Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro

Nosso método permite medir a propensão à calcificação de amostras de pacientes usando células musculares lisas vasculares humanas. Isso ajudará a impulsionar a pesquisa sobre distúrbios de calcificação vascular, auxiliando no desenvolvimento de novas terapias. Esta técnica utiliza uma deteção baseada em fluorescentes, que aumenta a sensibilidade e permite medir amostras ao longo do tempo, reduzindo assim a necessidade de replicações e aumentando a robustez.

Para começar, cultive células musculares lisas vasculares humanas em frascos de cultura de células não revestidas a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Divida as células ao atingir 70 a 90% de confluência. Para dividir, lave os HVSMCs duas vezes com PBS.

Adicione tripsina e incube por 2 a 5 minutos a 37 graus Celsius. Inibir a reação de tripsina adicionando um meio contendo soro. Centrifugar as células durante 4 minutos a 350 RCF e ressuspender o pellet num meio de manutenção.

Depois de preparar as células para uma divisão, conforme demonstrado, conte e semeie as células em uma placa de 48 poços para iniciar o experimento de calcificação. Após a incubação durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%, lave suavemente as células duas vezes com PBS, aspirando cuidadosamente todos os PBS restantes após a segunda lavagem. Adicione suavemente o meio de calcificação e incube ainda a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%.

Verifique diariamente com um microscópio de luz até que ocorra a calcificação. Para detectar a calcificação por meio de imagens, abra o software e selecione Protocolos e Criar Novo. Selecione Procedimento e clique em Definir temperatura.

Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o gradiente para 1 grau Celsius na janela pop-up e clique em OK. Selecione o tipo de prato de escolha no menu suspenso. Adicione a etapa de criação de imagens clicando em Imagem. Selecione o Gerador de imagens invertido e clique em OK. Adicione três canais de imagem e defina-os como DAPI, RFP e Bright Field.

Marque a caixa Montagem e defina o número e a localização desejados das imagens. Altere a Sobreposição para representar uma melhor cobertura de cada poço. Selecione quais poços devem ser fotografados.

Uma nova janela será aberta onde os poços de interesse podem ser selecionados. Clique em Opções de Foco para definir o modo de foco. Uma nova janela será aberta.

Defina cada canal individualmente. Comumente, os poços são focados automaticamente no canal DAPI. Defina todos os outros canais como Altura focal fixa a partir do primeiro canal e defina clicando em OK. Feche a janela.

Inicie as etapas de redução de dados de predefinição clicando em Redução de Dados e selecione Pré-processamento de Imagem. Aceite as configurações padrão selecionando OK. Configure uma etapa para contar as células selecionando Análise Celular. Selecione TsF DAPI Images no menu suspenso do canal.

Defina mais detalhes após a realização da imagem. Prepare a análise do sinal RFP selecionando Estatísticas na janela pop-up Label step e selecione TsF RFP como o canal de entrada. Marque as caixas Valor Superior e Valor Inferior.

Marque a caixa Área Total na lista inferior. Selecione Nenhum na coluna Efeito de Cor. Na janela pop-up, clique em Personalizado e marque a caixa Plano de fundo.

Pressione OK. Para uma leitura justa, normalize o sinal de RFP por célula pressionando Ratio no lado esquerdo. Na janela pop-up, selecione Área Total de Quantificação de RFP. Para Entrada de Dados 1, no menu suspenso e selecione Contagem de Células como Entrada de Dados 2.

Por fim, selecione um Novo Nome do Conjunto de Dados e pressione OK duas vezes. Selecione Efeito de cor, conforme demonstrado anteriormente, e clique em OK.In canto superior esquerdo, selecione Arquivo e salve o arquivo como um tipo de arquivo Protocolo. Registre as observações para cada ponto de tempo após a primeira instância de calcificação ocorrer.

Pressione Read Now no software de inicialização e clique em Protocolo Existente. Selecione o protocolo criado na etapa anterior. O programa solicitará para salvar o experimento.

