Name: Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Aprenda um ensaio qualitativo para adesão e invasão em ágar em Saccharomyces cerevisiae. Este método avalia fenótipos invasivos e diferenciação pseudohifal em leveduras.

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Gostaríamos de agradecer a Lisa Schneper e Katrin Duevel de suas idéias no desenvolvimento deste ensaio.

<ol><li> Colocar 200ul de culturas de interesse crescente em placas sintéticas mídia com as condições necessárias a fome (SC com glicose 2% versus SC com glicose 0,2%, por exemplo) Se a densidade de culturas são muito diferentes um do outro, ajustar a contagem de células por cultura 200ul de modo que cada gota tem aproximadamente a mesma quantidade de células. </li><li> Certifique-se manter registros de que queda nas placas é que a cultura. </li><li> Mantenha a tampa entreaberta prato e deixe em temperatura ambiente ou a 30 ° C até gotas estão secos. </li><li> Placas de vedação com parafilme e filme plástico (opcional) e deixar em 30 ° C por 3-7 dias. </li><li> Documentar o crescimento de células em placas (por leitura óptica, tirar uma foto digital, etc) </li><li> Lave as células fora da superfície do ágar com água de alta pressão (de preferência água DI) para cerca de um minuto tendo o cuidado para o agar para não levantar e mudar a orientação. </li><li> Se livrar do excesso de água batendo placas em toalhas de papel e deixá-las abertas para secar. </li><li> Uma vez que as placas são secas documento de adesão em cada prato (por digitalização ou tirando fotos digitais) </li><li> Células com um dedo enluvado, esfregue delicadamente off formam a superfície do ágar em água corrente por aproximadamente um minuto. </li><li> Seca as placas como antes. </li><li> Se estiver usando um escopo de dissecação, remover a agulha antes de colocar placas para a plataforma do microscópio. </li><li> Invasão documento com ampliação de 10x ou 40x. Certifique-se de se concentrar na parte do meio de cada círculo, para as bordas serão muito lotado para ver morfologias de células individuais. As bordas podem indicar o nível de crescimento filamentoso e pode ser documentada para referência futura. Digitalização ou tirar uma foto digital de toda a placa também pode ser útil. </li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
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<li>Pan, X., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-dependent+protein+kinase+regulates+pseudohyphal+differentiation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).</li>
<li>Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+a+single+MAP+kinase+cascade+in+Saccharomyces+cerevisiae+mediate+two+developmental+programs+in+the+same+cell+type%3A+mating+and+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth.</a> Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).</li>
<li>Robertson, L. S., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+yeast+A+kinases+have+specific+signaling+functions+in+pseudohyphal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).</li>
<li>Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mat+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+requires+nutrient+and+pH+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients.</a> Eukaryot Cell. , (2007).</li>
</ol>

Células de levedura mostrar modos diversos de diferenciação de acordo com a disponibilidade de nutrientes e condições ambientais, incluindo a formação de esporos sob condições de estresse de fome e, filamentação sob várias tensões de nutrientes e floculação. Diversas leveduras, incluindo S. cerevisiae e C. albicans, também podem ser encontradas em biofilmes formados por um conjunto diversificado de microorganismos. Embora haja alguma correlação com filamentação e comportamento invasivo, não está claro exatamente como filamentação pode causa...

<table><tbody><tr><td>Moticam 350</td><td>Câmera</td><td>Motic</td><td>descontinuado (novo modelo: Moticam 352)</td><td>Uma câmera relativamente barata que se conecta às oculares de microscópios e captura imagens digitais para PC ou Mac.</td></tr></tbody></table>

ensaio para a adesão e invasão agar em s. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Leveduras são encontradas em biofilmes naturais, onde muitos microrganismos colonizam superfícies. Em ambientes artificiais, tais como superfícies de objetos feitos pelo homem, os biofilmes podem reduzir a produtividade industrial, destruir estruturas, e ameaçam a vida humana. 1-3 Por outro lado, aproveitando o poder de biofilmes pode ajudar a limpar o meio ambiente e geração de energia sustentável. 08/04 A capacidade de S. cerevisiae para colonizar superfícies e participar em biofilmes complexo foi ignorada na maior parte, até a redescoberta dos programas de diferenciação desencadeada por várias vias de sinalização e sugestões ambientais a este organismo. 9, 10 O interesse de continuar no uso de S. cerevisiae como organismo modelo para entender a interação e convergência das vias de sinalização, como o Ras-PKA, Kss1 MAPK e Hog1 vias de osmolaridade, rapidamente colocado S. cerevisiae na junção de biofilme biologia e da pesquisa de transdução de sinal. 20/11 Para este fim, a diferenciação de células de levedura em longas e adesivo, filamentos pseudohyphal tornou-se uma leitura conveniente para a ativação de vias de transdução de sinal em várias mudanças ambientais. No entanto, filamentação é uma coleção de fenótipos complexos, o que faz a dosagem para ele como se fosse um fenótipo simples enganosa. Na última década, vários ensaios foram adotados com sucesso a partir de estudos biofilme bacteriano para a pesquisa de leveduras, tais como ensaios MAT formação para medida de dispersão colônia em agar suave e coloração violeta cristal para medir quantitativamente a adesão da superfície celular. 12, 21 No entanto, tem havido alguma confusão em ensaios desenvolvidos para avaliar qualitativamente os fenótipos adesiva e invasiva de leveduras em ágar. Aqui, apresentamos um método simples e confiável para avaliar a qualidade adesiva e invasiva de cepas de leveduras com fácil de compreender as etapas para isolar a avaliação de adesão da avaliação invasão. Nosso método, adotado a partir de estudos anteriores, 10, 16 envolve células que crescem em meios líquidos e revestimento em condições diferenciais de nutrientes para o crescimento de grandes manchas, que em seguida, lave com água para avaliar a adesão e esfregar as células completamente fora da superfície do ágar para avaliar a invasão em o ágar. Nós eliminamos a necessidade de estrias células em ágar, o que afeta a invasão de células no agar. Em geral, observamos que as cepas haplóides que invadem agar são sempre cola, mas não todas as estirpes adesivo pode invadir o ágar. Nossa abordagem pode ser usada em conjunto com outros ensaios a dissecar cuidadosamente os passos e requisitos de diferenciação de transdução de sinal de levedura, diferenciação, quorum sensing, e formação de biofilme.

