Name: Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a preparar complexos nucleossômicos com fatores de reparo de DNA para estudos estruturais por crio-microscopia eletrônica. Este protocolo otimizado utiliza equipamentos laboratoriais padrão.

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Agradecemos ao Dr. Mario Borgnia do núcleo de crio-EM do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental e ao Dr. Joshua Strauss da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill por sua orientação e treinamento na preparação da grade crio-EM. Agradecemos também à Dra. Juliana Mello Da Fonseca Rezende pela assistência técnica nas etapas iniciais deste projeto. Agradecemos a contribuição e o apoio fundamentais do falecido Dr. Samuel H. Wilson e seus membros do laboratório, especialmente o Dr. Rajendra Prasad e o Dr. Joonas Jamsen para a purificação do complexo APE1-Polβ geneticamente fundido. A pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [números de bolsa Z01ES050158, Z01ES050159 e K99ES031662-01].

1. Montar partículas centrais do nucleossomo através da diálise de sal gardient
NOTA: A preparação de partículas centrais de nucleossomos utilizando proteínas de histonas recombinantes para estudos estruturais tem sido extensivamente descrita em detalhes por outros14,15,16. Seguir a purificação das histonas recombinantes de X. laevis e do conjunto de octâmeros de histonas descrito por outros14,15 e montar o substrato nucleossomal conforme descrito a seguir.
<ol><li>Compre três oligonucleotídeos (listados na Tabela 1) na escala indicada: UND-197mer, 161mer, 35mer.<ol><li>PAGE purificar ultrameros (197mer e 161mer) como descrito17.<ol><li>Quantidades equimolares reanneais de oligonucleotídeos em tampão anesador 1x (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM). Por exemplo, misturar 40 μL de 161-mer [166,7 μM]; 8 μL de 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL da fita comp 197-mer [408,2 μM]; 10 μL de tampão anelado 10x e 10,9 μL de dH2O. NOTA: É fundamental controlar a reação de recozimento com um gradiente de temperatura. Consulte a Tabela 2 para obter detalhes sobre o gradiente de temperatura.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Realizar reconstituições em pequena escala (escala por um fator de 1/57 do exemplo mostrado abaixo para um volume final de 50 μL) para determinar a razão entre DNA e octâmero de histona (as razões iniciais típicas de DNA:octamero são as seguintes: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; mostrado na Figura 2A); É fundamental determinar essa razão empiricamente com reconstituições em pequena escala.<ol><li>Depois que essa proporção for determinada, prepare uma reconstituição em larga escala. Por exemplo, misturar 32,9 μL de DNA-197 pb [99,4 μM]; 1647,1 μL de TE (1x); 1120 μL de NaCl 5 M e 62,3 μL de octâmero de histona WT [2,56 μM].</li>
	</ol></li>
	<li>Fazer buffers de diálise: RBbaixo e RBalto conforme descrito na Tabela 3 e Tabela 4, respectivamente; configurar as reconstituições conforme descrito anteriormente14.<ol><li>Transfira o tubo de diálise para o copo contendo RBalto e permita que a diálise prossiga, com agitação suave, por 16 h ou até que 2 L RBbaixo tenham sido transferidos para o copo de resíduos.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira o tubo de diálise para um copo de 1 L contendo tampão RB50mM (Tabela 5) e deixe a amostra dialisar por pelo menos 3 h ou durante a noite.<ol><li>Avaliar a eficiência da reconstituição em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6%, garantindo que haja menos de 10% de DNA livre e uma única banda NCP; armazenar PCN a 4 °C. Consulte a Figura 2A (faixa 5) e a Figura 2B para obter resultados representativos da reconstituição ótima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparar o complexo de fatores de reparo NCP-DNA (NCP-DRF)
<ol><li>Purificação por eletroforese em gel preparativo NOTA: Este método é o mais trabalhoso (dos dois descritos), e embora seja eficaz na remoção de espécies de alto peso molecular (HMW) (Figura 6A) devido ao alto fator de diluição, pode levar a alguma desmontagem, como mostrado em Figura 7A (NCP prep cell out lane), liberando DNA. No entanto, até 25% de DNA livre ainda é compatível com estudos de crio-EM. Devido à alta diluição, use este método para purificar apenas o NCP, em vez de todo o complexo.<ol><li>Preparar 70 mL de solução de gel de poliacrilamida não desnaturante a 6% em 0,2x TBE, usando solução de gel de poliacrilamida 37,5:1, acrilamida:bisacrilamida. Despeje um gel cilíndrico com raio externo de 28 mm e polimerize durante a noite.</li>