Isso pode ser feito nesta fase ou posteriormente manualmente, clicando no botão Salvar no canto superior esquerdo. Uma janela pop-up pedirá para aguardar o aquecimento do sistema. Ligue o controlador de gás dióxido de carbono e defina-o para 5%Uma vez que o sistema tenha atingido a temperatura definida, um prompt aparecerá para inserir uma placa e ler.

Pressione Cancelar. Transporte a placa da incubadora para o gerador de imagens em um cofre para evitar quebra e derramamento e esteja de acordo com os regulamentos locais de biossegurança para o transporte de células vivas em caso de acidente. Coloque a placa no leitor de placas.

Clique em Procedimento. Na janela pop-up, selecione Etapa de criação de imagens predefinida. Ajuste o foco e a exposição no canal DAPI primeiro.

Desmarque a caixa Exposição automática em todos os canais e clique no ícone do microscópio ao lado do canal DAPI. Uma nova janela será aberta. Selecione o poço para direcionar o foco.

Se um sinal já estiver visível, primeiro, clique em Foco Automático e, em seguida, em Exposição Automática. Caso contrário, primeiro, aumente a exposição e repita o foco automático e a exposição automática. A exposição pode ser ajustada manualmente selecionando o menu suspenso Exposição.

Verifique as configurações em vários poços e, em seguida, salve as configurações. Ajuste a exposição da mesma maneira para todos os canais. Para o canal RFP, certifique-se de começar com um poço com calcificação média a alta.

Feche a janela de procedimento e selecione o botão verde Ler Agora na barra de tarefas superior. Salve o experimento conforme indicado pelo software. Repita esse processo para cada ponto de tempo.

Enquanto o sistema lê a placa, todas as imagens são processadas automaticamente em segundo plano. Ajuste as configurações para contagem de células selecionando imagens DAPI TsF a serem exibidas. Selecione o poço de escolha clicando duas vezes.

Uma nova janela aparecerá. Selecione uma das imagens. Selecione a guia Análise na janela pop-up.

Selecione Contagem de células de análise celular e clique em OK. Desmarque os canais RFP e Bright Field. Marque a caixa Realçar Objetos. Clique em Opções para abrir o menu.

Ajuste o Limite de Tamanho e Intensidade para incluir todos os núcleos, mas exclua detritos e clique em OK. Clique em Aplicar alterações no canto inferior esquerdo para aplicar as configurações a todas as imagens. Da mesma forma, selecione uma imagem bem final com uma quantidade média a alta de calcificação. Para ajustar melhor a relação sinal-ruído, clique na guia Análise no menu Tarefa.

Selecione Estatísticas da imagem. Desmarque o canal DAPI e Campo brilhante. Clique em Opções para abrir o menu.

Marque a caixa Limites atípicos. Para definir o valor de limite não subjetivo para o sinal acima do plano de fundo, selecione a ferramenta Linha na barra de tarefas. Uma janela aparecerá.

Desenhe uma linha através de um patch de sinal, incluindo uma área do fundo. Ajuste os limiares superiores e inferiores. Conte apenas o sinal acima do plano de fundo e exclua se houver detritos ou artefatos.

Clique em OK e aplique as alterações para transferir as configurações para todos os outros poços. Confirme se o limite está selecionado com precisão nos outros poços. Depois que a contagem de células e os limites de RFP estiverem definidos, exporte os dados.

Clique no botão Excel ao lado do menu suspenso para exportar os dados diretamente para uma planilha. Diferentes estágios de calcificação variando de baixo a alto foram detectados e analisados. A calcificação foi detectada como manchas pretas usando microscopia de luz, que foram úteis para avaliação primária e determinação de quando iniciar a imagem.

Para uma melhor relação sinal-ruído, as imagens RFP processadas foram analisadas para quantificar a calcificação. Os dados foram obtidos comparando-se duas ou mais condições ao mesmo tempo. Os dados foram normalizados para contagem celular como área de calcificação por célula.

Os dados também foram descritos como uma série temporal mostrando a mesma condição em vários pontos de tempo. É importante que os resultados após a redução e análise dos dados ainda reflitam o que se pode ver antes da transformação e do limiar da imagem.