Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma
12 de julho de 2022
O presente protocolo descreve a aquisição remota de dados remotos crio-elétrons de alta resolução usando Tomo5 e processamento de dados subsequente e média de subtomogramas usando a emClarity. A apoferritina é usada como exemplo para ilustrar processos passo a passo detalhados para alcançar uma estrutura crio-ET com resolução de 2,86 Å.
Este protocolo fornece uma rota de fácil acesso ao mundo cada vez mais popular, mas complexo da tomografia crio eletrônica. Seis espécimes celulares podem ser imagens. Instituto em um estado próximo ao estado nativo.
As micromoléculas podem então ser resolvidas em alta resolução em seu ambiente celular nativo usando crow, ET e média de sub átomos. Comece iniciando o software Tomo five do pc servidor TEM. Inicie a sessão configurada ajustando os parâmetros de aquisição de imagem na guia de preparação, em predefinições.
Copie os parâmetros de aquisição de imagens para todas as outras predefinições de alta ampliação. Pressione Set"para definir a exposição ao microscópio e obter as configurações de exposição a todas as outras altas ampliações depois de selecioná-las individualmente. Para coletar um atlas, clique na aba Nova Sessão"na guia Atlas".
Defina as preferências da sessão. Digite o caminho de armazenamento e o formato de saída e pressione aplicar. Selecione Screening"e marque todos os atlases a serem adquiridos.
Selecione Fechar válvulas de chamada"Se o microscópio não for supervisionado, isso fechará as válvulas da coluna. Em seguida, para iniciar a triagem, pressione o botão iniciar. Inspecione os atlas únicos ou vários para obter alvos clicando na grade do painel esquerdo em Configuração de sessão"Em seguida, clique e arraste o mouse para se mover e rolar do meio para ampliar e sair.
Escolha a grade para a configuração de destino. Selecione-o e clique em Amostra de carga", de dentro do software. Para executar a calibração da mudança de imagem, na guia Funções automáticas, ajuste a predefinição para "Eucentric Height"Navegar para auto-eucentric", por inclinação do palco e pressione a partida.
Se o recurso permaneceu centrado durante o direcionamento, pule as calibrações de mudança de imagem. Caso contrário, vá para a guia Preparação para calibrar a mudança de imagem selecione Calibrar o Deslocamento de Imagem" e pressione o início. Isso alinhará ampliações mais baixas ao recurso centrado na ampliação da exposição.
Para a tomografia, inicie uma nova sessão em Configuração de Sessão", para amostras biológicas. Escolha a laje como "como o tipo de amostra e selecione Batch" e "Low Dose" Em seguida, selecione a pasta formato de saída e armazenamento.. Opcionalmente, adicione um destinatário de e-mail e pressione Aplicar"Para configurar os alvos, vá até a seta atlas, encontre uma região de interesse e mova-se selecionando as opções que aparecem com um clique com o mouse direito.
Faça uma imagem geral para confirmar uma boa posição para ajuste de altura eucêntrico. Em seguida, pressione autoeucêntrico"para executar a rotina de inclinação de palco eucêntrica, readquira uma nova imagem de visão geral para atualizar a altura eucêntrica. Inspecione a visão geral quadrada ou o mapa de pesquisa adquirido.
Mude-se para uma região de interesse e a imprensa adquira pesquisa. Em seguida, inspecione a imagem de pesquisa se a região de interesse não estiver centrada, clique com o botão direito do mouse na posição desejada e repita o estágio Move aqui"e adquira imagem. Ajuste as áreas de foco e rastreamento.
Clique à esquerda para arrastar as áreas de rastreamento e foco. Uma vez definidos os parâmetros pressione Adicionar posição"Para executar funções automáticas, verifique as configurações para executar os alinhamentos através da guia Funções Automáticas, navegando o atlas para uma área de carbono. Leve essa área à altura eucêntrica e siga a ordem dos alinhamentos conforme descrito no manuscrito do texto.
Em seguida, inicie a aquisição automatizada da guia de tomografia. Selecione a laje de aquisição de dados e defina os parâmetros desejados. Configure parâmetros de aquisição de dados:etapa de inclinação, ângulo positivo máximo, ângulo negativo máximo, esquema de rastreamento.
Em seguida, selecione Válvulas de coluna fechada"para o esquema de altura eucêntrico. Comece com a preparação de arquivos de entrada e diretórios. Estabeleça uma pasta de projeto sob a pasta Projeto".
Faça outra nova pasta de pilhas fixas e prepare os arquivos de entrada. Tilt série uma inclinação fixa série 1. XF e inclinação série 1.tlt.
Para calcular o desfoco, atualize o arquivo do parâmetro com os parâmetros de microscópio e imagem. Copie um arquivo de parâmetro para a pasta do projeto. Mude seu nome para param_CTF.
M e executar o comando indicado. Em seguida, confira os resultados de estimativas da CTF. Para cada pilha, verifique as pilhas alinhadas usando mod 3D e certifique-se de que as contas fiduciárias sejam apagadas corretamente.
Certifique-se de que a mão está correta executando o comando indicado. Em seguida, verifique o valor do desfoque e certifique-se de que corresponde à estimativa teórica do CTF. Para definir as sub-regiões, gere uma dobra de tomograma.
Na pasta do projeto, execute o comando indicado. Determine os limites escolhendo seis pontos Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin e Zmax, para criar uma sub-região sob a caixa de pasta10, executar o comando indicado. Em seguida, execute a colheita de partículas para cada sub-região.
