Name: Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprenda a medir o crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos com alta precisão espacial e temporal. Este método utiliza microscopia confocal e estimulação elétrica para investigar a regulação do crescimento muscular e suas implicações para distúrbios de perda muscular.

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Os autores estão profundamente em dívida com os esforços dos membros do laboratório Hughes, Drs. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin e Vladimir Snetkov, para o desenvolvimento dos protocolos descritos, e para Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau e Peter Currie para compartilhar plasmídeos ou linhas de peixe-zebra. A SMH é uma cientista do Conselho de Pesquisa Médica (MRC) com a Bolsa do Programa G1001029, MR/N021231/1 e MR/W001381/1 de apoio. MA realizou um MRC Doctoral Training Program PhD Studentship do King's College London. Este trabalho se beneficiou da contribuição trigonométrica de David M. Robinson, estudioso, mentor e amigo.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Aqui relatamos um método para estimativa precisa e eficiente do volume muscular de larvas vivas de peixe-zebra em estágios ou em variantes genéticas em que a pigmentação não é um grande obstáculo à imagem e quando a anestesia transitória e/ou imobilização é bem tolerada. Considerando que empregamos a microscopia confocal de varredura a laser, as abordagens descritas são aplicáveis à microscopia confocal ou de folha de luz de disco giratório e a qualquer outro método que crie pilhas de imagens em planos focais distintos. ...

O crescimento regulado do tecido, compreendendo o aumento do número de células (hiperplasia) e/ou do tamanho celular (hipertrofia), é um fator crucial no desenvolvimento, regeneração e adaptação ecológica e evolutiva. Apesar dos enormes avanços na compreensão genética molecular da biologia celular e do desenvolvimento nas últimas décadas, a compreensão mecanicista da regulação do tamanho dos tecidos e órgãos ainda está em sua infância. Uma das razões para essa lacuna no conhecimento é a dificuldade de quantificar o crescimento tecidual em organismos vivos com a necessária precisão espacial e temporal.
Vários aspectos do crescimento de organismos inteiros podem ser medidos repetidamente ao longo do tempo, revelando curvas de crescimento para cada indivíduo 1,2,3,4,5. Métodos de varredura cada vez mais sofisticados, como a absorciometria dupla de raios X (DXA), a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM), permitem o rastreamento do crescimento de órgãos inteiros e outras regiões do corpo (por exemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) em indivíduos isolados, humanos e em organismos modelo 6,7,8,9,10 . No entanto, esses métodos ainda não têm a resolução de revelar células individuais e, portanto, as ligações entre os comportamentos celulares e o crescimento do nível tecidual têm sido difíceis de discernir. Para fazer tais ligações, os estudos tradicionais muitas vezes se basearam em coortes de animais individuais semelhantes, alguns dos quais são sacrificados em pontos de tempo sucessivos e, em seguida, analisados em detalhes citológicos. Tais abordagens requerem a média das mudanças observadas entre grupos de indivíduos (de preferência semelhantes, mas ainda assim variáveis) e, portanto, sofrem de uma falta de resolução temporal e espacial, tornando difícil encontrar eventos correlacionados no nível celular sugestivos de causa e efeito.
Estudos em organismos modelo de invertebrados, inicialmente em C. elegans e D. melanogaster, contornaram esses problemas desenvolvendo microscopia óptica para alcançar a resolução celular e medir com precisão o crescimento ao longo do tempo em indivíduos individuais. Tais estudos têm revelado comportamentos de linhagem celular surpreendentemente invariantes no crescimento desses pequenos organismos-modelo 11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos animais, incluindo todos os vertebrados, têm linhagens celulares indeterminadas e controlam o crescimento de tecidos por meio de misteriosos processos de feedback que servem para transformar o programa de crescimento geneticamente codificado em um organismo tridimensional funcional com todos os seus tecidos e órgãos constituintes adequadamente combinados em tamanho. Para entender esses processos complexos de crescimento, é desejável visualizar tecidos ou órgãos inteiros ao longo do tempo em indivíduos individuais que possam ser manipulados experimentalmente por intervenções genéticas, farmacológicas ou outras em um momento de escolha e o efeito posteriormente analisado.
Cada músculo esquelético vertebrado tem um tamanho, forma e função definidos, e interações bem caracterizadas com tecidos adjacentes, como osso, tendão e nervos. Alguns músculos são pequenos, ficam logo abaixo da pele e, portanto, são bons candidatos para estudos de imagem de alta resolução. Semelhante à maioria dos órgãos, cada músculo cresce ao longo da vida embrionária, pós-natal e juvenil, antes de atingir um tamanho adulto estável. O músculo, no entanto, também tem uma capacidade única de mudar de tamanho durante a vida adulta, dependendo do uso e da nutrição18, e essa propriedade tem um grande impacto na aptidão do organismo, no desempenho esportivo e na vida independente. A perda de massa muscular e função na velhice, a sarcopenia, é uma questão de crescente preocupação para as sociedades frente ao envelhecimento da população 19,20,21.
Nós e outros temos focado no crescimento de blocos definidos de tecido muscular esquelético no corpo segmentarmente repetitivo de larvas de peixe-zebra, como um sistema aparentemente fechado contendo várias centenas de células nas quais o crescimento, manutenção e reparo tecidual podem ser observados e manipulados 22,23,24,25,26. Embora alguns trabalhos quantitativos tenham sido relatados anteriormente 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, nenhum método detalhado e validado de medir o crescimento muscular em detalhes celulares em organismos vertebrados individuais ao longo do tempo está disponível. Aqui um protocolo eficiente de como realizar tais medições repetidas é descrito, juntamente com a validação, e um exemplo de seu uso para analisar mudanças no crescimento hipertrófico e hiperplásico em resposta à atividade elétrica alterada é fornecido.

