Name: Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a fabricar retalhos vasculares com rede hierárquica usando impressão 3D para engenharia de tecidos. Este método permite anastomose direta com vasos do hospedeiro e estuda o comportamento vascular in vivo em modelo de rato.

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Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de concessão nº 818808). rhCollMA foi generosamente fornecido por CollPlant (Rehovot, Israel). Os autores agradecem à Autoridade de Pesquisa Pré-Clínica da Technion pela assistência com os cuidados com animais, bem como Janette Zavin, Galia Ben David e Idan Redenski.

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<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li>
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<li>Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cuff+design+to+facilitate+anastomosis+of+small+vessels+during+cervical+heterotopic+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats.</a> Comparative Medicine. 64 (4), (2014).</li>
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<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scaffold+system+for+studying+the+effect+of+local+geometry+and+topology+on+the+development+and+orientation+of+sprouting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels.</a> Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).</li>
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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A engenharia de tecidos vascularizados é um dos principais desafios da engenharia de tecidos20. Os métodos atuais para criar tecidos vasculares projetados se concentram na criação de microvasculatura auto-montada 21,22,23 ou na fabricação de andaimes vasculares mesoescalados24,25 e não na recriação de um sistema de vasculatura hierárquica, que pode ser perfumado imediatamente e diretamente após a implantação26 . Neste trabalho, descrevemos um protocolo que faz uso de duas modalidades de impressão 3D para fabricar uma rede de embarcações hierárquicas composta por vasculaturas de microescala e mesoescala. O protocolo combina uma rede microvascular auto-montada em 3D com um andaime vascular mesoescalado, alcançando um retap implantável e vascularizado. Além disso, este artigo apresenta um protocolo para anastomosar diretamente este retalho à artéria femoral de um rato.
A bioimpressão 3D ganhou interesse nos últimos anos devido à sua versatilidade em relação às técnicas tradicionais de engenharia de tecidos. Embora este protocolo descreva a geração de uma rede microvascular no bioink rhCollMA, os métodos utilizados podem ser aplicados com poucas modificações a muitas outras bioinks da infinidade de bioinks estudados e novos e banhos de suporte27,28. Optamos por usar o rhCollMA como um bioink devido à abundância de colágeno tipo I no ECM humano, proporcionando um ambiente adequado para o apego celular. Além disso, é produzido recombinantemente em plantas e ainda modificado com grupos de metacrilato, o que permite a fotopolimerização e a formação de hidrogéis 3D estáveis 29,30. O fotocrosslinking foi conseguido pela adição do fotoiniciador LAP, que se mostrou não tóxico e é ativado pela exposição à luz azul de 405 nm, reduzindo a possível fototoxicidade da luz UV. No entanto, o uso de bioinks fotosensitivos requer o uso de um meio de cultura livre de fenol para a preparação do bioink e do material de suporte. Além disso, o protocolo descreve o uso de material de suporte à gelatina, que permite a extrusão de alta fidelidade de bioinks como rhCollMA. Assim, é fundamental garantir o uso do meio frio durante sua preparação e o resfriamento do leito da impressora. O aquecimento excessivo pode ocorrer devido à fonte de luz usada para crosslinking ou de temperaturas ambientais elevadas.
Uma bioimpressora baseada em extrusão foi usada aqui para criar a rede microvascular bioimpressora, e atualmente existem muitos bioimpressores disponíveis comercialmente que podem gerar construções semelhantes. Além disso, os métodos propostos podem ser facilmente modificados e aplicados para estudar diferentes geometrias, tamanhos e padrões de enchimento. Neste trabalho, um padrão de enchimento retilinear foi escolhido para criar poros interconectados, e isso pode ser impresso relativamente rapidamente com alta fidelidade.
As bolhas de ar introduzem um desafio significativo na bioimpressão de extrusão, especialmente materiais de suporte interno. Por isso, é fundamental minimizar a presença e a formação dessas bolhas utilizando pipetas de deslocamento positivas para a transferência do material de suporte, a preparação da suspensão bioink-cell e sua transferência para os cartuchos de impressão.
Neste trabalho, células endoteliais derivadas de adiposos humanos e células-tronco de polpa dentária foram usadas como células de apoio devido ao seu isolamento relativamente fácil dos pacientes. Além disso, foi escolhida uma concentração celular total de 8 x 106 células/mL, uma vez que essa concentração foi demonstrada para estabelecer as redes vasculares mais desenvolvidas16. Embora este protocolo possa ser empregado para gerar microvasculatura utilizando diferentes tipos e fontes celulares, bem como diferentes bioinks, uma calibração da concentração celular deve ser feita para estabelecer as melhores condições para o desenvolvimento da rede microvascular. Além disso, células específicas do tecido (ou seja, míobios ou osteoblastos) podem ser incorporadas dentro do bioink para alcançar retalhos vascularizados específicos do tecido.
O molde para o andaime vascular poroso foi fabricado usando material solúvel em água impressa em 3D em uma impressora 3D de extrusão comercialmente disponível. Isso resulta em uma técnica econômica baseada em plataformas de prototipagem rápida, de modo que muitas geometrias e tamanhos diferentes de andaimes vasculares podem ser estudados e rastreados rapidamente31. No entanto, uma limitação deste método é o limite de resolução da maioria das impressoras3D 32. No entanto, com a indústria em rápida evolução em torno da manufatura aditiva, espera-se que esses limites melhorem com o tempo. O uso de solventes orgânicos para o processo de fabricação é outra limitação do protocolo, uma vez que a maioria dos solventes orgânicos são tóxicos para as células, impedindo a capacidade de combinar o procedimento de bioimpressão com o processo de fabricação de andaimes vasculares.
O método descrito de semear o lúmen do andaime usando aspiração em vez de empurrar a suspensão celular tem grandes efeitos na localização das células semeadas. O uso de pressão negativa permite a endotopelização do lúmen interno do andaime, minimizando qualquer derramamento da suspensão celular através das perfurações na parede16 do andaime.
O método descrito de "manguito" para anastomos microcirúrgicos pode ser facilmente modificado e adaptado a diferentes materiais ou tamanhos de andaimes vasculares, bem como a diferentes artérias e veias em uma ampla escala de modelos animais. As adaptações ao protocolo incluiriam diferentes tamanhos de tubos de poliimida e tamanhos de sutura. Este método não requer a perfuração da parede do andaime, o que pode levar ao desenvolvimento de defeitos. Este trabalho apresenta um protocolo que pode ser expandido para muitas aplicações. Os aspectos críticos deste protocolo, que incluem a fabricação da vasculatura meso e microescala e sua montagem e implantação, representam aspectos críticos de retalhos projetados tanto para aplicações reconstrutivas, quanto para estudos vasculares e outros estudos de engenharia de tecidos.

