêmio nº 2016-0550-0002) ao KMD. Também gostaríamos de reconhecer Anne Simpson por suporte técnico e recursos BEI, NIAID, NIH para os seguintes reagentes: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produzido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produzido in vitro), NR-49223, e Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzido in vitro), NR-13811.

O Comitê de Biossegurança Institucional da Universidade estadual do Colorado aprovou o presente estudo (19-046B). O cultivo de Mycobacterium tuberculosis e a colheita de supernacantes culturais ricos em EV foram realizados por pessoal treinado em um laboratório de alta contenção. Os materiais foram retirados da área de alta contenção após a realização de um método de inativação válido, confirmado e aprovado por políticas institucionais de biossegurança. Ao replicar o protocolo, se a inativação validada ou o método de filtragem estéril não forem viáveis, os seguintes procedimentos precisam ser realizados em laboratório de alta contenção.
1. Preparação do concentrado de EV de Mtb bruto
NOTA: Para procedimentos detalhados sobre o cultivo de Mtb e preparação da proteína filtrada de cultura (PCC), consulte Referências11,12. Recomenda-se que a mídia de cultura bacteriana esteja livre de suplementos de crescimento com componentes contendo EV ou proteináceos, como o Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC), e detergentes como o Tween. Recomenda-se também que a qualidade da cultura bacteriana e o PCP colhido sejam rastreados para garantir a morte celular limitada ea lise 13,14.
<ol><li>Prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO) (ver Tabela de Materiais) adicionando a capacidade total de volume de soro fisiológico tamponado com fosfato (1x PBS). Centrifugar por 5 min a 2.800 x g a 4 °C. NOTA: Se usar um filtro sem volume de dead stop, deve-se tomar cuidado para garantir que o volume da amostra não reduza abaixo do nível do filtro, resultando em secagem completa do filtro durante a centrifugação.</li>
	<li>Descarte o fluxo e qualquer PBS restante antes de encher a câmara de amostra com CFP de Mtb à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C até que o volume seja reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração. Repita conforme necessário, adicionando mais CFP à unidade até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente. NOTA: Retenha uma parte do material de fluxo de 100 kDa (100F) para qualificação a jusante, se desejar. Armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 1x PBS à unidade do filtro que contenha o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume conforme descrito em 1.2. Repita esta etapa cinco vezes para garantir a lavagem completa e a troca de buffer.</li>
	<li>Recupere o retentato CFP concentrado de 100 kDa (100R) de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração (ver Tabela de Materiais). Uma vez recuperado o 100R, lave o filtro com um volume mínimo de 1x PBS pelo menos três vezes e acumule a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação.</li>
	<li>Quantita o material 100R com um ensaio bicinchonínico (BCA) seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Para realizar o ensaio, utilize várias diluições das amostras 1:2, 1:5 e 1:10 em PBS. Teste a amostra em triplicado. NOTA: Retenha uma parte do material 100R para qualificação a jusante, se desejar. Armazenar a 4 °C.</li>
</ol>2. Cromatografia de exclusão de tamanho para o enriquecimento de EVs de Mtb de CFP
NOTA: O procedimento a seguir é específico para o uso de 3 mg de CFP de 100R Mtb com coluna SEC e coletor automático de frações (AFC, ver Tabela de Materiais). Pode ser adaptado para outras concentrações iniciais e tipos de colunas seguindo as especificações do fabricante. Além disso, recomenda-se que os usuários leiam e entendam o manual automático do usuário coletor de frações.
<ol><li>Permita que a coluna SEC se equilibre à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ligue a AFC usando o interruptor de alimentação na parte de trás da unidade da torre e ajuste as configurações para a célula de carga, se necessário, pressionando A CONFIGURAÇÃO na tela sensível ao toque do menu principal. A célula de carga só deve ser calibrada após o primeiro uso, após cada atualização de software, e se a inconsistência nos volumes de coleta de frações for notada.</li>
	<li>Na tela SETUP , alinhe o carrossel selecionando carrossel > CALIBRATE. Insira o carrossel com os 13 pequenos orifícios voltados para a torre AFC e ajuste o carrossel para que o bocal de fluido esteja diretamente acima da posição de descarga pressionando os botões - e/ou + .</li>
	<li>Remova as tampas da coluna SEC equilibrada. Deslize a coluna SEC para o suporte de coluna apropriado e instale-a cuidadosamente na torre AFC. Certifique-se de que a etiqueta de identificação de radiofrequência (RFID) na coluna está em frente à AFC e verifique se a conexão entre a coluna e a válvula está segura. Coloque a tubulação de saída de resíduos em um recipiente de coleta.</li>
	<li>Na tela SETUP , selecione O Cronograma de Coleta e defina a contagem para 13 e o tamanho para 0,5 mL pressionando os botões - e/ou + . Deixe a configuração "Volume de buffer" como padrão de 2,7 mL e, em seguida, feche a janela "Agenda de coleta" pressionando X.</li>
	<li>Selecione START COLLECTION na tela inicial e confirme os parâmetros de coleta selecionando SIM. Carga 13 rotulados tubos de microcentrifuus de 1,7 mL com as tampas abertas e apontando para o centro do carrossel.</li>
	<li>Avance a AFC selecionando OK, em seguida, monte o reservatório da coluna e avance novamente pressionando OK. Selecione a opção de lavar a coluna pressionando SIM e adicione um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm para remover qualquer buffer de armazenamento. Uma vez que a descarga esteja completa, avance a AFC pressionando OK.</li>
	<li>Coloque a tampa do carrossel sobre a AFC e pressione OK. Prepare um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de buffer da coluna.</li>
