Name: Métodos de Criação do Parasitoide Ganaspis brasiliensis, um Agente promissor de controle biológico para a Drosophila suzukii invasiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda métodos de criação do parasitoide Ganaspis brasiliensis para controle biológico de Drosophila suzukii. Este protocolo eficiente facilita pesquisa e aplicação em larga escala deste agente promissor.

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Os autores agradecem a Lukas Seehausen e Marc Kenis (CABI, Suíça) por gentilmente fornecerem G1 G. brasiliensis. O financiamento na Itália foi fornecido por Provincia Autonoma di Trento, Trento, Itália, e nos EUA pelo National Institute of Food and Agriculture, prêmio USDA Specialty Crops Research Initiative (#2020-5118-32140), USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, fundo 14-8130-0463) e fundos base USDA ARS CRIS (projeto 8010-22000-033-000D). O USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e empregador e não endossa os produtos mencionados nesta publicação.

1. Métodos para criação laboratorial em pequena escala do G3 Ganaspis brasiliensis
<ol><li>Prepare a dieta do anfitrião.<ol>
<li>Adicione 600 mL de água destilada a um recipiente de vidro de 1.500 mL e aqueça a água em uma placa quente.</li>
		<li>Adicione 88,6 g de dieta seca comercialmente disponível (feita de ágar, levedura de Cervejeiro, farinha de milho, parabeno de metila e sacarose) ou prepare a dieta usando a fórmula publicada por Dalton et al.28 (ver passo 2.1.2).</li>
		<li>Adicione 300 mL de água destilada na dieta seca e mexa bem a mistura dietética.</li>
		<li>Adicione a mistura à água fervente.</li>
		<li>Deixe a dieta líquida na placa quente ferver por 10 minutos enquanto mexe periodicamente a mistura para evitar que queime.</li>
		<li>Deixe a dieta esfriar à temperatura ambiente por 30 minutos enquanto a agita ocasionalmente para distribuir a liberação de calor uniformemente e evitar que a dieta se solidifique na superfície.</li>
		<li>Meça 6,7 mL de 95% EtOH em um recipiente e 3,5 mL de solução de ácido propínico de 1 M em outro recipiente.</li>
		<li>Uma vez que a dieta tenha esfriado, adicione o EtOH e, em seguida, a solução de ácido propiônico, mexendo completamente após cada adição.</li>
		<li>Prepare mirtilos (comprados no mercado local) enxaguando-as em água fria, em seguida, em uma solução de alvejante de hipoclorito de sódio (diluída para 5%), e água fria novamente.</li>
		<li>Seque a fruta com uma toalha de papel e amasse-as manualmente até que a pele de cada fruta esteja quebrada e os sucos e a carne da fruta sejam expostos.</li>
		<li>Adicione 25-30 g de mirtilos amassados a cada frasco de 250 mL. Toque nas laterais do frasco para garantir que a parte inferior interna do frasco esteja coberta com uma camada uniforme de mirtilos amassados.</li>
		<li>Despeje a dieta preparada em cada frasco para que ele apenas cubra o topo do purê de mirtilos.</li>
		<li>Adicione rolhas de espuma aos pescoços dos frascos e permita que a dieta se solidifique à temperatura ambiente (Figura 1).</li>
		<li>Uma vez que a dieta tenha se solidificado, use-a imediatamente ou armazene a 5 °C por até 3 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Hospedeiro traseiro Drosophila suzukii.
	<ol>
<li>Remova a dieta armazenada da geladeira e permita que ela se equilibre à temperatura ambiente, ou use uma dieta recém-feita.</li>
		<li>Corte um pedaço de papel toalha absorvente (por exemplo, 5 cm x 20 cm) e torça-o no centro. Coloque a parte do meio torcido da toalha de papel no frasco (Figura 1).</li>
		<li>Molhe a toalha de papel e a superfície da dieta com água destilada para reter a umidade.</li>
		<li>Transfira moscas adultas sexualmente maduras da colônia atual voam frascos para um novo frasco de dieta, removendo cuidadosamente a rolha no frasco antigo e rapidamente invertendo o frasco e alinhando a abertura do frasco antigo com o novo frasco.</li>
		<li>Bata suavemente no lado do frasco velho para induzir as moscas a cair no novo frasco. Certifique-se de que há ~25-30 pares de acasalamento de D. suzukii no novo frasco. Uma vez que haja moscas suficientes no novo frasco, gire rapidamente o velho frasco e substitua as rolhas em ambos os frascos.</li>