Defeitos teciduais graves são causados por lesões traumáticas, defeitos congênitos ou doenças, e o padrão-ouro atual para o tratamento desses defeitos é usando enxertos autólogos, retalhos de tecido vascularizado e retalhos livres de microvasculares como substitutos teciduais. No entanto, essas opções têm as desvantagens do tecido limitado do site do doador e da morbidadedo site do doador 1. Assim, há uma demanda crescente por substitutos alternativos de tecido que podem ser usados para corrigir esses defeitos2. A espessura das construções teciduais projetadas é limitada pela difusão de nutrientes e gases em direção às células, e, portanto, uma rede vascular adequada é essencial para gerar andaimes grandes, grossos e devidamente nutridos.
Diversas abordagens têm sido aplicadas para promover a vascularização de implantes projetados3, incluindo o recrutamento in vivo de apoio vascular do hospedeiro, a entrega de fatores de crescimento e citocinas dentro dos andaimes, a pré-escavação de implantes, a geração de um leito de microvessel de ramificação perfumável utilizando técnicas de micropattersing4, o uso de materiais sacrificiais para formação de canais vasculares/rede5 , bem como a criação de canais dentro de construções bioimpressoras 3D 5,6. A vascularização de tecidos grossos requer a incorporação de uma rede vascular hierárquica composta por vasos em escala macro e microcapilares. Os vasos em macroesculência distribuem sangue efetivamente durante toda a construção e permitem anastomoses microcirúrgicos com os vasos sanguíneos hospedeiros, enquanto os vasos em escala microcapilar permitem a difusão de nutrientes.
A bioimpressão ganhou forte atenção nos últimos anos devido às vantagens que oferece em relação aos métodos convencionais de engenharia de tecidos. Tecidos e órgãos são objetos 3D complexos e intrincados com uma arquitetura específica. A bioimpressão 3D, com sua capacidade de depositar camadas de biomateriais em alta resolução, permite a capacidade de criar complexos substitutos de tecidos e órgãos (por exemplo, rim, pulmão, fígado)7. Várias tecnologias de impressão foram adaptadas para bioimpressão, incluindo a exposição baseada em extrusão, jato de tinta8, deposição assistida a laser 9,10 e bioimpressão baseada em estereolíticos11,12. As tecnologias baseadas em extrusão dependem de extrudamento do material através de um bocal, aplicando pressão sobre a superfície a granel do material em frente ao bocal.
A incorporação reversível de forma livre de hidrogéis suspensos (FRESH) é uma técnica de bioimpressão13,14 que utiliza um material de suporte granular no qual o material extrudado é depositado e fixado no lugar pelo banho de suporte. O banho de suporte dá suporte mecânico para o bioink extrudado e pré-cruzado até o seu crosslinking. A principal vantagem desta técnica é que o banho de suporte permite extruir materiais de baixa viscosidade que não conseguem manter sua forma após a extrusão e antes de cruzar15. Isso expande o pool de materiais disponíveis que podem ser usados como bioinks.
Este artigo apresenta um protocolo para a geração de uma aba vascularizada que combina vasculaturas de microescala e mesoescala. Para isso, redes bioimpressoras, auto-montadas e microvasculares são geradas em hidrogel de coláculato humano recombinante (rhCollMA), que então se conecta ao interior de um andaime vascular maior, implantável e vascular, resultando em um retalho de tecido totalmente projetado16. Para estabelecer a perfusão rápida e direta de tecidos projetados, é necessária uma anastomose microcirúrgica direta aos vasos hospedeiros. O andaime vascular não tem força suficiente de retenção de sutura para ser anastomosado usando sutura tradicional da parede do vaso microcirúrgico. Por isso, descrevemos um método "manguito"17,18,19 para alcançar uma anastomose com artéria femoral comum de um rato. Neste método, as extremidades do vaso são protegidas com suturas circunferenciais, sem a necessidade de perfurar a parede do vaso.