	<li>Leve 3 mg de amostra de 100R quantificada na etapa 1,5 a 500 μL com 1x PBS. Adicione a amostra de 3 mgs à parte superior da coluna. Avance a AFC e deixe a amostra correr para o frit. Uma vez que a amostra tenha entrado totalmente na coluna, adicione o PBS preparado na etapa 2.6 ao reservatório.</li>
	<li>Monitore a execução da AFC enquanto ela coleta primeiro o volume vazio e, em seguida, as frações especificadas. Após a execução completa e o carrossel retorna à posição de resíduo, remova a tampa e remova os tubos de fração do carrossel. Armazene as frações a 4 °C antes da quantificação (etapa 3) e qualificação (etapa 4).</li>
	<li>Se a coluna for reutilizada, selecione a opção de limpar a coluna pressionando SIM; caso contrário, pressione NÃO. Siga as instruções da AFC. NOTA: Uma vez que a coluna é lavada e o buffer de armazenamento é executado, ele pode ser removido, tampado e armazenado a 4 °C.</li>
</ol>3. Quantificação dos EVs Mtb
<ol><li>Meça a concentração proteica para cada fração utilizando BCA e micro BCA12.<ol>
<li>Para frações de 0,5 mL coletadas de 3 mg de CFP de 100R Mtb, utilize o micro BCA com diluição de 1:3 para frações numeradas de 1 a 7 de cada amostra em triplicado.</li>
		<li>Para frações de 0,5 mL numeradas 5-13, use o BCA sem diluição para cada amostra em triplicado. NOTA: Sobrepor os ensaios para frações 5-7 ajudará a garantir que todas as frações tenham uma saída legível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantita a concentração de partículas para cada fração usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA).<ol>
<li>Diluir as amostras em 1 mL de 1x PBS utilizando as seguintes razões de partida sugeridas; para frações 1-3, use 1:100 e, em seguida, para as frações restantes, use uma diluição de 1:10.</li>
		<li>Vortex as soluções diluídas e, em seguida, desenhe a amostra em uma seringa descartável de 1 mL. Coloque a seringa em uma bomba de seringa automática se estiver disponível.</li>
		<li>Defina a bomba de seringa para 30 μL/min e use as configurações de captura de vídeo com um ganho de tela de 10-12 e um nível de câmera de 10-12. Ajuste o foco para cada amostra.</li>
		<li>Colete um mínimo de três vídeos a 30 s cada usando um fluxo constante.</li>
		<li>Realize a análise com o limiar de detecção de software definido para cinco. NOTA: Pode não ser possível obter dados NTA para as frações mais recentes (>7) sem sacrificar um volume amostral significativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Qualificação de EVs Mtb
<ol><li>Visualize o perfil geral de proteína de cada fração usando um gel de proteína manchado de prata. NOTA: Procedimentos detalhados para SDS-PAGE e mancha de prata podem ser encontrados na Referência15.<ol>
<li>Adicione o buffer de amostra SDS a 10 μL de cada fração e 5 μg de CFP, 100R e 100F. Ferva por 5 min a 100 °C, depois carregue em um Gel Bis-Tris de 4%-12% com uma escada de peso molecular para eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Execute o gel usando 1x 2-[N-morpholino]ácido esulfônico (MES) que executa o buffer (ver Tabela de Materiais) e uma corrente de 200 V por 35 min.</li>
		<li>Retire o gel do e prossiga com a coloração de prata15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avalie a presença ou ausência de marcadores EV em cada fração por mancha ocidental. NOTA: Procedimentos detalhados para manchas ocidentais podem ser encontrados na Referência15.<ol>
<li>Execute um gel SDS-PAGE descrito nas etapas 4.1.1-4.1.2.</li>
		<li>Remova o gel do e transfira as proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 μm (ver Tabela de Materiais) aplicando uma corrente de 50 V por um mínimo de 1h.</li>
		<li>Realize a análise de manchas ocidentais para avaliar proteínas de interesse. Anticorpos primários contra LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (ver Tabela de Materiais) são recomendados.</li>
		<li>Frações de pool com base na presença ou ausência de marcadores, conforme aplicável para a aplicação a jusante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirme a presença de vesículas intactas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).<ol>
<li>Fixar 15 μL da amostra de vesícula adicionando 15 μL de paraformaldeído de grau EM de 4% e armazenar a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Prepare uma grade TEM de cobre revestida de 200 malhas formvar-carbono limpando a superfície e fazendo um substrato hidrofílico. NOTA: Recomenda-se a limpeza plasmática com 95% de argônio, 5% de oxigênio e 30% de plasma por 1 min.</li>
		<li>Solte 10 μL da amostra fixa na rede e deixe a amostra aderir por 10 minutos, depois limpe o excesso de líquido com papel filtro.</li>
		<li>Flutue a rede em uma gota de água ultrauso por 30 s, em seguida, limpe o excesso de líquido.</li>
		<li>Flutue a rede em uma queda de acetato de urânl de grau D% EM por 2 minutos, depois limpe o excesso de líquido.</li>
		<li>Deixe a rede secar completamente.</li>
		<li>Imagem usando um TEM (ver Tabela de Materiais) a 100 kV ou similar. NOTA: Outros métodos de quantitação e caracterização do EV devem ser usados com base em aplicações a jusante. As Informações Mínimas para Estudos de VesículasExtracelulares 18 devem ser consultadas para orientações para garantir o rigor e a reprodutibilidade de todos os estudos de EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li>
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<li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li>
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<li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans%3A+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li>
<li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As vesículas extracelulares de micobacterium tuberculosis são reservatórios altamente antigênicos, que os apresentam como um caminho atraente para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e vacinas futuras 4,19,20. Historicamente, a ultracentrifugação de gradiente de densidade tem sido usada para separar EVs Mtb de outros materiais solúveis e secretos8. Embora esse processo seja eficaz, ta...