		<li>Montar o aparelho de corrida em gel preparativo, utilizando uma membrana de diálise com ponto de corte de 6-8 kDa MW. Use 0,25x TBE como buffer de execução e 1x buffer de eluição (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pré-executar o gel cilíndrico a uma constante de 12 W por 1 h e coletar frações que executam a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de aproximadamente 1 mL/min. NOTA: Se um detector UV não estiver disponível para identificar frações contendo DNA, um experimento de triagem com 32P-NCP pode ser realizado para identificar as frações de interesse. Mantendo todas as condições iguais, os PCNs não rotulados podem ser purificados sem um detector UV.</li>
		<li>Concentrar os 2,8 mL de NCP para 250 μL usando um filtro centrífugo (ponto de corte de MW 30 kDa) e carregar no gel preparativo e eletroforese por um total de 6 h. Às 2 h, quando o xileno cianol tiver esgotado o gel, comece a coletar frações de 1,5 mL. NOTA: Às 2,5 h, as frações estarão livres de xileno cianol; o DNA (197mer) elui em aproximadamente 3-3,5 h, e espera-se que o NCP elute na marca de 4,5-5 h.</li>
		<li>Analise frações de interesse em um gel de poliacrilamida não desnaturante a 6%. Agrupar frações contendo o NCP, e imediatamente concentrar com um filtro centrífugo (ponto de corte de MW 30 kDa) para 1 mg/mL. No dia seguinte, avaliar a qualidade do NCP em gel não desnaturante de poliacrilamida a 6% antes de complexar com o fator de reparo de DNA (DRF) de interesse.</li>
		<li>Incubar o NCP e o DRF de interesse no gelo por 15 min usando um tampão ótimo para o complexo específico. Por exemplo, misturar 1.000 μL de NCP [1,2 μM]; 260 μL de tampão de ligação 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL de 3 M KCl e 18 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM]. NOTA: A temperatura e a força iônica em que o complexo é feito podem precisar de otimização para diferentes complexos.</li>
		<li>Adicionar glutaraldeído (recém-aberto; grau EM) para uma concentração final de 0,005%. Portanto, a esta reação, adicionar 26,8 μL de glutaraldeído a 0,25% com 13,2 μL de dH2O. Misture bem e incube à temperatura ambiente por 13 min.</li>
		<li>Têmpera com Tris-Cl 1 M, pH 7,5, até uma concentração final de 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentre até ~50 μL e troque o tampão por 1x tampão de congelamento: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 usando uma coluna de dessalinização. CUIDADO: O glutaraldeído pode causar queimaduras graves na pele e danos nos olhos; é prejudicial se ingerido, e é tóxico se inalado. Use jaleco, óculos, luvas e manuseie glutaraldeído em um exaustor de fumaça e use uma máscara. NOTA: É fundamental realizar a reação de reticulação em grande volume com o NCP nesta concentração mais baixa. Tentativas anteriores de reticulação, mesmo nesta concentração de glutaraldeído, mas em um NCP concentrado 10x maior levaram à agregação da amostra e over-crosslinking como indicado por SDS PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho. Essas grades não tinham partículas perceptíveis apenas com aglomerados (Figura 5D,E).</li>
		<li>Determinar as absorbâncias em OD 280 e OD 260 e concentrar ainda mais, se necessário, para atingir 1,3-3 mg/mL, com base em OD 280 (razão típica de OD260/ OD 280= 1,7-2 produz boas partículas). Para esse pequeno volume de 50 μL, o melhor método para reduzir a perda de amostra é fazer um botão de diálise com uma tampa de um tubo de 1,7 mL coberto por uma membrana de diálise (ponto de corte de 6-8 kDa MW), cortando o fundo do tubo e usando a borda do tubo para selar a membrana na parte superior da tampa.</li>
		<li>Coloque o botão de diálise que contém a amostra em cima de um leito de polietilenoglicol, com a membrana voltada para baixo (verificar o progresso a cada 2 min). Este método é preferido quando a concentração necessária é inferior ou igual a 2,5 vezes para evitar diluir ou perder a amostra no concentrador. É fundamental preparar imediatamente as grades crio-EM do complexo após essa etapa.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação por cromatografia de exclusão de tamanho<ol><li>No dia anterior ao congelamento, lavar e equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com 60 mL de dH2O, seguida de 80 mL de tampão de congelamento (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) durante a noite a uma taxa de 0,4 mL/min. Usando NCPs logo após a reconstituição, prepare o mesmo complexo usando quantidades 2,5x maiores da seguinte forma: misturar 2.500 μL de NCP [1,2 μM]; 650 μL de tampão de ligação 5x; 45 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM] e 55 μL de KCl 3M.</li>