Embora o protocolo proposto tenha sido preparado para estudar vasculatura hierárquica no ambiente rhCollMA, essa abordagem pode ser expandida e aplicada a uma variedade de novas aplicações. O protocolo pode ser aplicado à bioimpressão de várias células específicas do tecido em diferentes bioinks. Além disso, a geometria e o tamanho dos construtos podem ser facilmente modificados para atender a requisitos específicos, como reconstrução de tecidos grandes ou estudos biológicos.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxane</td><td>Biosolve Chemical</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5 "agulhas dispensadoras de ponta romba</td><td>CML fornecem</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>3cc barril de seringa âmbar e conjunto de pistão</td><td>Nordson EFD</td><td>7012085</td><td>seringas âmbar usadas para bloquear a luz e evitar a reticulação prematura</td></tr><tr><td>5-0 AssuCryl PGA sutura absorvente</td><td>Assut Suturas</td><td></td><td>Suturas absorvíveis usadas para fechamento de feridas cutâneas</td></tr><tr><td>6-0 suturas de polipropileno</td><td>Assut Suturas</td><td>9351</td><td></td></tr><tr><td>grampos Acland</td><td>S& T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>Adventitia tesoura</td><td>S& T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de joalheiro nº 3 angular</td><td>S & T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter</td> Advanced <td>Solutions</td><td></td><td>uma bioimpressora 3D de 6 eixos</td></tr><tr><td>Soro de albumina bovina Probumin</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; 82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>Filamento BVOH</td><td>Verbatim</td><td>55903</td><td>um filamento solúvel em água de 1,75 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Braçadeira aplicando pinça</td><td>S & T</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco da polpa dentária</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich bulldog braçadeiras</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (FST)</td> <td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico (Na2HPO4)</td><td>Carlo Erba Reagentes</td><td>480141</td><td></td></tr><tr><td>tesoura de dissecção</td><td>S & T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, nenhum fenol vermelho</td><td>Sartorius</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM mídia + kit de bala</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>substituto de glutamina</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato Anticorpo Cy3</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica&nbsp; 5.000 I.U./mL</td><td>Panpharma-Células</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>microvasculares adiposas humanas</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina humana</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>Uma concentração estoque de 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>uma pasta de suporte de gelatina para bioimpressão FRESH 3D</td></tr><tr><td>Lítio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>Low-glucose DMEM</td><td>Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1,000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anti-SMA anticorpo</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído 4% em PBS</td><td>ChemCruz</td><td>&nbsp; SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina-nistatina</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Poli (óxido de etileno), MW 250.000 a 400.000</td><td>Acros Organics</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>Poli (ácido L-láctico), IV 5,0 dl / g (PLLA)</td> <td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de poliimida, ID: 0.0249", OD: 0.0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>Um tubo de parede fina usado para fabricar manguitos para anastomoses microcirúrgicas</td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2.5 Impressora 3D</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td> <td>uma popular impressora 3D</td></tr><tr><td>comercial Resomer&nbsp; RG 503 H, Poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td> <td>generosamente fornecido pela CollPlant (Rehovot, Israel)</td></tr><tr><td>porta-agulhas de cabo redondo</td><td>S& T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi - #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>tesoura pequena e fina reta</td><td>Ferramentas de Fine Science (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Biosolve Químico</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio dibásico (NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systems</td><td></td><td>CAD software</td></tr><tr><td>Straight no.3 fórceps de joalheiro</td><td>S & T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>Pinça serrilhada reta</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (FST)</td> <td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi cirúrgico nº 15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>Software de fatiamento e design 3D para o BioAssembly Bot</td></tr><tr><td>Vessel dilatador</td><td>S & T</td><td>D-5a.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Tivato 700 microscópio cirúrgico</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3d