A liberação de vesícula extracelular (EV) por patógenos pode ser a chave para desbloquear novas tecnologias para controlar doenças infecciosas1. A micobacterium tuberculosis (Mtb) é um patógeno de alta consequência, infectando aproximadamente um terço da população mundial e reivindicando a vida de milhões de pessoas a cada ano2. A produção de EV por Mtb é bem documentada, mas evasiva nos papéis biogêneses e variados (ou seja, imunoestimulatório, imunossupressor, aquisição de ferro e nutrientes) desses EVs no contexto da infecção 3,4,5. Os esforços para entender a composição dos EVs Mtb revelaram esferas lipídicas de 50-150 nm de membrana lipídica derivadas da membrana plasmática contendo lipídios e proteínas de significância imunológica 3,6. A investigação do papel dos EVs de Mtb na fisiologia bacteriana revelou a importância da modulação bacteriana de EV em resposta ao estresse ambiental para a sobrevivência5. Estudos de interação hospedeiro-patógeno têm sido mais complicados de interpretar, mas evidências indicam que os EVs Mtb podem influenciar a resposta imune do hospedeiro e podem potencialmente servir como um componente de vacinação eficaz 3,4,7.
A maioria dos estudos de EVs Mtb até agora tem se apoiado na ultracentrifugação gradiente de densidade para o enriquecimento vesícula8. Isso tem sido eficaz para estudos de pequena escala; no entanto, essa técnica tem diversos desafios técnicos e logísticos. Fluxos de trabalho alternativos casam centrifugação multistep, para a remoção de células inteiras e detritos grandes, com um passo final de ultracentrifugação para eVs de pelotização. Essa metodologia pode variar em eficiência, e muitas vezes resulta em baixo rendimento e co-purificação de biomoléculas não vesículas solúveis associadas, ao mesmo tempo em que impacta a integridade vesícula9. Além disso, esse processo é demorado, manualmente intensivo e muito limitado em rendimento devido a restrições de equipamentos.
O presente protocolo descreve uma técnica alternativa à ultracentrifugação gradiente de densidade: cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Este método tem sido demonstrado para micobactérias ambientais, e no trabalho atual, foi extrapolado para Mtb10. Uma coluna comercialmente disponível e coletor de frações automática pode melhorar a consistência na preparação vesical e reduzir a necessidade de equipamentos específicos e caros. Também é possível completar este protocolo em uma fração do tempo em comparação com a ultracentrifugação gradiente de densidade, aumentando o throughput. Esta técnica é menos tecnicamente desafiadora, facilitando o domínio, e pode aumentar a reprodutibilidade inter/intra-laboratorial. Finalmente, a SEC tem alta eficiência de separação e é gentil, preservando a integridade das vesículas.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Coletor Automático de Frações</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Escada de Proteína Pré-corada</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Bancada</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - Filtro centrífugo de 70, corte de 100 kDa</td> Dispositivo de ultrafiltração <td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>usado na etapa 1.1</td></tr><tr><td>Sistema de Eletrotransferência</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Paraformaldeído de Grau EM</td><td>Ciências 15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbono 200 mesh Grids</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>FCF200H--TA</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rato IgG H & L (Fosfatase Alcalina), molécula inteira, 1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>JEM-1400 Microscópio Eletrônico de Transmissão</td><td>JOEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-49223</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-13792</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-13811</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Instrumentos</td><td></td> <td>de fisquionaPara limpeza de plasma da grade TEM</td></tr><tr><td>Nanosight equipado com bomba de seringa e computador com software NanoSight NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose, Rolo, 0,2 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Géis de Proteína Bis-Tris</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, 1X sem cálcio e magnésio</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td> Fonte de Alimentação Básica <td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Original 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC coluna</td></tr><tr><td>tampão de amostra SDS</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>Receita interna usada neste procedimento, no entanto, este produto é equivalente</td></tr><tr><td>à câmara de gel SDS-PAGE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>Protocolo interno usado neste procedimento, no entanto, este kit é equivalente</td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