		<li>Incubar a mistura em gelo sem reticulante por 15 min. Em seguida, adicionar glutaraldeído a uma concentração final de 0,005% conforme descrito no método do gel preparativo. Neste caso, no entanto, concentre o complexo em um filtro centrífugo pré-equilibrado (com tampão de congelamento) a aproximadamente 120 μL.</li>
		<li>Analise imediatamente as frações de pico e concentre as frações contendo histonas e MBP-Pol β-APE1 conforme indicado anteriormente. Consulte a Figura 5A,B,C para obter resultados bem-sucedidos usando o método de exclusão de tamanho e a Figura 7 usando ambos os métodos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Congelar complexo nucleossomal
<ol><li>Depois de ligar o congelador de imersão e encher o umidificador com 50 mL de dH2O, ajuste a temperatura da câmara para 22 °C e HR (umidade) para 98%. Coloque o copo de etano e o copo de nitrogênio líquido (contendo uma caixa de grade rotulada) em seus respectivos suportes de espaço.</li>
	<li>Cubra o copo de etano com o dispensador da tampa de etano e despeje cuidadosamente nitrogênio líquido (LN2) sobre ele, enquanto também enche o copo LN 2 com LN2. Quando o nível de LN2 tiver estabilizado e atingir 100% e uma temperatura de -180 °C, abra cuidadosamente a válvula de etano e encha o copo de etano até formar uma bolha na tampa transparente. Remova o dispensador de etano.</li>
	<li>Coloque dois papéis de filtro no dispositivo de mancha e prenda-os com um anel de metal. Vá para a configuração e use os seguintes parâmetros para blotting: 0 pré-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selecione A-plunge e clique em OK.</li>
	<li>Na tela principal, clique em Load Forceps e carregue-os com uma grade com o lado carbono/aplicação voltado para a esquerda (preparado como antes). Calibre a pinça ajustando o eixo Z para garantir uma mancha sólida. Clique em Câmara Inferior e aplique 3 μL do complexo (1,3-3 mg/mL; OD280). Clique em Blot/A-plunge. Isso vai girar a grade para manchar a partir da frente e vai mergulhá-la, congelá-la.</li>
	<li>Transfira e armazene a grade na caixa de grade na câmara LN2 . Quando todas as quatro grades tiverem sido congeladas e colocadas na caixa de grade, gire a tampa para a posição neutra, onde todas as grades estão cobertas pela tampa, e aperte o parafuso. As grades podem ser armazenadas no LN2 até que a triagem seja iniciada.</li>
</ol>4. Grades de tela
<ol><li>Antes de carregar as amostras no microscópio, coloque as grades vitrificadas em um anel e fixe-as usando um C-clip. Execute este processo de clipagem sob LN2 em uma sala com umidade controlada, para evitar a contaminação do gelo.</li>
	<li>Ao carregar o microscópio, insira as grades em um de 12 slots. Transfira o para uma cápsula nanocab e carregue-o no carregador automático. O mecanismo robótico do carregador automático inicia o processo.</li>
	<li>Transfira a grade do para o estágio do microscópio. Ajustar o estágio à altura eucêntrica oscilando o estágio 10° e movendo simultaneamente a altura Z até que um deslocamento planar mínimo seja observado nas imagens.</li>
	<li>Uma vez atingida a altura eucêntrica, inicie a imagem. Primeiro, obtenha o atlas tomando uma imagem de montagem 3 x 3 da grade, na qual cada montagem é tirada com ampliação de 62x. Escolha três quadrados de tamanhos variados; Pegue a altura eucêntrica e, em seguida, crie uma imagem com ampliação de 210x.</li>
	<li>Uma vez que um quadrado é fotografado, escolha um buraco cada da borda, centro e entre dentro dos quadrados. Imagem de cada furo com ampliação de 2600x.</li>
	<li>Antes de tirar essa imagem de alta ampliação, o foco automático ocorre em um deslocamento da área de imagem. Pegue a imagem de alta ampliação do centro do furo com ampliação de 36.000x e tempo de exposição de 7,1 s, 60 quadros, tamanho de 1,18 pixel e desfoco de 3 μm. Veja imagens representativas do rastreamento na Figura 5, Figura 6 e Figura 7.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Um protocolo específico para purificação do fator de reparo do DNA será dependente da enzima de interesse. Entretanto, existem algumas recomendações gerais, incluindo o uso de métodos recombinantes para expressão e purificação de proteínas18; se a proteína de interesse for muito pequena (<50 kDa), a determinação da estrutura por crio-EM era quase impossível até mais recentemente através do uso de sistemas de fusão19, scaffolds de ligação de nanocorpos20</s...

