Name: Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda microscopia de fluorescência em folha de luz para quantificar Trypanosoma cruzi e células T em órgãos esclarecidos de modelos de doença de Chagas. Este método permite avaliar resultados terapêuticos.

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Agradecemos ao Dr. Etsuo Susaki por sua valiosa ajuda e recomendações sobre protocolos de limpeza de tecidos e imunossuagem. Além disso, somos gratos a M. Kandasamy do CtEGD Biomedical Microscopy Core por suporte técnico usando LSFM e imagem confocal. Agradecemos também a todos os membros do Tarleton Research Group por sugestões úteis ao longo deste estudo.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
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<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
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<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
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<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
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<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

A ausência de imagens extensas e de órgãos inteiros de parasitas e a resposta imune limita a compreensão da complexidade das interações hospedeiro-parasita e impede a avaliação das terapias para a doença de Chagas. O presente estudo adotou o gasoduto CUBIC para esclarecer e manchar órgãos e tecidos intactos de camundongos infectados por T. cruzi.
Vários protocolos de limpeza de tecidos foram testados neste estudo (PACT32, ECi33, FLASH<su...

A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário T. cruzi, está entre as doenças tropicais mais negligenciadas do mundo, causando aproximadamente 13.000 mortes anuais. A infecção muitas vezes progride de um estágio agudo para um estágio crônico produzindo patologia cardíaca em 30% dos pacientes, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita 1,2. Apesar da forte resposta imune hospedeira provocada contra o parasita durante a fase aguda, o baixo número de parasitas cronicamente persiste ao longo da vida do hospedeiro em tecidos como o coração e o músculo esquelético. Vários fatores, incluindo o início atrasado das respostas imunes adaptativas e a presença de formas não replicantes do parasita, podem contribuir para a capacidade de T. cruzi para evitar uma eliminação completa pelo sistema imunológico 3,4,5,6. Além disso, as formas dormentes não replicadas do parasita apresentam baixa suscetibilidade aos fármacos trypanocidas e podem, em parte, ser responsáveis pela falha de tratamento observada em muitos casos 7,8.
O desenvolvimento de novas técnicas de imagem proporciona uma oportunidade de obter uma visão sobre a distribuição espacial dos parasitas nos tecidos infectados e sua relação com as células imunes envolvidas em seu controle. Essas características são cruciais para uma melhor compreensão dos processos de controle de parasitas pelo sistema imunológico e rastreamento dos raros parasitas dormentes presentes nos tecidos crônicos.
A microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) é um dos métodos mais abrangentes e imparcial para imagens 3D de grandes tecidos ou órgãos sem secção fina. Microscópios de folha de luz utilizam uma fina folha de luz para apenas excitar os fluoroforos no plano focal, reduzir o fotobleaching e a fototoxicidade das amostras, e gravar imagens de milhares de camadas de tecido usando câmeras ultrarrápidas. O alto nível de transparência tecidual necessário para a penetração adequada da luz laser nos tecidos é obtido pela homogeneização do índice de refração (RI) após a delipidação e descoloração do tecido, o que reduz a dispersão da luz e torna imagens de alta qualidade 9,10,11.
Abordagens de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para a imagem de camundongos inteiros 12,13,14, organoides 15,16,17, órgãos expressando marcadores fluorescentes repórteres 18,19,20,21,22,23, e recentemente um número limitado de tecidos humanos24 . Os métodos atuais de limpeza tecidual são classificados em três famílias: (1) métodos orgânicos à base de solventes, como os protocolos DISCO 25,26, (2) métodos à base de hidrogel, como CLARITY27, e métodos aquosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis)18,19,28,29 . Os protocolos CÚBICOS mantêm a forma dos órgãos e a integridade dos tecidos, preservando a fluorescência das proteínas de repórteres expressas endógenamente. A atualização mais recente desta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), também permite a detecção de epítopos usando anticorpos fluorescentes e rotulagem de DNA28.
No presente protocolo, utilizou-se o pipeline CUBIC para detecção de T. cruzi expressando proteínas fluorescentes em tecidos de camundongos intactos esclarecidos. Os tecidos opticamente transparentes foram imagens LSFM, reconstruídas em 3D, e o número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes dormentes e células T por órgão foram automaticamente quantificados. Além disso, este protocolo foi adotado com sucesso para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares. Essas abordagens são essenciais para a compreensão da expansão e controle de T. cruzi em hospedeiros infectados e são úteis para avaliar plenamente a quimioterapia e a imunoterapia para a doença de Chagas.

