Name: Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro de camundongos adultos. Este método permite analisar ativação, proliferação e diferenciação celular in vivo para estudos em neurociência.

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<p class="jove_content">Os autores desejam agradecer à Dra. Diana Carlone (Hospital Infantil de Boston, Harvard Medical School) e Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Instituto de Pesquisa do Centro Médico do Maine) para orientação utilizando animais mTert-rtTA.</p>

<p class="jove_content">Os autores não têm nada a revelar.</p>

<p class="jove_content">Um método para a criação, utilização e análise de uma linhagem transgênica tripla traçando células-tronco de marcação de camundongos dentro do cérebro de camundongo adulto <em>in vivo</em> é descrito. Quando combinado com imunostaining ou limpeza cerebral, a identificação e caracterização de células fluorescentes rastreadas em todo o cérebro podem ser realizadas. Esta técnica oferece a capacidade de entender o potencial plástico/regenerativo/remodelação das células-tronco rotuladas à medida que ativam, migram, diferencia...

<table><tbody><tr><td>Diluente de anticorpos</td><td>Agilent</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval Solution</td><td>Anticorpo</td> anti-GFP <td>Agilent S2367</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>A2311</td><td>Use a 1:500-1:000</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:Solução de bloqueio de 007676</td><td></td></tr><tr><td>(IHC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Agulha romba</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueio cerebral coronal</td><td>Braintree</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>Éter dibenzílico</td><td>Millipore Sigma</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina Hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sal de Sódio da Mucosa Suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Molecular Biology Fixador de Tecido</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>Este produto já foi descontinuado, mas pode ser substituído por Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td></tr><tr><td>Solução de Peróxido de Hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHC Select TBS Tampão de Enxágue</td><td>Millipore Sigma</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Westward</td><td>0143-95095-10</td><td>Este produto requer uma licença DEA para armazenamento e uso.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Milipore Block</td><td>Millipore</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Millipore Sigma</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Temperatura de Corte Ótima</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS Solução (10X)</td> <td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueio cerebral sagital</td><td>Braintree</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>Braun</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sudão (Typogen) Black</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>186562</tr><tr><td>Cartucho de tecido</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Millipore Sigma</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

<p class="jove_content" fo:break-after="page">Uma linhagem reversa de transcriptase (Tert) foi desenvolvida para investigar o comportamento e o destino das células-tronco de tecido adulto, cruzando o sistema 'Tet-On' oTet-Cre mouse com um novo transactivador de tetraciclina reversa (rtTA) transgene ligado ao promotor tert, que demonstramos uma nova população de células-tronco cerebrais adultas. Aqui, a administração da doxiciclina derivada de tetraciclina para mTert-rtTA::oTet-Cre marcará indelévelmente uma população de células que expressam um fragmento de 4,4 kb da região promotora do gene Tert. Quando combinados o repórter Rosa-mTmG, mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratos expressarão membrana tdTomato (mTomato) até que o tratamento da doxiciclina induz a substituição da expressão mTomato por membrana EGFP (mGFP) em células que também expressam Tert. Portanto, quando esses camundongos de rastreamento de linhagem tripla-transgênica recebem doxiciclina (o período de "pulso" durante o qual as células expressas tert são marcadas), essas células se tornarão indelibavelmente marcadas células mGFP+, que podem ser rastreadas por qualquer quantidade desejável de tempo após a remoção da doxiciclina (o período de "perseguição"), mesmo que a expressão tert seja posteriormente perdida. Os cérebros são então fixos e processados por imunofluorescência e outras aplicações a jusante, a fim de interpretar mudanças na ativação de células-tronco, proliferação, compromisso de linhagem, migração para vários nichos cerebrais e diferenciação para tipos de células maduras. Usando este sistema, qualquer mouse rtTA pode ser acoplado a oTet-Cre e um repórter Rosa para conduzir experimentos de rastreamento de linhagem "pulse-chase" indutíveis de doxiciclina usando marcadores de células-tronco.</p>

<p class="jove_content">Embora o sinal fluorescente resultante de um sistema Tet-On com um repórter fluorescente varie dependendo do promotor de interesse e fluoróforo(s) usado, descreveremos como os achados foram analisados com animais mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG animais. A análise dos cérebros adultos após uma perseguição de pulso resultou em células expressas por GFP de membrana em vários nichos anatômicos. Deve-se notar a diferença na intensidade fluorescente entre vários tipos de células. Uma variável em relação à intensidade fluoresc...