O DNA eucariótico é organizado e compactado por proteínas histonas, formando a cromatina. A partícula núcleo do nucleossomo (NCP) constitui a unidade repetitiva fundamental da cromatina que regula a acessibilidade às proteínas ligadoras de DNA para reparo, transcrição e replicaçãodo DNA 1. Embora a primeira estrutura cristalina de raios X do PFN tenha sido resolvida pela primeira vez há mais de duas décadas2 e muitas outras estruturas do PFN tenham sido publicadas desde3,4,5,6, os mecanismos de reparo do DNA em substratos nucleossômicos ainda não foram delineados. Descobrir os detalhes moleculares subjacentes ao reparo do DNA na cromatina exigirá a caracterização estrutural dos componentes participantes para entender como as características estruturais locais do NCP regulam as atividades de reparo do DNA. Isso é particularmente importante no contexto do reparo por excisão de base (BER), uma vez que estudos bioquímicos com enzimas BER sugerem mecanismos únicos de reparo de DNA em nucleossomos que são dependentes dos requisitos estruturais específicos da enzima para catálise e da posição estrutural da lesão de DNA dentro do nucleossomo 7,8,9,10,11,12,13 . Dado que o BER é um processo vital de reparo do DNA, há um interesse considerável em preencher essas lacunas, ao mesmo tempo em que se estabelece um ponto de partida a partir do qual outros estudos estruturais tecnicamente viáveis envolvendo complexos nucleossômicos relevantes podem ser realizados.
Cryo-EM está rapidamente se tornando o método de escolha para resolver a estrutura tridimensional (3D) de complexos cuja preparação em larga escala de amostra homogênea é desafiadora. Embora, o projeto e a purificação de NCPs complexados com um fator de reparo de DNA (NCP-DRF) provavelmente necessitarão de otimização personalizada, o procedimento apresentado aqui para gerar e congelar um complexo NCP-DRF estável fornece detalhes sobre como otimizar a preparação da amostra e da grade crio-EM. Dois fluxos de trabalho (não mutuamente exclusivos) mostrados na Figura 1 e os detalhes específicos no protocolo identificam etapas críticas e fornecem estratégias para otimizar essas etapas. Este trabalho impulsionará o campo de reparo de cromatina e DNA em uma direção onde a complementação de estudos bioquímicos com estudos estruturais se torne tecnicamente viável para melhor compreender os mecanismos moleculares do reparo de DNA nucleossomal.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES; pH 7.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% glutaraldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 filtro</td><td></td><td></td> centrífugo 1702926 <td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 da célula de preparação (MW de corte de 30 kDa)</td>Filtro centrífugo <td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 (MW de corte de 30 kDa)</td><td>Pinça Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid</td><td>Ted Pella</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>Congelador de Imersão Automático</td><td>Leica</td><td>Leica EM GP</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de toque C-1000</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C-clips e anéis</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>Estação de recorte</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de diálise (MW cufoff 6-8 kDa)</td> Pinça de diamante <td>15370752</td><td></td> <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>DNA integrado tecnologias</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI Titan Krios</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação FPLC</td> Coletor de frações <td>de 29018224</td><td></td><td>puras</td></tr><tr><td>AKTA Modelo 2110</td> Sistema <td>de limpeza de descarga de</td> brilho 7318122 <td></td><td>Bio-rad</td></tr> Caixas de grade <tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>Pacote de acessórios de armazenamento de grade</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>Etano Líquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio Líquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 bomba peristáltica de duas cabeças</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16%, Tricina, 1,0 mm, Mini Géis de Proteína</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (VWR) Baixa retenção</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gel de poliacrilamida (37.5:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>polietilenoglicol (PEG)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>PURX35050</tr><tr><td>Fator de reparo de DNA recombinante purificado</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>R 1,2 / 1,3 300 mesh</td><td>Grids Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Octâmero histona recombinante</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de recorte de mola</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 coluna 10/300</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão</td><td>Thermo Fisher</td><td>Talos Arctica 200 kV</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Pinças para FEI Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mark IV System</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papel de filtro (55 mM)</td> <td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Micro Spin Colunas de Dessalinização, 7K MWCO, 75 &micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de partículas nucleares complexadas com fatores de reparo de dna para determinação estrutural por microscopia crio-eletrônica