		<li>Repita as transferências de moscas até que nenhuma mosca seja deixada nos frascos velhos. Se necessário, combine ou colete moscas de mais de um frasco velho em um novo frasco para garantir que haja moscas suficientes (20-30 pares) por frasco.</li>
		<li>Segure os novos frascos após uma semana de exposição a moscas adultas em condições adequadas (21 °C, 16 L: 8 D fotoperiod, 60%-80% de umidade relativa [RH%]) em uma câmara ambiental por 3 semanas para emergência de moscas.</li>
	</ol></li>
	<li>Exponha larvas hospedeiras a parasitoides.<ol>
<li>Pegue um frasco (ver passo 1.2.7) contendo ovos de mosca e larvas depois de remover quaisquer moscas adultas e a toalha de papel torcida do frasco.</li>
		<li>Dobre um pedaço de papel toalha absorvente ao meio e coloque-o no frasco como um substrato de pupação para larvas parasitas.</li>
		<li>Aspirar seis pares femininos e masculinos de G3 G. brasiliensis em cada frasco (Figura 1). Coloque uma fina camada de mel na parte inferior da rolha de espuma.</li>
		<li>Deixe os parasitoides no frasco por 5 dias.</li>
		<li>Após uma exposição de 5 dias, remova os parasitoides e segure os frascos em condições descritas acima em uma câmara ambiental por 35 dias até o esperado surgimento de vespas.</li>
	</ol></li>
	<li>Colete e armazene parasitoides adultos.<ol>
<li>Durante a segunda e terceira semanas de incubação, verifique os frascos semanalmente para o surgimento precoce do hospedeiro e remova as moscas adultas.</li>
		<li>Uma vez que os parasitoides adultos comecem a emergir, aspire-os três vezes por semana e segure-os em frascos de drosophila (por exemplo, 2,5 cm x 9,5 cm) (Figura 1).</li>
		<li>Coloque um pequeno pedaço de papel toalha umedecido, mas não saturado, com água destilada no fundo do frasco.</li>
		<li>Adicione ~60 parasitoides a cada frasco e rotule o frasco com as datas de emergência. Listrar uma fina camada de mel na parte inferior da rolha de espuma, duas vezes por semana. Armazene os frascos com parasitoides adultos nas condições descritas acima na câmara ambiental por até um mês se não for usado antes.</li>
		<li>Remoisten o papel no frasco uma vez a cada 4-7 dias ou substitua a toalha de papel se houver sinais de mofo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Métodos para criação em larga escala do G1 Ganaspis brasiliensis
<ol><li>Implemente uma criação em larga escala do hospedeiro Drosophila suzukii.
	<ol>
<li>Traseira D. suzukii dentro de grandes gaiolas cobertas de malha (por exemplo, 50 cm x 50 cm x 100 cm) cada uma contendo 1.500-2.000 moscas adultas sexualmente maduras (razão sexual 50:50) (Figura 2).</li>
		<li>Prepare o Padrão Drosophila Medium (SDM) fervendo todos os ingredientes (6 g de ágar bacteriológico, 75 g de farinha de milho, 17 g de levedura nutricional, 15 g de sacarose, 10 g de farinha de soja, 10 mL de ácido propício) em 1 L de água destilada por 10 min enquanto mexe periodicamente a mistura para evitar que queime28.</li>
		<li>Deixe a mistura esfriar por 5 minutos e adicione 5 g de ácido ascórbico.</li>
		<li>Despeje o SDM recém-cozido em pratos Petri de 9 cm e deixe o meio solidificar à temperatura ambiente antes de fechar as placas.</li>
		<li>Empilhe as placas de Petri SDM, enrole a pilha com papel alumínio e guarde os pratos a 4 °C por até 2 semanas.</li>
		<li>Dentro de cada gaiola de criação, coloque um prato com algodão encharcado de água e quatro a seis pratos de Petri com SDM (Figura 2).</li>
		<li>Duas vezes por semana, substitua os pratos infestados de SDM Petri por pratos frescos.</li>
		<li>Coloque as placas de Petri infestadas de SDM sem tampas individualmente em copos plásticos (13,3 cm de diâmetro ou 800 mL), feche cada xícara com uma cobertura de malha fina (<0,5 mm) e incubar por 12-15 dias a 23 °C e 75% RH (Figura 2).</li>
		<li>Transfira os recém-eclodidos adultos D. suzukii dos copos de plástico para as gaiolas de criação.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare larvas hospedeiras.<ol>
<li>Enxágüe as mirtilos em água fria por 1 min, e mergulhe as frutas em uma bacia cheia de uma solução alvejante (diluída a 5%) por 3 min.</li>