O papel das vesículas extracelulares (EVs) no contexto da infecção bacteriana surgiu como um novo caminho para a compreensão da fisiologia microbiana. Especificamente, os EVs Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempenham um papel na interação hospedeiro-patógeno e na resposta ao estresse ambiental. Os EVs Mtb também são altamente antigênicos e mostram potencial como componentes de vacinas. O método mais comum para purificar EVs Mtb é a ultracentrifugação gradiente de densidade. Esse processo tem várias limitações, incluindo baixo rendimento, baixo rendimento, dependência de equipamentos caros, desafios técnicos, podendo impactar negativamente a preparação resultante. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é um método alternativo mais suave que combate muitas das limitações da ultracentrifugação. Este protocolo demonstra que a SEC é eficaz para o enriquecimento de EV Mtb e produz preparações de EV Mtb de alta qualidade de maior rendimento de forma rápida e escalável. Além disso, uma comparação com a ultracentrifugação de gradiente de densidade por procedimentos de quantificação e qualificação demonstra os benefícios da SEC. Enquanto a avaliação da quantidade de EV (análise de rastreamento de nanopartículas), fenótipo (microscopia eletrônica de transmissão) e conteúdo (mancha ocidental) é adaptado para EVs Mtb, o fluxo de trabalho fornecido pode ser aplicado a outras micobactérias.

A proteína filtrada de cultura (PCC) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi concentrada, quantificada e, em seguida, 3 mg de material foi aplicado a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As concentrações de proteínas e partículas foram enumeradas por BCA e NTA, respectivamente. As faixas esperadas para recuperação de proteínas e partículas mais os valores exatos obtidos para esses resultados são relatados na Tabela 1. Valores muito superiores a essas faixas podem indicar pro...