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

A engenharia implantável, funcional, tecidos grossos requer a concepção de uma rede vascular hierárquica. Bioimpressão 3D é uma tecnologia usada para criar tecidos adicionando camada sobre camada de biomateriais imprimíveis, bioinks chamados e células de forma ordenada e automática, o que permite criar estruturas altamente complexas que as técnicas tradicionais de engenharia de tecidos não podem alcançar. Assim, a bioimpressão 3D é uma abordagem in vitro atraente para imitar a estrutura complexa da vasculatura nativa, que vai desde vasos milimétricos até redes microvasculares. 
Os avanços na bioimpressão 3D em hidrogéis granulares permitiram a extrusão de alta resolução de bioinks baseados em matriz extracelular de baixa viscosidade. Este trabalho apresenta uma abordagem combinada de bioimpressão 3D e impressão 3D baseada em moldes sacrificiais para a fabricação de retalhos de tecido vascularizado projetado. Bioimpressão 3D de células endoteliais e de suporte usando bioink de colágeno-metacrilato recombinante dentro de um banho de suporte de gelatina é utilizada para a fabricação de uma rede capilar auto-montada. Esta microvasculatura impressa é montada em torno de um andaime poroso de vaso de mesocala, fabricado usando um molde impresso em 3D sacrificial, e é semeado com células endoteliais. 
Esta montagem induz o endotélio do vaso de mesoescala a anastomose com a rede capilar circundante, estabelecendo uma rede vascular hierárquica dentro de uma aba de tecido projetada. A retalho projetada é então implantada diretamente por anastomose cirúrgica em uma artéria femoral de rato usando uma técnica de manguito. Os métodos descritos podem ser expandidos para a fabricação de vários retalhos de tecido vascularizado para uso em estudos de cirurgia de reconstrução e vascularização.