		<li>Escorra a solução de alvejante e encha a bacia com água fria para enxaguar as amoras. Misture suavemente à mão por pelo menos 30 s.</li>
		<li>Repita o passo 2.2.2 com água doce pelo menos três vezes para remover resíduos de alvejante e outros artrópodes (por exemplo, ácaros, thrips) que possam estar presentes na fruta.</li>
		<li>Coloque a fruta em uma bandeja com várias camadas de toalhas de papel absorvente e incline cuidadosamente a bandeja para frente e para trás, rolando as frutas ao redor para secá-las.</li>
		<li>Prepare várias placas de Petri de 9 cm (tanto as metades superiores quanto inferiores, de frente para cima) e encha cada uma com as amoras lavadas (15-25 frutas por prato, dependendo do tamanho da fruta).</li>
		<li>Durante o final da tarde, exponha os pratos de Petri a moscas adultas sexualmente maduras dentro das gaiolas de criação do hospedeiro (ver passo 2.1) e deixe-as durante a noite.</li>
		<li>Na manhã seguinte, retire as placas de Petri das gaiolas de criação do hospedeiro soprando suavemente ou batendo nelas para desalojar as moscas das frutas e usar a fruta infestada para a criação de parasitoides (ver passo 2.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Implemente uma criação parasitoide em larga escala.<ol>
<li>Use dois tipos de gaiolas para trás do parasitoide: uma para parasitismo e outra para emergência de vespas.</li>
		<li>Certifique-se de que a gaiola de parasitismo é cúbica (por exemplo, 45 cm de cada lado) com um painel plástico transparente na frente para observação da atividade do inseto, duas aberturas de manga de 18 cm no painel frontal para a adição ou remoção de insetos e a substituição de material alimentar, e redes de poliéster fino (por exemplo, 96 x 26 malha) na parte superior e nas laterais para ventilação.</li>
		<li>Faça a gaiola de emergência menor (por exemplo, 30 cm de cada lado), com uma única manga abrindo em dois lados opostos e um painel plástico transparente na frente para visibilidade (Figura 2).</li>
		<li>Certifique-se de que ambos os tipos de gaiola têm uma corda fina que fica abaixo do teto a partir do qual suspender um para vários alimentadores (Figura 2). NOTA: Um alimentador consiste em uma grande rolha de espuma cílídrica (9 cm de diâmetro) coberta com gotículas de mel espalhadas, podendo ser colocada no chão da gaiola ou pendurada no teto da gaiola (Figura 2).</li>
		<li>Dentro de cada gaiola, forneça água em um frasco de drosophila de parede reta (2,5 cm x 9,5 cm) selado com um plugue de acetato de celulose (2,5 cm de diâmetro) a cada 5-7 dias, dependendo do RH. Pendure o frasco de cabeça para baixo do teto da gaiola (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Exponha as larvas hospedeiras aos parasitoides.<ol>
<li>Exponha a fruta infestada de host dentro das placas de Petri ao G1 G. brasiliensis imediatamente após a infestação da noite de D. suzukii (ver passo 2.2.7).</li>
		<li>Deixe os 10-15 pratos petri de frutas infestadas na gaiola de parasitização contendo 1.500-2.000 vespas por 2-3 dias.</li>
		<li>Utilize copos plásticos (13,3 cm de diâmetro ou 800 mL) com camadas de papel absorvente na parte inferior para coletar a fruta contendo os hospedeiros parasitas (Figura 2).</li>
		<li>Coloque os copos abertos na gaiola de eclosão e incubar por pelo menos 28 dias a 21 °C e 65% RH (Figura 2).</li>
		<li>Durante a segunda e terceira semanas de incubação, verifique semanalmente a gaiola para o encerramento do hospedeiro precoce e remova as moscas adultas para facilitar a sucessiva coleta de parasitoides.</li>
		<li>No final da quarta semana de incubação, adicione um alimentador e uma fonte de água à gaiola.</li>
	</ol></li>
	<li>Colete e armazene os parasitoides adultos.<ol>
<li>Uma vez iniciado o surgimento parasitoide, recolham uma parte (10%-15%) dos adultos e transfiram-os de volta para a gaiola do parasitismo para substituir antigos indivíduos improdutivos.</li>
		<li>Colete e armazene os parasitoides restantes em copos plásticos (13,3 cm de diâmetro ou 800 mL) (Figura 3A).</li>
		<li>Coloque um tubo (2 mL) cheio de água e selado com um rolo de algodão dental (1 cm x 3,8 cm) na parte inferior do copo (Figura 3A).</li>