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

O reparo do DNA no contexto da cromatina é pouco compreendido. Estudos bioquímicos usando partículas centrais do nucleossomo, a unidade repetitiva fundamental da cromatina, mostram que a maioria das enzimas de reparo de DNA remove danos ao DNA em taxas reduzidas em comparação com o DNA livre. Os detalhes moleculares sobre como as enzimas de reparo por excisão de base (BER) reconhecem e removem danos ao DNA em nucleossomos ainda não foram elucidados. No entanto, dados bioquímicos de BER de substratos nucleossômicos sugerem que o nucleossomo apresenta diferentes barreiras estruturais dependentes da localização da lesão de DNA e da enzima. Isso indica que os mecanismos empregados por essas enzimas para remover danos ao DNA livre no DNA livre podem ser diferentes daqueles empregados em nucleossomos. Dado que a maioria do DNA genômico é reunida em nucleossomos, informações estruturais desses complexos são necessárias. Até o momento, a comunidade científica carece de protocolos detalhados para a realização de estudos estruturais tecnicamente viáveis desses complexos. Aqui, nós fornecemos dois métodos para preparar um complexo de duas enzimas BER geneticamente fundidas (Polimerase β e AP Endonuclease1) ligadas a uma lacuna de nucleotídeo único perto da entrada-saída do nucleossomo para determinação estrutural por crio-microscopia eletrônica (crio-EM). Ambos os métodos de preparação de amostras são compatíveis para vitrificar grades de qualidade via congelamento por imersão. Este protocolo pode ser usado como ponto de partida para preparar outros complexos nucleossômicos com diferentes fatores BER, fatores de transcrição pioneiros e enzimas modificadoras da cromatina.

PCN devidamente montadas (Figura 2) foram utilizadas para confecção de um complexo com uma proteína de fusão recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Para determinar a razão entre NCP e MBP-Polβ-APE1 para formar um complexo estável, realizamos ensaios de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) (Figura 4), que mostraram uma banda deslocada isoladamente do NCP com excesso molar de 5 vezes de MBP-Polβ-APE1. Durante a otimizaç...