Para o conjunto de dados de apoferritina, realize uma pesquisa de modelo na bin six. Modifique o ângulo de sublinhar o modelo. Pesquise parâmetros para determinar o ângulo, alcance e intervalos para em plano ou fora da busca de avião em graus.
Na pasta do projeto execute o comando indicado. Remova as partículas incorretas usando mod 3D sob a pasta. Convmap_wedge_Type2_bin6. Execute o comando indicado.
Em seguida, inicialize o projeto. Na pasta de projeto, execute o comando indicado para criar um banco de dados para clareza EM, AppoF.mat. Realize a reconstrução do tomograma antes da média e alinhamento do sub-tomo para gerar tomogramas de sub-região corrigidos pelo CTF na bin4, execute o comando indicado.
Em seguida, para realizar a média e alinhamento do sub tomo, realize a média usando os sub telegramas corrigidos pelo CTF a partir de bin4. Na pasta do projeto, execute o comando indicado. Continue fazendo alinhamentos e execute o comando.
Limpe as partículas sobrepostas executando o comando indicado. Realize a reconstrução final combinando os dois conjuntos de dados de metade. Na pasta do projeto execute os comandos indicados.
Visão geral do fluxo de trabalho da tomografia para a tomografia celular e molecular são mostradas aqui para amostras de celular e lamella, a estratégia de coleta de dados depende em grande parte da amostra e do objetivo do estudo de imagem. Os parâmetros de coleta para vários estudos de CRIO ET são mostrados aqui. Tomogramas representativos de amostras moleculares como apoferritina, processos celulares finos e lamella moída de feixe de íons focalado da espessa amostra celular são mostrados aqui.
A análise estrutural de alta resolução pode ajudar a revelar locais vinculativos para alvos de drogas e tomografia e média sub-tomogral também têm ajudado o desenvolvimento de vacinas contra sars-cov-2.
Visão Geral
Este protocolo descreve etapas detalhadas para a aquisição e processamento remotos de dados de criotomografia eletrônica de alta resolução (crio-ET), utilizando apoferritina como sistema modelo. O fluxo de trabalho alcança uma resolução estrutural de crio-ET de 2,86 Å, demonstrando métodos eficientes desde a coleta de dados até a média de subtomogramas.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Tomografia crioeletrônica
- Biologia estrutural
- Imagem celular
Contexto
- Introdução às técnicas de tomografia eletrônica criogênica.
- Importância da obtenção de imagens de espécimes celulares em seu estado nativo.
- Uso da apoferritina para ilustração metodológica.
Métodos Utilizados
- Aquisição remota de dados com o software Tomo5.
- Metodologias de processamento utilizando emClarity para média de subtomogramas.
- Imagem de alta resolução em sistemas biológicos.
Resultados Principais
- Demonstrar com sucesso a coleta e o processamento de dados de alta resolução.
- Obter imagens detalhadas de apoferritina com resolução significativa.
- Metodologias validadas para estudos futuros de criotomografia eletrônica.
Conclusões
- Este estudo fornece uma abordagem sistemática para imageamento de alta resolução em biologia estrutural.
- As metodologias descritas são relevantes para o avanço da pesquisa em tomografia crioeletrônica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A tomografia crioeletrônica (crio-ET) com coleta remota de dados e média de subtomogramas permite a análise estrutural de macromoléculas em ambientes celulares quase nativos com alta resolução. Essa capacidade é fundamental para a validação de alvos, redução de riscos mecanicistas e aceleração de decisões na descoberta precoce em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico. A integração de fluxos de trabalho remotos robustos garante acesso ininterrupto a infraestruturas avançadas de imagem, apoiando a continuidade da carteira de projetos e a colaboração entre diferentes locais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a visualização direta de complexos moleculares in situ, apoiando a validação funcional de alvos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao revelar conformações e interações nativas.
- Aprimora a confiança preditiva para o engajamento de alvos e a investigação de vias.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece modelos estruturais validados para o desenvolvimento de ensaios subsequentes.
- Permite saídas de imagem reprodutíveis e quantitativas prontas para triagem.
- Permite a padronização da preparação de amostras e dos parâmetros de imagem em diferentes projetos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a imagem de alta resolução com sistemas relevantes para doenças na descoberta translacional de biomarcadores.
- Garante a continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, mantendo a fidelidade estrutural no estado nativo.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em informações estruturais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho remoto de criotomografia de elétrons conecta a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a pesquisa pré-clínica, fornecendo dados estruturais quantitativos de alta resolução acessíveis de qualquer localização.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da visualização molecular direta.
- Triagem: Fornece resultados de imagem quantitativos e reprodutíveis para a padronização de ensaios.
- Análises: Permite a medição robusta de parâmetros estruturais e a comparação estatística entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade estrutural para o alinhamento de biomarcadores e modelagem de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de imagem escalável com acesso remoto para suporte a múltiplos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem e permite a coleta de dados remota e escalável.
- Valor Estratégico: Apoia decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e a gestão eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco e decisões de avanço multifuncionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em instrumentação de criomicroscopia eletrônica e software de análise de dados (Tomo5, emClarity).
- Exige infraestrutura de TI robusta para acesso remoto e armazenamento de dados.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de aquisição de imagens e análise.
- A adaptação a diferentes tipos de amostras pode exigir otimização do protocolo.
- As limitações práticas incluem espessura da amostra, produtividade da aquisição de imagens e recursos computacionais.