		<li>Feche o copo com uma tampa modificada equipada com uma rolha de espuma removível (3,5 cm de diâmetro) como substrato alimentador e um orifício coberto de malha para ventilação (Figura 3B).</li>
		<li>Adicione 700 adultos a cada xícara (relação sexual 50:50), rotule o copo com a data de emergência e armazene-o em uma câmara ambiental (17 °C; 65% RH) até ser usado, ou por até 1 mês (Figura 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>Envie os parasitoides adultos.<ol>
<li>Use tubos cônicos (50 mL) para enviar os parasitoides adultos.</li>
		<li>Furar um orifício de ventilação (8 mm de diâmetro) na tampa e cobri-lo com uma rede de malha fina (Figura 3C).</li>
		<li>Adicione um anel de alimentação de acetato de celulose no interior da tampa (Figura 3C).</li>
		<li>Prepare uma solução de sacarose saturada usando água destilada, aplique algumas gotas no anel de alimentação e deixe absorver o líquido.</li>
		<li>Coloque um pedaço em forma de ventilador de papel toalha absorvente dentro do tubo (Figura 3D).</li>
		<li>Adicione ~200 parasitoides adultos a cada tubo, e coloque os tubos em um recipiente de transporte isolado junto com sacos de gelo.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kasuya, N., Mitsui, H., Ideo, S., Watada, M., Kimura, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological%2C+morphological+and+molecular+studies+on+Ganaspis+individuals+%28Hymenoptera%3A+Figitidae%29+attacking+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Ecological, morphological and molecular studies on Ganaspis individuals (Hymenoptera: Figitidae) attacking Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae).</a> Applied Entomology and Zoology. 48 (1), 87-92 (2013).</li>
<li>Matsuura, A., Mitsui, H., Kimura, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+on+distributions+and+oviposition+sites+of+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+and+its+parasitoids+on+wild+cherry+tree+in+Tokyo%2C+central+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">A preliminary study on distributions and oviposition sites of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) and its parasitoids on wild cherry tree in Tokyo, central Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 53 (1), 47-53 (2018).</li>
<li>Abram, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+records+of+Leptopilina%2C+Ganaspis%2C+and+Asobara+species+associated+with+Drosophila+suzukii+in+North+America%2C+including+detections+of+L.+japonica+and+G.+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hymenoptera+Research%22%5BJournal%5D)">New records of Leptopilina, Ganaspis, and Asobara species associated with Drosophila suzukii in North America, including detections of L. japonica and G. brasiliensis.</a> Journal of Hymenoptera Research. 78, 1-17 (2020).</li>
<li>Puppato, S., Grassi, A., Pedrazzoli, F., De Cristofaro, A., Ioriatti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Leptopilina+japonica+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">First report of Leptopilina japonica in Europe.</a> Insects. 11 (9), 611(2020).</li>
<li>Dalton, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+survival+of+Drosophila+suzukii+under+simulated+winter+conditions+of+the+Pacific+Northwest+and+seasonal+field+trapping+in+five+primary+regions+of+small+and+stone+fruit+production+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managagement+Science%22%5BJournal%5D)">Laboratory survival of Drosophila suzukii under simulated winter conditions of the Pacific Northwest and seasonal field trapping in five primary regions of small and stone fruit production in the United States.</a> Pest Managagement Science. 67 (11), 1368-1374 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Pesquisas de longo prazo e liberações de campo subsequentes de um agente de controle biológico dependem da disponibilidade de técnicas eficazes e econômicas de criação. Os métodos descritos neste estudo provaram ser protocolos eficientes tanto para a criação em pequena escala quanto para a criação em larga escala do Ganaspis brasiliensis. O protocolo de criação em pequena escala foi desenvolvido ao longo de vários anos para otimizar a quantidade de mão-de-obra e reduzir os equipamentos especializados necessários...