Este protocolo descreve em detalhes a preparação de complexos nucleossômicos usando dois métodos de preparação de amostras para congelamento de grades de TEM.

Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Informações estruturais sobre como enzimas de reparo por excisão de base removem lesões de DNA no contexto da cromatina têm sido escassas. Isso constitui uma lacuna significativa em nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na etiologia das doenças humanas. A principal vantagem do nosso protocolo é que otimizamos a preparação da amostra usando equipamentos laboratoriais padrão.Isso permitirá que outros bioquímicos da área complementem seu trabalho bioquímico com estudos crio-EM tecnicamente viáveis. Nosso protocolo também pode ser usado para investigar como outros fatores, incluindo fatores de transcrição pioneiros, envolvem o nucleossomo. Esta é uma área em que a informação estrutural também tem sido limitada.Otimizar a preparação da amostra antes de passar para as condições de congelamento foi fundamental para levar nosso projeto adiante, e isso é melhor feito com ensaios bioquímicos padrão em condições de projeto, ligação e reticulação de substratos. Para começar, incube o NCP e o fator de reparo de DNA de interesse no gelo por 15 minutos usando um tampão ideal para o complexo específico. Em seguida, adicione o glutaraldeído a uma concentração final de 0,005% Depois de misturar bem, incubar em temperatura ambiente por 13 minutos.Temperar com um molar Tris-CL até uma concentração final de 20 milimolares Tris-CL com pH 7,5. Em seguida, concentre para aproximadamente 50 microlitros e troque o tampão por tampão de congelamento usando uma coluna de dessalinização. Em seguida, determine as absorbâncias na densidade óptica de 280 e 260 nanômetros e concentre-se ainda mais, se necessário, para atingir 1,3 a 3 miligramas por mililitros, com base na densidade óptica de 280 nanômetros.Após o preparo do botão de diálise, coloque o botão que contém a amostra em cima de um leito de polietilenoglicol com a membrana voltada para baixo. Para realizar a purificação por cromatografia de exclusão de tamanho, lavar e equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com 60 mililitros de água destilada, seguida de 80 mililitros de tampão de congelamento durante a noite a uma taxa de 0,4 mililitros por minuto. Em seguida, analise imediatamente as frações de pico e concentre as frações contendo a proteína de infusão de histona MBP-PolBeta-APE1.Demonstrando os seguintes procedimentos estará Elizabeth Viverette, uma estagiária de pós-bacharelado do núcleo de crio-EM aqui no NIH. Depois de ligar o congelador de imersão e encher o umidificador com 50 mililitros de água destilada, ajuste a temperatura da câmara para 22 graus Celsius e a umidade para 98% Em seguida, coloque o copo de etano e o copo de nitrogênio líquido nos respectivos suportes de espaço. Depois, cubra o copo de etano com o dispensador da tampa de etano e despeje cuidadosamente nitrogênio líquido sobre ele, enquanto também enche o copo de nitrogênio com nitrogênio líquido.Quando o nível de nitrogênio líquido tiver se estabilizado e atingir 100% e a temperatura atingir 180 graus Celsius negativos, abra cuidadosamente a válvula de etano e encha o copo de etano até formar uma bolha na tampa transparente. Em seguida, remova o dispensador de etano. Coloque dois papéis de filtro no dispositivo de mancha e prenda-os com um anel de metal.Vá para a configuração e defina os parâmetros de blotting conforme descrito no manuscrito, selecione A-Plunge e clique em OK. Na tela principal, clique em Load Forceps e carregue-os com uma grade com o lado de aplicação de carbono voltado para a esquerda. Calibre as pinças, ajustando o eixo Z para garantir uma mancha sólida. Clique em Câmara Inferior e aplique três microlitros do complexo.Em seguida, clique em Blot A-Plunge, que girará a grade para manchar a partir da frente e irá mergulhá-la. Após a transferência, guarde a grade na caixa de grade na câmara de nitrogênio líquido. Quando todas as quatro grades tiverem sido congeladas e colocadas na caixa de grade, gire a tampa para a posição neutra, onde todas as grades estão cobertas pela tampa e aperte o parafuso.Antes de carregar as amostras no microscópio, coloque as grades vitrificadas em um anel e fixe-o usando um C-clip sob