Nós descrevemos um ensaio qualitativo para a adesão e invasão de levedura ágar como uma medida de diferenciação invasivo e pseudohyphal. Este ensaio simples pode ser usado para avaliar o fenótipo invasivo de mutantes diversas, bem como as pistas efeitos ambientais e vias de sinalização na diferenciação de levedura.

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

As leveduras são encontradas em biofilmes naturais, nos quais muitos microrganismos colonizam superfícies. Em ambientes artificiais, como em superfícies de objetos fabricados pelo homem, ...

Retire 200 microlitros da sua cultura de interesse e simplesmente faça um objetivo. Normalmente consigo acomodar até seis em uma placa de microtitulação, se desejar, e então a deixo aberta para secar. E estas são duas placas.Um deles tem mofo, mas está bom porque não afeta nosso experimento. E um deles está completo, um deles está em meio com baixa concentração de glicose. Então, vamos analisar a adesão e a invasão e verificar se há alguma diferença.Então, basta retirar a placa assim. E você pode ver o material crescendo. Vou fazer a lavagem.Você pode ver as bolhas sob a alça, e isso acontece porque a água passou para baixo da alça, o que é normal, mas apenas para que a alça não escorregue para fora da placa. Portanto, eu diria que, embora algumas células tenham se soltado, ambas as cepas são adesivas. As células estão aderindo a outras células que, possivelmente, estão aderindo ao ágar.Caso contrário, muitas das células se soltariam, mas elas não se soltaram. Então, agora que documentamos a adesão, vamos documentar a invasão. Vou esfregar suavemente as células da superfície, na medida em que elas se soltarem.Não estou exercendo nenhuma pressão, mas estou tentando remover qualquer coisa que saia da outra superfície. E você verá, sentirá seu dedo esbarrando onde está a camada. Estou tentando secá-la. Conseguimos ver a diferença aqui?Você não pode, o que é bom porque este é um placa completa e, portanto, eles não estão passando fome por nada. E esta é uma placa com baixa concentração de glicose e eles estão passando fome por glicose. Assim, você observa uma diferença.Portanto, esse é um bom controle.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Um protocolo geral para o estudo da invasão das células do hospedeiro por um agente patogénico, com foco...

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Este protocolo é um ensaio de adesão bacteriana simples que consiste na contagem do número de unidades formadoras de colônia de bactérias que são aderidos em células em cultura. O ensaio é robusto, independente da adesina estudado, e inúmeras variações são usadas na maioria dos laboratórios que trabalham com patogênese bacteriana.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

Este vídeo ilustra o início da formação de biofilme polimicrobiano em células infectadas por vírus por bactérias e fungos. A infecção pelo vírus herpes simplex impede a ligação bacteriana às células, impedindo a co-localização bacteriano-fúngica. Em contraste, as células não infectadas exibem co-localização bacteriano-fúngica e início da formação de biofilme.

Um ensaio para determinar a iniciação do biofilme polimicrobiano em células infectadas por vírus

Aqui apresentamos um método econômico para definir interações químico-genéticas em leveduras em brotamento. A abordagem é construída sobre técnicas fundamentais em biologia molecular de leveduras e é adequada para o interrogatório mecanicista de pequenas e médias coleções de produtos químicos e outros ambientes de mídia.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este artigo descreve um ensaio baseado no crescimento de leveduras para a determinação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Ele também demonstra um método para extração rápida de proteínas de levedura, adequado para western blotting para confirmar bioquimicamente os requisitos de degradação. Essas técnicas podem ser adaptadas para monitorar a degradação de uma variedade de proteínas.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer

Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

Aqui, apresentamos um protocolo para o exame da infecção oral por Candida em pacientes com síndrome de Sjögren primária, que pode ser usado para tratamento oportuno e, posteriormente, evitando complicações relacionadas.

Exame de Infecção Oral por Candida em Pacientes com Síndrome de Sjögren Primária

Aprenda um ensaio qualitativo para adesão e invasão em ágar em Saccharomyces cerevisiae. Este método avalia fenótipos invasivos e diferenciação pseudohifal em leveduras.

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

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