Nativa do leste da Ásia, a drosophila de asa manchada, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), estabeleceu-se amplamente nas Américas, Europa e partes da África 1,2. A mosca é extremamente polifago, sendo capaz de utilizar diversos frutos cultivados e selvagens com peles macias e finas em suas regiões nativas e invadidas 1,2,3. As estratégias de manejo atuais para esta praga dependem fortemente do uso frequente de inseticidas que visam moscas adultas em campos de cultivo quando frutas suscetíveis estão amadurecendo. Sprays repetidos são frequentemente usados, possivelmente devido ao derramamento consistente de populações de moscas de reservatórios de habitats não-agrícolas e falta de inimigos naturais eficazes residentes nas regiões invadidas 1,4. O controle biológico, especialmente por meio da autoperpetação de parasitoides especializados, pode ajudar a suprimir populações de moscas no nível paisagístico e desempenhar um papel crítico para o manejo sustentável em toda a área desta praga altamente móvel epolifagosa 4,5,6.
Na última década, pesquisadores concentraram esforços para descobrir parasitoides co-evoluídos de Drosophila suzukii nas faixas nativas da mosca no leste da Ásia 7,8,9, bem como parasitoides eficazes, mas recém-associados nas regiões invadidas da mosca nas Américas e europa 4,5,6. Nas regiões recém-invadidas da mosca, comumente ocorrendo parasitoides larvas drosophila, como Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.), e L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae), são incapazes de desenvolver ou têm baixos níveis de parasitismo em D. suzukii devido à forte resistência imune da mosca10. Apenas alguns parasitoides pupais cosmopolitas e generalistas como Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) e Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) na América do Norte e Europa, e Trichopria anastrephae Lima na América do Sul pode facilmente desenvolver a partir desta mosca4. Em contraste, explorações no leste da Ásia descobriram uma série de parasitoides larvais de D. suzukii 4,5,6. Entre eles, Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering, e Leptopilina japonica Novković & Kimura são os parasitoides larval dominantes 7,8,9,11. Em particular, as duas figífidas (L. japonica e G. brasiliensis) foram os principais parasitoides predominantemente encontrados em frutas frescas infestadas por D. suzukii e/ou outros drosophilids intimamente relacionados na vegetação natural 7,8,9. Esses três parasitoides larvais asiáticos foram importados para instalações de quarentena nos EUA e europa, e avaliados por sua eficiência relativa 12,13,14,15,16,17, adaptabilidade climática18, potenciais interesações competitivas interespecíficas 19, e, o mais importante, especificidade do hospedeiro 8,20,21 22.
As avaliações de quarentena mostraram que ganaspis brasiliensis era mais hospedeiro específico de Drosophila suzukii do que outros parasitoides larvais asiáticos testados, embora provavelmente consistisse em diferentes biotipos ou espécies enigmáticas com especificidade de hospedeirovariado 8,21,22,23,24. Nomano et al.22 agruparam indivíduos ganaspis de diferentes regiões geográficas em cinco grupos genéticos (nomeados como G1-G5) com base em análises moleculares do fragmento genético mitocondrial citocromo oxidase I. Os grupos G2 e G4 são relatados apenas a partir de algumas localidades tropicais do sul da Ásia, e o grupo G5 foi relatado da Ásia e de outras regiões (por exemplo, Argentina, Brasil, Havaí e México) de hospedeiros desconhecidos (Buffington, observação pessoal). Coleções de campo de frutas silvestres infestadas por D. suzukii na Coreia do Sul7, China8 e Japão 9,23,25 encontraram g1 sozinho ou uma mistura de espécimes representando os grupos G1 e G3. Os dois grupos parecem ser simpátricos e coexistem nas mesmas plantas hospedeiras habitadas por D. suzukii e outras moscas hospedeiras intimamente relacionadas. No entanto, algumas diferenças têm sido observadas entre os dois grupos, com o G1 aparentemente tendo um maior grau de especificidade hospedeiro ou hospedeiro-habitat para D. suzukii do que G3, embora ambos ataquem uma série de espécies intimamente relacionadas nos testes de quarentena21,22. Análises moleculares mais detalhadas podem ajudar a determinar o estado da espécie, especialmente para os grupos G1 e G3. Este estudo refere-se a eles como G1 G. brasiliensis e G3 G. brasiliensis. Alguns estudos iniciais também nomearam o G1 G. brasiliensis como G. cf. brasiliensis 14,21,22. O G1 G. brasiliensis foi recentemente aprovado para liberação de campo contra D. suzukii nos EUA e Itália (vários outros países europeus também estão considerando sua introdução), enquanto o G3 G. brasiliensis pode ser considerado para lançamento em campo em um futuro próximo. Pesquisas recentes também encontraram populações aventureiras tanto de L. japonica quanto do G1 G. brasiliensis na Colúmbia Britânica, Canadá26, e Estado de Washington, EUA (Beers et al., dados inéditos) e populações aventureiras L. japonica na província de Trento, Itália27.
Dado o interesse significativo no desenvolvimento de programas de controle biológico para a gestão de Drosophila suzukii e o substancial potencial de controle biológico de introduções aventureiras e deliberadas do Ganaspis brasiliensis, há a necessidade de desenvolver métodos eficientes de criação para este parasitoide larval para futuras pesquisas de longo prazo e/ou liberação de campo. Este protocolo e artigo de vídeo associados descrevem dois conjuntos de métodos de criação para este parasitoide: (1) criação de laboratório em pequena escala em frascos usando uma mistura de frutas hospedeiras (mirtilo) e dieta artificial para a cultura de D. suzukii. Os métodos foram desenvolvidos utilizando material G3 originalmente coletado de Kunming, China8. (2) Criação em massa para liberação de campo em gaiolas grandes usando frutas hospedeiras (mirtilo) para a cultura de D. suzukii. O grupo genético utilizado para a criação em larga escala foi o estoque do G1 originário de Tóquio, Japão 9,22. Outras escalas de métodos de criação, como o uso de frascos ou pequenos recipientes para ambos os grupos, também são brevemente discutidas.