nitrogênio líquido em uma sala com umidade controlada para evitar a contaminação do gelo. Ao carregar o microscópio, insira as grades em um de 12 slots. Embaralhe o em uma cápsula nanocab e carregue-o no carregador automático.Em seguida, transfira a grade do para o estágio do microscópio. Ajuste o estágio para a altura eucêntrica oscilando o estágio em 10 graus e, simultaneamente, movendo a altura Z até que um deslocamento planar mínimo seja observado nas imagens. Uma vez atingida a altura eucêntrica, inicie a criação de imagens tomando uma imagem de montagem 3 por 3 da grade na qual cada montagem é feita com aumento de 62x para obter o atlas.Depois de escolher três quadrados de tamanhos variados e tomar a altura eucêntrica, imagem em ampliação de 210x. Uma vez que um quadrado é fotografado, escolha um buraco cada da borda, centro e entre dentro dos quadrados. Em seguida, imagine cada furo com ampliação de 2,600x.Pegue a imagem de alta ampliação do centro do furo com ampliação de 36.000x e tempo de exposição de 7,1 segundos, 60 quadros, tamanho de 1,18 pixel e desfoco de três micrômetros. Veja imagens representativas da triagem. Para determinar a razão entre NCP e MBP-PolBeta-APE1 para formar complexo estável, foram realizados ensaios de deslocamento da mobilidade eletroforética, que mostraram uma banda isoladamente deslocada do NCP com excesso molar de cinco vezes de MBP-PolBeta-APE1.Em menor volume, a montagem do complexo NCP-PolBeta-APE1 demonstrou que a amostra foi excessivamente reticulada e resultou em agregados sem complexos individuais discerníveis. No entanto, a diluição de dez vezes em PCN resultou em agregação significativamente reduzida e melhor estabilidade de partículas. Os métodos de exclusão de gel preparativo e tamanho podem ser combinados onde o gel preparativo melhora a qualidade dos PCN quando eles contêm uma quantidade significativa de agregados de alto peso molecular, seguido pela purificação do complexo via exclusão de tamanho.Os resultados mostram que ambos os métodos podem ser usados independentemente para gerar complexos estáveis. Além disso, os dados coletados de ambas as grades mostram classes bidimensionais quase idênticas e mapas tridimensionais com resolução de aproximadamente 3,2 angstroms. Uma relação ótima entre NCP e fator de reparo de DNA deve ser determinada primeiro, em seguida, a reticulação do complexo com glutaraldeído deve ser realizada pelo menos 10 vezes mais diluída do que a concentração necessária para o congelamento.Depois de obter um mapa 3D crio-EM do complexo, um refinamento estrutural adicional será necessário para determinar como o fator de reparo de DNA é encontrado e identificar quais regiões são importantes para essas interações.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

Aqui, apresentamos um protocolo de caracterização de partículas nucleossoma no nível do único-molécula usando microscopia estático e Time-Lapse de força atômica (AFM), técnicas de imagem. O método de superfície functionalization descrito permite a captura da estrutura e dinâmica dos nucleosomes em alta resolução em nanoescala.

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

Este artigo descreve como utilizar efetivamente três plataformas de processamento crio-EM, ou seja, crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, para criar um fluxo de trabalho único e robusto aplicável a uma variedade de conjuntos de dados de partículas únicas para determinação da estrutura de alta resolução.

Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Este protocolo apresenta um método prático usando Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) como exemplo para abordar a distribuição desigual de partículas por meio da otimização da preparação de amostras, fornecendo uma referência para os pesquisadores elucidarem eficientemente estruturas macromoleculares usando microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM).

Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Aprenda a preparar complexos nucleossômicos com fatores de reparo de DNA para estudos estruturais por crio-microscopia eletrônica. Este protocolo otimizado utiliza equipamentos laboratoriais padrão.

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Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

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