Este protocolo descreve a fabricação de um retalho projetado composto por um andaime vascular (Figura 1Ai) e uma microvasculatura bioimpressora (Figura 1Aii), que foram montadas para alcançar vasculaturas de mesoescala e microescala (Figura 1Aiii). Seguindo o protocolo, foram projetados moldes BVOH do andaime vascular e impressos em 3D (Figura 1B,C). As estruturas impressas obtidas foram inspecionadas visualmente para pequenos fios de BVOH, que podem ser encontrados nos espaços vazios dos moldes (Figura 1D). Estes fios geralmente indicam configurações de material incorretas ou que o BVOH absorveu umidade. Estes fios devem ser removidos, pois podem levar ao enchimento incompleto do molde e defeitos estruturais no andaime vascular resultante. Em seguida, os moldes foram preenchidos com solução PLLA:PLGA, seguidos do processo de secagem congelante e das etapas de lavagem, conforme descrito no protocolo. O andaime vascular PLLA:PLGA obtido foi inspecionado visualmente para verificar a integridade da parede do vaso e a patência de lúmen (Figura 1E).
Um bioink rhCollMA neutralizado a uma concentração de 10 mg/mL foi preparado e combinado em uma razão de 1:1 com a solução PEO:LAP. Células endoteliais microvasculares adiposas humanas rotuladas com Zs-Green1 e células-tronco de polpa dentária foram resuspendidas com o bioink rhCollMA, e a solução foi carregada em um cartucho de impressão e na impressora. As formas da caixa com um canal central com padrão retilinear (Figura 1D) foram bioimpressionadas dentro do banho de suporte à gelatina. Após a impressão, as construções foram cruzadas, e o banho de suporte foi dissolvido e lavado. Após 4 dias de cultura, os construtos foram live-imaged para verificar se há auto-montagem da rede microvascular. A Figura 1D mostra um exemplo de uma rede microvascular HAMEC-ZsGreen1 altamente desenvolvida na construção bioimpressora.
Em seguida, um andaime vascular revestido de fibronectina foi inserido no canal central da construção impressa (Figura 2A). As construções montadas foram cultivadas por 2 dias, durante os quais as células contraem o gel, anexando-o firmemente ao andaime vascular. Em seguida, o andaime vascular foi forrado com HAMECs expressando tdTomato, de acordo com o protocolo. Após 7 dias de cultura, as construções foram fixadas e imagens. A Figura 2B mostra uma visão lateral das construções montadas onde as células endoteliais na microvasculatura bioimpressora são retratadas em verde, enquanto o revestimento endotelial do andaime vascular é retratado em vermelho. A imagem mostra um auto-montagem microvascular verde no gel bioimpresso, enquanto o andaime vascular é forrado com células endoteliais vermelhas. Com maior ampliação, brotos originários do forro endotelial vermelho são vistos brotando e anastomos com a rede microvascular bioimpressora (Figura 2C). Em seguida, as construções foram manchadas para actina muscular α-lisa (SMA) como marcador para as células-tronco da polpa dentária. Após a imunostainagem, os construtos foram imagens usando um microscópio confocal de varredura a laser (Figura 2D).
Por fim, após 7 dias de cultura, os retalhos projetados foram microsurgicamente anastomosados à artéria femoral de um rato, como descrito no protocolo. Um vídeo de um procedimento representativo pode ser visto no Vídeo Suplementar S1. A Figura 2E mostra uma imagem representativa de um anastomos completo antes da remoção do grampo, e a Figura 2F mostra uma imagem representativa do local de anastomoses após a remoção do grampo e hemostasia. Não deve haver sangramento visível antes do fechamento da ferida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg"> Figura 1: Imagens representativas dos vasos meso e microescala fabricados. (A) Visão geral esquemática dos passos do protocolo. Reproduzido com permissão16. (B) Projeto CAD para o molde sacrificial do andaime vascular. (C) Visão lateral de um molde sacrificial impresso em 3D representativo (barra de escala = 0,5 mm). (D) Visão superior do molde sacrificial (barra de escala = 0,5 mm) (E) Andaime vascular representativo fabricado utilizando o protocolo de descrever (barra de escala = 5 mm). (F) Projeto CAD para a rede microvascular 3D bioimpressora rhCollMA. Linhas de grade = 1 mm. (G) Imagem representativa de uma rede vascular bioimpressora altamente desenvolvida mostrando HAMEC-ZsGreen1 em verde. Barra de escala = 200 μm. Abreviaturas: CAD = design auxiliado por computador; rhCollMA = metacrilato de colágeno humano recombinante; HAMEC = células endotelias microvasculares de adiposo humano; PLLA = ácido poli-L-láctico; PLGA = ácido polilático-coglicólico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02v2.jpg"> Figura 2: Imagens representativas do retalho vascularizado montado. (A) Uma fotografia de um conjunto representativo de microvasculatura bioimpressora e do andaime vascular. Barra de escala = 1 mm. (B) Visão lateral de um retalho projetado representativo imagemdo 4 dias após forro endotelial do andaime vascular. A microvasculatura bioimpressora é mostrada em verde (HAMEC-ZsGreen1), enquanto o revestimento endotelial é mostrado em vermelho (HAMEC-tdTomato). Barra de escala = 1 mm. (C) Imagem representativa de anastomoses entre a vasculatura bioimpressora em verde e o forro endotelial em vermelho. Barra de escala = 200 μm. (D) Imagem representativa de imunostaining para actina muscular lisa (vermelho), núcleos (azul) e células endoteliais (verde) após 7 dias de incubação. Barra de escala = 0,1 mm. (E) Imagem representativa de uma anastómosa completa da aba projetada com artéria femoral de um rato antes da remoção do grampo e (F) após a remoção do grampo. Abreviaturas: HAMEC = células endotelias microvasculares adiposasculares humanas; SMA = ato muscular liso; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo suplementar S1: Procedimento microcirúrgico representativo para anastomosar o andaime vascular na artéria femoral de um rato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