<table><tbody><tr><td>Levedura seca ativa</td><td>Levedura Fleischmanns, Cincinatti, OH, EUA</td><td>Nenhuma</td><td>Usada para cobrir frutas para reduzir o crescimento de fungos e aumentar a atração de frui pelas moscas</td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>Merk Life Science S.r.l., Milão, Itália</td><td>A1296 - 5KG</td><td>Usado para preparar a solução de alvejante médio padrão de Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>Clorox Company, Oakland, CA, EUA</td><td>Nenhum</td><td>Usado para desinfetar frutas</td></tr> <tr><td>de carneRolha azul</td><td>Azer Scientific, Morgantown, PA, EUA</td><td>ES3837</td><td>Usado para selar o tubo enquanto permite ventilação para insetos</td></tr><tr><td>Mirtilos</td><td>Mercearia, Newark, DE, EUA</td><td>Nenhum</td><td>Fornecido como fruta hospedeira para as moscas (várias outras frutas também podem ser usadas)</td></tr> <tr><td>Gaiola de criação de insetos BugDorm (L24,5 x P24,5 x A63,0 cm)</td> <td>Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan</td><td>4E3030</td><td>Usado para criar parasitóides (gaiola de parasitismo)</td></tr><tr><td>Gaiola de criação de insetos BugDorm (L32,5 x P32,5 x A32,5 cm)</td><td>Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan</td><td>4E4590</td><td>Usado para criar moscas</td></tr><tr><td>Gaiola de criação de insetos BugDorm (L32,5 x P32,5 x A32,5 cm)</td><td>Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan</td><td>4E4545</td><td>Usado para criar parasitóides (gaiola de eclosão)</td></tr><tr><td>Arame (0,64 cm, 19 gauge)</td><td>Everbilt, OH, USA</td><td>308231EB</td><td>Usado para levantar a fruta para permitir a máxima oviposição do parasitóide</td></tr><tr><td>Mercearia de Fubá</td><td>, Trento, TN, Itália</td><td>Nenhum</td><td>Usado para preparar o rolo de algodão dental médio padrão Drosophila</td></tr><tr><td>(1 x 3,8 cm)</td><td>Gima S.p.A., Gessate, MI, Itália</td><td>35000</td><td>Usado para fornecer água aos parasitóides dentro do recipiente de armazenamento</td></tr><tr><td>Dieta</td> <td>DrosophilaFrontier Scientific, Newark, DE, EUA</td><td>TF1003</td><td>Dieta personalizada usada para criar moscas</td></tr><tr><td>Frascos de Drosophila estreitos, Poliestireno (2,5 x 9,5 cm)</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>75813-160</td><td>Usado para fornecer água aos parasitóides dentro da gaiola</td></tr><tr><td>Tampões de frascos de Drosophila, Acetato de celulose (2,5 cm)</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>89168-886</td><td>Usado para fornecer água aos parasitóides dentro da gaiola</td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer (250 mL)</td><td>Carolina Biological, Burlington, NC, EUA</td><td>731029</td><td>Usado para criar moscas e parasitóides</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estilo Falcon (50 mL)</td><td>VWR International, LLC., Radnor, PA, US</td><td>VWRI525-0611</td><td>Modificado para enviar parasitóides adultos</td></tr><tr><td>Rolha de espuma</td><td>Jaece Industries, North Tanawanda, NY, EUA</td><td>L800-C</td><td>Usado para selar os frascos enquanto permite ventilação para insetos</td></tr><tr><td>Mercearia de mel</td><td>, Newark, DE, EUA</td><td>Nenhum</td><td>Fornecido como alimento para parasitóides</td></tr><tr><td>Rolha de espuma de plástico Identi-Plug</td><td>Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US</td><td>14-127-40E</td><td>Usado como alimentador para parasitóides e para selar o recipiente de armazenamento</td></tr><tr><td>Toalha de papel industrial</td><td>Mercearia, Newark, DE, EUA</td><td>Nenhum</td><td>Fornecido como substrato de pupação para pupas e umidade mitigada</td></tr><tr><td>Tecido de malha de mícron (250 mL)</td><td>Rede Industrial, Maple Grove, MN, EUA</td><td>WN0250-72</td><td>Usado para fazer tampa de ventilação para insetos</td></tr><tr><td>Levedura nutricional (flocos)</td><td>Mercearia, Trento, TN, Itália</td><td>Nenhum</td><td>Usado para preparar o porta-copos de papel médio padrão Drosophila</td></tr><tr><td>(10,2 cm)</td><td>Hoffmaster, WI, EUA</td><td>35NG26</td><td>Fornecido como substrato de pupação para moscas e pupas</td></tr> <tr><td>parsitizadasCopo de plástico (&Oslash; 13,3 cm, 800 mL)</td><td>Berry Superfos, Taastrup, Dinamarca</td><td>Unipak 5134</td><td>Modificado para armazenar parasitóides adultos</td></tr><tr><td>Tampa de plástico (&Oslash; 13,3 cm)</td><td>Berry Superfos, Taastrup, Dinamarca</td><td>PP 2830</td><td>Modificado para armazenar parasitóides adultos</td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Merk Life Science S.r.l., Milão, Itália</td><td>P1386 - 1L</td><td>Usado para preparar a sacarose</td></tr> <tr><td></td><td>média padrão de DrosophilaMercearia, Trento, TN, Itália</td><td>Nenhum</td><td>Usado para preparar o copo de sopa médio padrão Drosophila</td></tr><tr><td>com tampa (475 mL)</td> <td>StackMan, Vietnã</td><td>DC1648</td><td>Usado para larvas parasitadas para pupar</td></tr><tr><td>Farinha de soja</td><td>Mercearia, Trento, TN, Itália</td><td>Nenhum</td><td>Usado para preparar a arruela de feltro branco médio padrão Drosophila</td></tr><tr><td>(0,64 cm de espessura, 5 mm ID x 20 mm OD)</td> <td>Quiklok, Lincoln, NH, EUA</td><td>WFW/.25 x 5 x 20 mm</td><td>Usado como anel de alimentação para parasitóides</td></tr></tbody></table>