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Este protocolo reduz a complexidade técnica e o tempo necessários para o enriquecimento de vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis, EVs Mtb. Ele fornece uma alternativa suave às técnicas tradicionais de ultracentrifugação e densidade. A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de realizar, tornando-a mais reproduzível.Ele fornece um alto rendimento de EVs Mtb com co-enriquecimento mínimo de proteína não-EV. Demonstrando o procedimento será Joanie Ryan, uma ex-estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para começar, prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 quilodalton adicionando a capacidade total de volume de PBS.Centrífuga por cinco minutos a 2.800 vezes G a 4 graus Celsius. Descarte o fluxo através de qualquer PBS restante, e encha a câmara de amostra com Mtb CFP à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 vezes G a 4 graus Celsius até que o volume tenha reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração.Repita conforme necessário até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente. Adicione 1X PBS à unidade do filtro que contenha o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume como descrito anteriormente e repita esta etapa cinco vezes para garantir a completa troca de lavagem e tampão.Em seguida, recupere o retentato CFP concentrado de 100 quilodalton ou 100R, de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração. Lave o filtro com um volume mínimo de 1X PBS pelo menos três vezes e puxe a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação. Utilize várias diluições de amostras em PBS e quantita o material de 100R com um ensaio bicinchonínico.Teste a amostra em triplicado. Permita que a cromatografia de exclusão de tamanho, ou coluna SEC, se equilibre à temperatura ambiente. Ligue a AFC usando o interruptor de alimentação na parte de trás da unidade da torre e pressione a configuração na tela de toque do menu principal, se necessário, para ajustar as configurações da célula de carga.Na tela de configuração, alinhe o carrossel selecionando Carrossel seguido de Calibrate. Insira o carrossel com os 13 pequenos orifícios voltados para a torre AFC e ajuste o carrossel pressionando os botões menos ou mais para que o bocal de fluido esteja diretamente acima da posição de descarga. Remova as tampas da coluna SEC equilibrada e deslize a coluna SEC para o suporte de coluna apropriado.Instale-o cuidadosamente na torre AFC. Certifique-se de que a etiqueta de identificação de radiofrequência na coluna está em faces da AFC e verifique se a conexão entre a coluna e a válvula está segura. Coloque a tubulação de saída de resíduos em um recipiente de coleta.Na tela de configuração, selecione O Cronograma de Coleta e defina a contagem para 13 e o tamanho para 0,5 mililitros pressionando os botões menos ou mais. Deixe a configuração do volume do buffer como padrão de 2,7 mililitros e, em seguida, feche a janela do cronograma de coleta. Selecione Start Collection na tela inicial e confirme os parâmetros de coleta selecionando Sim.Carga 13 rotulados tubos de microcentrífugo de 1,7 mililitro com as tampas abertas e apontando para o centro do carrossel. Avance a AFC selecionando OK, em seguida, monte o reservatório da coluna e avance novamente pressionando OK. Selecione a opção de lavar a coluna pressionando Sim e adicione um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 micrômetro para remover qualquer buffer de armazenamento. Uma vez que a descarga esteja completa, avance a AFC pressionando OK. Coloque a tampa do carrossel sobre a AFC e pressione OK. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de buffer da coluna.Leve três miligramas de amostra de 100R a 500 microliters com PBS 1X e adicione a amostra ao topo da coluna. Prepare um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 micrômetro. Avance a AFC e deixe a amostra correr para o traste.Uma vez que a amostra tenha entrado totalmente na coluna, adicione o PBS preparado anteriormente ao reservatório. Monitore a execução da AFC enquanto ela coleta primeiro o volume vazio e, em seguida, as frações especificadas. Após a execução completa e o carrossel retorna à posição de resíduo, remova a tampa e os tubos de fração do carrossel.Para frações de 0,5 milímetros coletadas a partir de três miligramas de CFP de 100R Mtb, meça a concentração de proteína utilizando o micro-BCA com uma diluição de 1:3 para frações numeradas de 1 a 7 de cada amostra em triplicado. Para 0,5 mililitros frações numeradas de 5 a 13, use o BCA sem diluição para cada amostra em triplicado. Adicione buffer de amostra SDS a 10 microliters de cada fração e cinco microgramas de CFP e 100R.Ferva por cinco minutos a 100 graus Celsius. Em seguida, carregue em um gel bis-tris de 4 a 12% com uma escada de peso molecular para eletroforese de gel de poliacrilamida, ou PAGE. Execute um gel SDS-PAGE usando buffer de execução 1X MES e uma corrente de 200 volts por 35 minutos.Remova o gel do e aplique uma corrente de 50 volts por um mínimo de uma hora para transferir as proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 micrômetro. Finalmente, realize a análise de manchas ocidentais para avaliar as proteínas. Um gel SDS-PAGE manchado de prata demonstra o perfil geral de proteína para cada fração.Os dados mostram que as frações posteriores contêm mais proteína e se assemelham ao material 100R. Manchas ocidentais detectando LAM, LpqH e GroES demonstram que o marcador de proteína muda através das frações. Microscopia eletrônica de transmissão, ou imagens TEM, de frações SEC 1 a 3 puxadas antes da fixação são mostradas aqui.A ultracentrifugação de gradiente de densidade de EVs Mtb foi manchada negativamente para imagens TEM. A análise de rastreamento de nanopartículas, ou distribuição NTA, das frações SEC 1 a 3 é mostrada aqui. Os EVs Mtb de ultracentrifugação de gradiente de densidade foram analisados com análise de rastreamento de nanopartículas, e a distribuição de tamanho é exibida aqui.Este protocolo foi otimizado para purificação de EV a partir de três miligramas de 100R. Se a carga proteica for variada, a estratégia recomendada de diluição e BCA sobre frações resultantes pode exigir ajuste. Os EVs Mtb preparados com esta técnica podem ser usados para estudos composicionais a jusante e baseados em omics.Eles também são adequados para experimentos in vitro e in vivo. Esta técnica fornece uma maneira fácil e eficiente de produzir preparações de EV Mtb de alta qualidade, abrindo caminho para maior reprodutibilidade em futuros experimentos de EV Mtb.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o isolamento gradual de vesículas extracelulares (EVs) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas sob condições limitantes de ferro que imitam o ambiente hospedeiro. Ele descreve o uso de ultrafiltração, centrifugação diferencial e separação de gradiente de densidade para enriquecer e identificar frações contendo...