Retalhos projetados requerem uma rede vascular funcional incorporada. Neste protocolo, apresentamos um método de fabricação de um retalho de tecido impresso em 3D contendo uma rede vascular hierárquica e suas anastomosas microcirúrgicas diretas para a artéria femoral de rato.

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Nosso protocolo permite que os pesquisadores gerem redes hierárquicas de vasos dentro de um retalho totalmente projetado e implantável, o que abriu caminho para novos estudos sobre o comportamento dos vasos sanguíneos sob integração in vivo. Esta técnica combinou a versatilidade de duas tecnologias de impressão 3D para criar e montar vasos na micro e mesoescala que podem ser diretamente anastomosados com vasos hospedeiros usando microcirurgia. Retalhos vascularizados totalmente projetados podem ser usados para tratar grandes defeitos teciduais, bem como para fornecer uma plataforma para estudar desenvolvimentos teciduais e integração.Os métodos propostos podem ser estendidos para estudar a incorporação de células específicas do tecido, bem como avaliar o uso de diferentes materiais de bioink e suporte. Comece preenchendo o molde BVOH com 30 microliters da solução de polímero. Centrifugar o molde a 100 vezes g por 2 minutos e cubra o molde com mais 20 microliters da solução de polímero para garantir o enchimento completo.Congele os moldes preenchidos a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para garantir que toda a solução de polímero congele. Remova o solvente dos moldes liofilizando-os durante a noite. Para remover o material de molde sacrificial, transfira os moldes após o processo de secagem congelante para um banho de água deionizado de 5 litros sob agitação suave.Substitua a água no banho quando ficar nublado. Quando todo o BVOH se dissolver, seque os andaimes e armazene-os em uma câmara de vácuo até usar. Transfira aproximadamente 4 mililitros do material de suporte preparado e compactado em cada poço de uma placa de 12 poços usando uma pipeta de deslocamento positiva.Toque na placa do poço em uma superfície dura para forçar o material de suporte a se espalhar uniformemente no poço. Prepare uma suspensão contendo 2 milhões de CÉLULAS-TRONCO HAMEC-ZsGreen e 6 milhões de células-tronco de polpa dentária em 10 mililitros de meio de células endoteliais. Centrifugar a suspensão celular a 200 vezes g por 4 minutos para obter uma pelota celular, em seguida, aspirar o meio supernante e resuspencar a pelota celular em 1 mililitro de bioink rhCollMA para obter um bioink com uma concentração celular total de 8 milhões de células por 1 mililitro de bioink.Coloque uma agulha de diâmetro interno de 0,22 milímetros em um cartucho de impressão âmbar de 3 mililitros e coloque o cartucho em um tubo cônico de 50 mililitros. Transfira 1 mililitro da mistura célula-bioink para o cartucho de impressão preenchendo-o do topo usando uma pipeta de deslocamento positiva para reduzir bolhas. Instale o cartucho de impressão na ferramenta apropriada na bioimpressora.Esboce um padrão 2D de um quadrado de 4 milímetros contendo um canal circular de 2 milímetros de diâmetro em seu centro. Extrude o esboço por 4 milímetros para obter um cubo de 4 milímetros com um canal central. Exporte este objeto como um arquivo STL.Importe um modelo STL de placa de 12 poços na guia de modelagem sólida no software de corte de bioimpressora e coloque-o na área designada do leito de impressão virtual. Importe o arquivo STL da forma do cubo na guia de modelagem sólida no software de corte de bioimpressora. Clique na caixa de seleção de cortador externo de uso seguida de configuração de fatiador sob a seção propriedade do objeto.Na janela pop-up, escolha um padrão retilílico para o padrão de preenchimento e digite 30% na densidade de preenchimento, clique em aceitar. Clique no cubo e mova-o usando o