métodos de criação do parasitoide ganaspis brasiliensis, um agente promissor de controle biológico para a drosophila suzukii invasiva

Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii

Nativa do leste da Ásia, a drosophila de asa manchada, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), estabeleceu-se amplamente nas Américas, Europa e partes da África na última década, tornando-se uma praga devastadora de várias frutas de pele macia em suas regiões invadidas. O controle biológico, especialmente por meio de parasitoides autoperpetuantes e especializados, deverá ser uma opção viável para uma gestão sustentável em toda a área desta praga altamente móvel e polifagosa. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) é um parasitoide larval que é amplamente distribuído no leste da Ásia, e foi encontrado como um dos parasitoides mais eficazes de D. suzukii.
Após rigorosas avaliações pré-introdução de sua eficácia e potenciais riscos não-alvo, um dos grupos genéticos mais específicos para hospedeiros desta espécie (G1 G. brasiliensis) foi aprovado recentemente para introdução e liberação de campo nos Estados Unidos e na Itália. Outro grupo genético (G3 G. brasiliensis), que também foi comumente encontrado para atacar D. suzukii no leste da Ásia, pode ser considerado para introdução em um futuro próximo. Atualmente, há um enorme interesse em criar g. brasiliensis para pesquisa ou em produção em massa para lançamento de campo contra D. suzukii. Este protocolo e artigo de vídeo associados descrevem métodos eficazes de criação para este parasitoide, tanto em pequena escala para pesquisa quanto em grande escala para produção em massa e lançamento de campo. Esses métodos podem beneficiar mais pesquisas de longo prazo e o uso deste parasitoide asiático-nativo como um agente de controle biológico promissor para esta praga invasiva global.

A Figura 4 mostra resultados representativos da criação laboratorial em pequena escala do G3 Ganaspis brasiliensis usando duas densidades parasitoides diferentes (seis ou dez pares) e dois tempos de exposição diferentes (5 ou 10 dias) na instalação de quarentena da Unidade de Introdução de Insetos Benéficos do USDA-ARS (Newark, Delaware). Houve 14 réplicas para cada combinação de densidade parasitoide e tempo de exposição. No total, os 64 frascos produziram 4.018 vespas (71,7 ± 4,9 ...

Ganaspis brasiliensis-a larval parasitoide de Drosophila suzukii (uma praga global de cultura de frutas invasivas)-- foi aprovado ou é considerado para introdução na Europa e nos Estados Unidos para o controle biológico desta praga. Este artigo fornece protocolos para a criação em pequena escala e em larga escala deste parasitoide.

Métodos de Criação do Parasitoide Ganaspis brasiliensis, um Agente promissor de controle biológico para a Drosophila suzukii invasiva

Native to East Asia, the spotted-wing drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), has established widely in the Americas, Europe, ...