Isolamento de vesículas extracelulares contendo sideróforo de Mycobacterium tuberculosis

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Fonte: Watson, D. C., et al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o uso da cromatografia de exclusão de tamanho com esferas de resina porosa para isolar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) de um filtrado de cultura bacteriana. EVs maiores eluem cedo, contornando os poros da resina, enquanto proteínas menores entram nos poros e eluem mais tarde.

Isolamento de Vesículas Extracelulares Bacterianas Usando Cromatografia de Exclusão de Tamanho 

Neste vídeo, demonstramos uma técnica - cromatografia de exclusão de tamanho - para separar uma população heterogênea de vesículas de membrana externa ou OMVs derivadas de bactérias. Essas vesículas são estruturas esféricas nanométricas e são separadas em subpopulações grandes e pequenas com base em seu tamanho por meio de cromatografia de exclusão de tamanho.

Separação baseada em cromatografia de exclusão de tamanho de vesículas extracelulares bacterianas: uma técnica para separar a população heterogênea de vesículas bacterianas da membrana externa gram-negativas com base em seu tamanho

Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de proteínas filtradas de cultura bacteriana, que incluem vesículas extracelulares bacterianas, usando ultrafiltração. As vesículas extracelulares concentradas servem como marcadores diagnósticos para a detecção de doenças.

Concentração de proteína de filtrado de cultura bacteriana usando um dispositivo de ultrafiltração

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para purificar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A técnica utiliza uma coluna porosa embalada com resina para obter frações purificadas de EVs. As partículas porosas permitem seletivamente que proteínas menores entrem nos poros, resultando em eluição mais lenta. Ao mesmo tempo, os EVs são excluídos de entrar nos poros devido ao seu tamanho maior e são...

Uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Este protocolo descreve o isolamento de pequenas vesículas extracelulares de músculos esqueléticos murinos e medula óssea usando digestão enzimática e cromatografia de exclusão de tamanho, permitindo a recuperação reprodutível de frações enriquecidas com vesículas de tecidos estruturalmente complexos e de baixo rendimento para análise molecular posterior.

Isolamento de Pequenas Vesículas Extracelulares do Músculo Esquelético Murino e Medula Óssea por Cromatografia de Exclusão de Tamanho

Aprenda a enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis usando cromatografia de exclusão de tamanho. Este método simplificado oferece alta produção com mínima contaminação proteica.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

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