mouse para colocar uma cópia da forma do cubo em cada poço virtual desejado. Clique no botão adicionar material na guia de materiais do software de fatiamento de bioimpressora para criar novas configurações de material para bioink rhCollMA.Escolha as configurações do material para impressão. Para pressão, tipo 2 psi, e para velocidade tipo 20 milímetros por segundo nas caixas correspondentes. Atribua os valores de largura e altura da linha à largura da linha a 0,24 milímetros e o valor de aceleração a 400 milímetros por segundo quadrado.Na guia de modelagem sólida, clique no objeto cubo e clique no material rhCollMA da seção material para atribuí-lo à forma do cubo. Na guia biomontagem, clique no botão Enviar Trabalho de Impressão para enviar o trabalho de impressão para o bioimpressor. Carregue o cartucho de impressão carregado com o bioink celular na ferramenta pneumática pneumática ambiente 3 mililitro da bioimpressora à base de extrusão 3D.Clique no botão Esfriar sob a guia Controle de aquecimento ou resfriamento na tela da interface bioimpressora para definir a temperatura da cama de impressão para 4 graus Celsius. Carregue a placa com o banho de suporte na cama da impressora. Na guia Imprimir na tela da interface bioimpressora, clique no trabalho de impressão e clique em Iniciar, seguido por GO para começar o trabalho de impressão.Após a impressão, exponha a placa do poço a uma fonte de luz de 405 nanômetros com uma intensidade de 3 miliwatts por centímetro quadrado por 30 segundos para iniciar o crosslinking do bioink rhCollMA. Após a ligação cruzada, incubar a placa do poço a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos até que todo o banho de suporte derreta. Aspire suavemente o banho de suporte liquefeito e substitua-o pelo meio da célula endotelial.Incubar as construções a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Imediatamente após a remoção do material de suporte da rede microvascular bioimpressora, coloque um andaime vascular PLLA:PLGA revestido de fibronectina ao lado da estrutura bioimpressora. Insira o andaime vascular no canal principal da estrutura bioimpressora.Incubar as construções montadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias. Prepare uma suspensão celular de células endoteliais que expressam tdTomato-expresse adiposas microvasculares microvasculares a uma concentração de 10 milhões de células por mililitro. Coloque uma gotícula de 20 microliter desta suspensão celular em uma superfície hidrofóbica.Coloque suavemente os andaimes vasculares em cima da gota de tal forma que o lúmen do andaime de uma extremidade faça contato com a gotícula celular. Aspire a gota da extremidade oposta do andaime enchendo seu lúmen com a suspensão da célula. Coloque o andaime sentado em um tubo de micro centrífugas e coloque-o em uma rotadora dentro de uma incubadora umidificada por 60 minutos.Por fim, transfira o andaime para uma placa de 12 poços e adicione 2 mililitros de meio de célula endotelial. A visão lateral de um retalho representativo projetado quatro dias após o revestimento endotelial do andaime vascular é mostrado aqui. A microvasculatura bioimpressora é mostrada em verde, enquanto o revestimento endotelial é mostrado em vermelho.A imagem representativa mostra os anastomoses entre a vasculatura bioimpressora e o forro endotelial. Imunostaining para a actina muscular lisa, núcleos e células endoteliais após sete dias de incubação é mostrado aqui. A imagem representativa exibe anastomoses completas da aba projetada com artéria femoral de um rato antes da remoção do grampo e após a remoção do grampo.Esta técnica pode ser usada para estudar o amadurecimento e integração da vasculatura impressa em 3D in vivo e monitorar a perfusão do implante no membro posterior para estabelecer o potencial e a segurança para seu uso para tratar defeitos teciduais.