A pesquisa de longo prazo e o uso de um agente de biocontrole dependem da disponibilidade de técnicas eficazes e econômicas de criação, e este protocolo tem se mostrado eficiente para a criação desse parasitoide. Atualmente, há um enorme interesse em criar este parasitoide para pesquisa ou liberação de campo, e o protocolo beneficiará futuras pesquisas de longo prazo e uso deste promissor agente de biocontrole. Os primeiros usuários podem precisar entender alguma biologia básica dos insetos envolvidos através da leitura das referências relevantes fornecidas no artigo e algumas práticas dos métodos.Para fazer a dieta do hospedeiro, primeiro, prepare a porção líquida da dieta como descrito no manuscrito. Em seguida, adicione 25 a 30 gramas de mirtilos amassados a um frasco vazio de 250 mililitros. Em seguida, despeje o líquido no frasco com o líquido apenas cobrindo o topo do purê de mirtilos.Em seguida, para criar a hospedeira Drosophila suzuki, primeiro corte um pedaço de papel toalha absorvente e torça-o no centro. Em seguida, coloque a parte do meio torcido da toalha de papel no frasco de dieta. Para reter a umidade, use água destilada para molhar a toalha de papel e a dieta.Então, para transferir moscas adultas sexualmente maduras, remova cuidadosamente a rolha de um frasco de colônia de moscas e inverta-a no frasco da dieta. Depois de uma semana dessa exposição, segure as moscas em uma câmara ambiental por três semanas para o surgimento de moscas. Para expor larvas hospedeiras a parasitoides, primeiro remova as moscas adultas e a toalha de papel do frasco, deixando os ovos de mosca e larvas.Para servir como substrato de pupação para as larvas, dobre uma nova toalha de papel absorvente e insira-a no frasco. Em seguida, aspire seis pares femininos e masculinos do parasitoide G3 Ganaspis brasiliensis no frasco e listrar uma fina camada de mel na parte inferior da rolha de espuma. Para coletar e armazenar os parasitoides, remova os adultos após cinco dias.Em seguida, armazene o frasco na câmara ambiental por 35 dias sob as condições mencionadas anteriormente. Com o surgimento de vespas adultas, aspirar-as três vezes por semana. Para segurar as vespas, primeiro coloque uma toalha de papel umedecido, mas não saturada com água destilada no fundo de um frasco de Drosophila de 2,5 por 9,5 centímetros quadrados.Em seguida, transfira cerca de 60 vespas para o frasco e marque a data de emergência. Guarde o frasco na câmara ambiental. Duas vezes por semana, coloque uma fina camada de mel na parte inferior da rolha de espuma dos frascos.Primeiro, organize a criação em larga escala de Drosophila suzuki colocando 1.500 a 2.000 moscas adultas sexualmente maduras a uma proporção sexual de 50:50 em uma gaiola grande, tricotada e coberta de malha. Em seguida, coloque um prato com algodão encharcado de água e quatro a seis pratos de Petri com meio Drosophila padrão na gaiola. Duas vezes por semana, substitua as placas de Petri expostas por outras novas.Coloque cada placa de Petri infestada sem a tampa em um copo de plástico de 800 mililitros e cubra o copo com uma malha fina. Em seguida, incubar os copos a 23 graus Celsius e 75% de umidade relativa por 12 a 15 dias. Após a incubação, transfira drosophila suzuki adulto recém-hatched para uma gaiola de criação.Em seguida, comece a preparar as larvas hospedeiras enxaguando mirtilos em água fria por um minuto e mergulhe as frutas em uma bacia cheia de uma solução de alvejante, diluída para 5% por três minutos. Em seguida, encha pratos petri de nove centímetros com as mirtilos lavados. No final da tarde, coloque os pratos de Petri na gaiola de criação e deixe-os durante a noite.Na manhã seguinte, bata suavemente nas placas de Petri para desalojar moscas das frutas e remover as frutas da gaiola de criação. Enquanto isso, prepare uma gaiola de parasitismo e uma gaiola de emergência para o parasitoide G1 Ganaspis brasiliensis. Ambas as gaiolas devem ter uma corda fina abaixo do teto para suspender um ou mais alimentadores.Em cada gaiola, suspenda um frasco de Drosophila contendo água e vedação com um plugue de acetato de celulose de cabeça para baixo do teto a cada cinco a sete dias, dependendo da umidade relativa. Imediatamente após tirar mirtilos infestados da gaiola Drosophila suzuki, colocá-los na gaiola de parasitismo com 1.500 a 2.000 vespas Ganaspis brasiliensis por dois a três dias. Em seguida, colete as frutas em um copo plástico de 800 mililitros com papel absorvente na parte inferior.Incubar o copo aberto na gaiola de emergência ou eclosão a 21 graus Celsius e 65% de umidade relativa por pelo menos 28 dias. Durante a segunda e terceira semanas de incubação, verifique semanalmente a gaiola para o encerramento do hospedeiro antecipado. Para facilitar a sucessiva coleta parasitoide, remova as moscas adultas.No final da quarta semana de incubação, forneça um alimentador e uma fonte de água para a gaiola. Recolher cerca de 10 a 15% das vespas adultas e transferi-las para a gaiola de parasitismo para substituir vespas velhas e improdutivas. Das vespas restantes da gaiola de eclosão, armazene até 700 adultos a uma relação sexual de 50:50 com um copo plástico de 800 mililitros contendo um tubo de dois mililitros cheio de água e selado com um rolo de algodão dental no fundo do copo.Guarde o copo com um estado de emergência marcado em uma câmara ambiental por até um mês. Para parasitoides de transporte, coloque cerca de 200 adultos em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, coloque todos os tubos em um recipiente de transporte isolante junto com blocos de gelo.Este protocolo resultou no sucesso da criação em pequena escala do G3 Ganaspis brasiliensis, um agente parasitoide, contra a peste agrícola Drosophila suzuki no laboratório. A produção de descendentes não foi afetada por diferenças na densidade parasitoide e no tempo de exposição. A geração em larga escala do G1 Ganaspis brasiliensis também pôde ser alcançada, com a produção começando cinco semanas após a exposição inicial à hospedeira Drosophila suzuki.Da semana 8 até a semana 22, a produção parasitoide tornou-se proporcional à quantidade de frutas expostas a eles. É extremamente importante manter uma temperatura de criação adequada, controlar a umidade e sempre fornecer alimentos para insetos adultos. Os métodos poderiam ser melhorados otimizando ainda mais as densidades de criação de hospedeiros e parasitoides para maximizar a reprodução de vespas e explorando a possibilidade de criar este parasitoide em hosts alternativos.

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Métodos de Criação do Parasitoide Ganaspis brasiliensis, um Agente promissor de controle biológico para a Drosophila suzukii invasiva (Vídeo) | JoVE Journal

Métodos de Criação do Parasitoide Ganaspis brasiliensis, um Agente promissor de controle biológico para a Drosophila suzukii invasiva

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