<table><tbody><tr><td>1-metilimidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolona (Antipirina</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr> placas <tr><td>de cultura de células de 6 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmento</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-coelho Fab fragmento</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>nanocorpo anti-GFP Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alfa;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Nome comum: Ai14, Ai14D ou Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Nome comum: Ai14 , Ai14D ou Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 Iodide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J camundongo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #032080</td><td>Comum Nome: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de limpeza Kimwipes</td><td>&nbsp; Microscópio</td> confocal de varredura a laser Kimberly-Clark <td>T8788</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit de imunocoloração 3D</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit de coloração nuclear 3D</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R +</td> <td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Supercola de gel à base de cianoacrilato</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina) Empresa: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etileno diamina tetraacético (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de centrífuga 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Tubos de centrífuga Falcon 50&nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma</td><td>#H3884 ou #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>Software ImSpector</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de injeção intravenosa 23-G</td><td>Sartori, Minisart Filtro de seringa</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes sem fiapos</td> <td>Kimwipes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente de folha de luz</td> Sistema de imagem <td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II Metanol</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta, 10 &micro; L, 200 &micro; L e 1.000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y e T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de pipeta motorizado</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Solução de montagem</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butildietanolamina</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-metilnicotinamida</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Perfusão de Sacrifício</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td> Ferramentas <td>de Ciência Fina</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitadora</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sódio (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Mancha de ácido nucleico verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem 3d quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células t em órgãos esclarecidos intactos

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

A doença de Chagas é uma patologia negligenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente na América Latina. O agente da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é um parasita intracelular obrigatório com uma biologia diversificada que infecta várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causando patologias cardíacas e digestivas. A detecção confiável de infecções in vivo de T. cruzi há muito tempo é necessária para entender a biologia complexa da doença de Chagas e avaliar com precisão o resultado dos regimes de tratamento. O protocolo atual demonstra um pipeline integrado para quantificação automatizada de células infectadas por T. cruzi em órgãos limpos em 3D. A microscopia fluorescente de folha de luz permite visualizar e quantificar com precisão parasitas T. cruzi e células de efeito imunológico em órgãos ou tecidos inteiros. Além disso, o gasoduto CUBIC-HistoVision para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares foi adotado com sucesso. A limpeza tecidual aliada à imunostaining 3D fornece uma abordagem imparcial para avaliar de forma abrangente os protocolos de tratamento de drogas, melhorar a compreensão da organização celular dos tecidos infectados por T. cruzi, e espera-se que avancem descobertas relacionadas às respostas imunes anti-T. cruzi , danos teciduais e reparação na doença de Chagas.

Os tecidos fixos cúbicos foram lavados com PBS para remover fixativos e, em seguida, incubados com coquetéis CUBIC-L, uma solução básica tamponada de aminocos que extraem pigmentos e lipídios do tecido resultando em descoloração do tecido, mantendo a arquitetura tecidual. As linhas de grade no papel podem ser vistas através dos tecidos indicando uma limpeza adequada dos órgãos (Figura 2A). Após a delipidação, os tecidos foram lavados e imersos em CUBIC-R+ e solução de montag...

O presente protocolo descreve microscopia fluorescente de folha de luz e métodos automatizados assistidos por software para visualizar e quantificar precisamente parasitas Trypanosoma cruzi e células T intactos e limpos. Essas técnicas fornecem uma maneira confiável de avaliar os resultados do tratamento e oferecem novas percepções sobre as interações parasita-host.

Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Esta técnica proporcionou uma imagem mais completa e 3D de órgãos transparentes inteiros e foi útil para a quantificação, não apenas de replicar, mas também de células de parasitas e fatores imunes adormecidos. Esta técnica nos permite determinar a associação especial de parasitas, células imunes e os danos teciduais resultantes da infecção. A imunossuagem de epitope e a rotulagem de DNA também foram comparáveis com essa técnica.Este protocolo foi efetivamente utilizado para avaliar os desfechos de tratamento em modelos de camundongos da doença de Chagas. Um tratamento de doses individuais mais elevadas, dado com menos frequência durante um longo período de tratamento, elimina tanto parasitas replicados quanto dormentes. Demonstrando o procedimento estará Caleb Hawkins, um técnico de pesquisa do laboratório de Rick Tarleton.Depois de eutanizar, dissecar e fixar os órgãos de um rato infectado como descrito no manuscrito, mergulhe órgãos individuais em 10 mililitros de 50% diluídos de água CUBIC-L, com suave agitação à temperatura ambiente em tubos cônicos de 50 mililitros durante a noite protegidos da luz. No dia seguinte, substitua 50% CUBIC-L por 10 mililitros de 100% CUBIC-L, e incuba por seis dias a 37 graus Celsius, mantendo o tubo plano na incubadora de shaker. Ao final deste período de incubação, os tecidos devem ser quase completamente transparentes.Lave os órgãos transparentes duas vezes com PBS por duas horas a 37 graus Celsius, com agitação suave. A cada lavagem, transfira os tecidos para um novo tubo cônico de 50 mililitros para remover Triton X-100. Para coloração de DNA, diluir o corante de ácido nucleico comercialmente disponível em cinco mililitros de tampão de coloração em 1:2.500.Em seguida, mergulhe o tecido em um tubo cônico de 15 mililitros contendo solução de corante nuclear, e incubar a 37 graus Celsius, com rotação suave por cinco dias em posição de pé. Lave o tecido três vezes com 15 mililitros de tampão de lavagem de manchas nucleares 3D por duas horas em temperatura ambiente, com agitação suave. Calcule a quantidade necessária de anticorpos primários e secundários.Misture anticorpos primários e secundários em um tubo âmbar de dois mililitros, e incubar a 37 graus Celsius por 1,5 horas. Para troca de buffer, misture 7,5 mililitros de tampão de imunostaining 3D 2x HV1 com 7,5 mililitros de água dupla destilada. Mergulhe a amostra de tecido no tampão e incubar por 1,5 horas a 32 graus Celsius, com agitação suave em um tubo cônico de 15 mililitros em uma posição horizontal.Colete a amostra de tecido da mídia de troca de buffer e mergulhe-a na solução de coloração de anticorpos. Incubar tecidos individualmente por uma semana a 32 graus Celsius, balançando suavemente os tubos em uma posição de pé longe da luz. Mova as amostras de tecido para quatro graus Celsius, e incuba em posição de pé.Depois de resfriar o tampão de lavagem de imunossuagem HV1 3D a quatro graus Celsius, lave a amostra com 15 mililitros de tampão duas vezes a quatro graus Celsius por 30 minutos, cada um com suave agitação em uma posição horizontal. Diluir a formalina para 1% no amortecedor de lavagem de imunossuagem HV1 3D, e imergir a amostra em oito mililitros da solução por 24 horas a quatro graus Celsius, com agitação suave. Agora, incubar a amostra em uma solução fresca de 1%formalina por uma hora a 37 graus Celsius, e lavar em 15 mililitros de PBS por duas horas a 25 graus Celsius.Mergulhe órgãos transparentes em um tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de 50% de água diluída SOLUÇÃO CUBIC-R+à temperatura ambiente, com agitação suave. Substitua-o por cinco mililitros 100% CUBIC-R+e incubar com agitação suave por dois dias. Seque os tecidos usando Kimwipes e, em seguida, transfira-os para cinco mililitros de solução de montagem em uma placa de cultura de seis poços, e incuba-os à temperatura ambiente.Adere os tecidos ao suporte da amostra de microscópio usando super cola gel. Mergulhe as amostras no microscópio de quartzo