fabrication-engineered-vascular-flaps-using-3d-printing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Até o momento, os defeitos de tecido espesso são normalmente reconstruídos com a aplicação de retalhos de tecido autólogo ou tecidos projetados. Neste protocolo, apresentamos um novo método de engenharia de retalho de tecido vascularizado com pedículo autólogo, para servir como substituto dos retalhos autólogos.

Projetado retalho do músculo vascularizada

vasos sanguíneos engenharia escaláveis ​​iria melhorar a aplicabilidade clínica. Usando guias impresso-3D facilmente consideráveis, anéis de músculo liso vascular foram criados e empilhados para uma forma tubular, formando um enxerto vascular. Enxertos podem ser dimensionados para atender toda a gama de dimensões das artérias coronárias humanas, simplesmente mudando o tamanho guia impresso-3D.

A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Aqui, apresentamos um protocolo para usar três dimensionais modelos de impressos para planejamento pré-operatório e reorganização intra-operatória de complicado vasculares locais ao manusear uma anomalia congênita da aorta.

Impressão tridimensional de uma anomalia complexa da aorta

Este protocolo descreve a produção de filamento policaprolactona (PCL) com microesferas de (PLA) de ácido polilático incorporado que contêm matrizes decellularized (DM) para impressão 3D estruturais de engenharia de tecidos construções.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

O presente protocolo descreve o modelo de retalho fascio-cutâneo suíno e seu potencial uso na pesquisa de tecidos compostos vascularizados.

Um modelo confiável de retalho fasciocutâneo suíno para estudos de bioengenharia de aloenxertos compostos vascularizados

O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Aprenda a fabricar retalhos vasculares com rede hierárquica usando impressão 3D para engenharia de tecidos. Este método permite anastomose direta com vasos do hospedeiro e estuda o comportamento vascular in vivo em modelo de rato.

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

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