<p class="jove_content">A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação <em>in vivo</em>. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.</p>

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

<p>A marcação de células-tronco e sua descendência com uma linhagem transgênica indutível traçando linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação de células-tronco adultas no cérebro in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta às intervenções e a multi potência. As vantagens das abordagens de rastreamento de linhagem transgênica incluem especificidade de traçar uma determinada linhagem celular, expressão indelével da proteína fluorescente, independentemente da rotatividade celular ou diferenciação, baixa toxicidade da doxicyline, ativação condicional e facilidade de uso com ensaios comuns a jusante sobre tecidos de traço de linhagem, incluindo imunostaining e imunofluorescência.</p><p>Devido à ampla implicação da plasticidade e das células no cérebro adulto, a caracterização e análise das células-tronco adultas ajudarão a informar sobre o estudo de doenças neurodegenerativas, impactos metabólicos na plasticidade cerebral, envelhecimento e outras condições relacionadas. Para começar, deslizes quentes para temperatura ambiente e pós-fixação com acetona gelada p</p>

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Neurociência

Genética induzível Destino Mapping (GIFM) marcas e faixas de células com o controle espacial e temporal...

Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células<em> In Vivo</em

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Este vídeo demonstra o procedimento para colorir células-tronco neurais recém-proliferadas em seções de tecido cerebral usando incorporação de EdU, seguida de imunofluorescência para visualizar proteínas específicas, melhorando a compreensão da dinâmica e proliferação celular.

Coloração por imunofluorescência para visualização de células-tronco neurais proliferadas em seções cerebrais de camundongos

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagens ao vivo seguidas de rastreamento de célula única para monitorar a biologia celular e a progressão da linhagem de várias populações neurais. J. Vis. exp. (2017) O O vídeo demonstra o processo de preparação, imagem e rastreamento de células-tronco neurais adultas em tempo real para estudar comportamentos celulares, incluindo divisão e diferenciação.

 Imagens ao vivo e rastreamento de célula única para monitorar a linhagem neural em células-tronco neurais adultas

Fonte: Daynac, M., et. al. Classificação celular de células-tronco neurais e progenitoras da zona subventricular de camundongos adultos e imagens ao vivo de sua dinâmica do ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de células-tronco neurais (NSCs) de um cérebro de camundongo transgênico usando um microscópio confocal de varredura a laser. Os NSCs fluorescem em vermelho durante a fase G1 e não são fluorescentes em outras fases do ciclo celular. Uma cultura...

Imagem de lapso de tempo da divisão de células-tronco neurais de camundongo usando microscopia confocal

Relatamos um método baseado em Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) para isolar células-tronco neurais (NSCs) e sua progênie da zona subventricular (SVZ) do cérebro de camundongos adultos. Aplicado a camundongos transgênicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite o estudo da progressão do ciclo celular por imagens ao vivo.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Neste artigo, descrevemos os princípios para projetar e realizar um experimento de rastreamento de linhagem multicolorido usando camundongos R26R-Confetti. Fornecemos um protocolo específico para rastreamento de células epiteliais da córnea que podem ser modificadas para outros tecidos de interesse.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

É descrito um protocolo robusto para monitorar as populações neurais por vídeo-microscopia de lapso de tempo seguido baseado em software de pós-processamento. Este método representa uma ferramenta poderosa para identificar os eventos biológicos em uma população selecionada durante as experiências de imagens ao vivo.

Viver a imagem, seguida por uma única célula de rastreamento para biologia celular de Monitor e a progressão da linhagem de várias populações neurais

Um protocolo para realizar o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos em um único nível celular usando a análise de mosaico com marcadores duplos (MADM). A análise clonal madm fornece uma estrutura quantitativa para medir o comportamento proliferativo, a saída celular e a relação de linhagem de progenitores individuais e suas células filhas.

Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro de camundongos adultos. Este método permite analisar ativação, proliferação e diferenciação celular in vivo para estudos em neurociência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

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