cuvette preenchido com 120 mililitros de solução de montagem. Imagem-os transversalmente ao seu eixo longitudinal, e adere ao coração, com o ápice e a aorta horizontalmente alinhados.3D reconstruído O coração infectado por Trypanosoma cruzi apresentou uma maior proporção de células infectadas no átrio, em comparação com ventrículos. Parasitas dormentes podem ser identificados no coração, como descrito nos insets 3D aumentados. As células T que expressam ZsGreen1, bem como as células infectadas pelo Trypanosoma cruzi, foram visualizadas no músculo esquelético de um rato repórter CD8 infectado com Trypanosoma cruzi.Zoom-ins 3D de imagem reconstruída em 3D identificaram células T na região de uma célula infectada. A interface das células T em células infectadas pelo hospedeiro foi visualizada por microscopia confocal. No coração de um camundongo imunodeficente, foram detectadas células hospedeiras infectadas com duas cepas diferentes de Trypanosoma cruzi, e o corte através dos tecidos mostrou abundantes células infectadas por parasitas no coração atria em várias profundidades teciduais.A imunodecalça da vasculatura em Trypanosoma cruzi-infected e coração limpo revela a vasculatura intrincada do coração. Células infectadas por parasitas podem ser observadas no coração atria. A coloração nuclear do músculo esquelético mostrou um acúmulo de núcleos em áreas com poucos ou indetectáveis parasitas tdTomato.O aumento dos marcadores de repórteres de parasitas tdTomato e GFP com anticorpos contra RFP e GFP, e músculo esquelético totalmente limpo resultou em forte fluorescência. Assim, os pontos críticos são o tempo de incubação no buffer CUBIC, o tempo de diluição e incubação no corante de DNA, o tempo de incubação nos anticorpos e o tempo de incubação na solução refratada de correspondência de índices. O uso de manchas adicionais, com corante de anticorpos específicos e reação rápida, poderia aumentar significativamente o potencial dessa técnica, permitindo a detecção de múltiplas células, processos e estrutura em órgãos intactos.Agora temos uma maneira melhor e mais completa de explorar as células imunes responsáveis pela morte dos parasitas, os tecidos onde os parasitas persistem cronicamente, e a distribuição das drogas específicas nos tecidos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós mostramos o método para a realização de microscopia intravital do baço usando parasitas da malária transgênica GFP ea quantificação da mobilidade do parasita e do fluxo sanguíneo dentro do órgão.

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Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

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Usando este protocolo, fomos capazes de imagem 160 um seções do cérebro de espessura de camundongos infectados com o parasita Toxoplasma gondii, que permite a visualização e análise da relação espacial entre o parasita encistamento eo neurônio infectado.

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Neste protocolo, fluorescente etiquetadas T. cruzi foram injetados em larvas de peixe-zebra transparente, e motilidade do parasita foi observada na vivo usando microscopia de fluorescência folha de luz.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

O Trypanosoma cruzi agente da doença de Chagas produz duradouro infecções assintomáticas que se desenvolvem abruptamente em patologia clinicamente reconhecida. O protocolo de pesquisa a seguir descreve um curto prazo baseada na família epidemiológico estudo para desvendar a T. cruzi infecção transmitida sexualmente da mãe à progênie.

Transmissão sexual de tripanosomas americanas de machos e fêmeas para companheiros de ingênua

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Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Aprenda microscopia de fluorescência em folha de luz para quantificar Trypanosoma cruzi e células T em órgãos esclarecidos de modelos de doença de Chagas. Este método permite avaliar resultados terapêuticos.

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