<table><tbody><tr><td>Adesivo, Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Aspirador de aerossol&nbsp;</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-Agarose</td><td></td></tr><tr><td>, baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Depois de derretido, mantenha a 37oC em um aquecedor de bloco para permanecer na forma líquida para uso repetido.</td></tr><tr><td>Aquecedor</td><td>de bloco Cole-Parmer</td><td>SBH130-BODIPY</td><td></td></tr> <tr><td>FL C5-ceramida</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>Para ser diluído em água de peixe e usado a 5 &micro; M para incubação durante a noite.</td></tr><tr><td>Clipes e fios de crocodilo</td><td></td> <td>---</td><td></td></tr> <tr><td>Fiji / imageJ</td><td>National Institutes of Health, NIH</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Meio de peixe, água de peixe</td> <td>-</td><td></td> <td>Água do sistema de circulação coletada da instalação de peixes.</td></tr><tr><td>Meio de peixe, meio E3</td> <td>-</td><td></td> <td>E3 é descrito no The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 e 0,33 mM MgSO4 em água destilada).</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16F</td><td>Microscópio de fluorescência de outro tipo também deve ser adequado.</td></tr><tr><td>Agulha de vidro</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>Ser polido a fogo para evitar danos nos embriões durante a manipulação.</td></tr><tr><td>Estimulador de grama</td><td>Instrumentos de grama</td><td>S88</td><td>Estimuladores de outro tipo também devem ser adequados.</td></tr><tr><td>Kimwipes, Limpadores de Tarefas Delicadas</td> Microscópio de varredura profissional <td>13258179-Laser</td> (LSM) da <td>Kimberly-Clark</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880</td><td>LSM de outro tipo também devem ser adequados.</td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Treated, placa de 6 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>140675-Objective</td></tr><tr><td>, imersão em água de 20&vezes;/1,0W</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, graduada 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100-Pipeta</td><td></td></tr> <tr><td>Pasteur, ponta microfina 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100-placa</td><td></td></tr> <tr><td>de Petri, 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>Plasmídeo, CMV-Cerúleo</td><td>Christina L. Hammond (Universidade de Bristol)</td><td></td><td>pCS2+_cerulean_kanR plasmídeo injetado a 25-75 pg no estágio de uma célula.&nbsp; Citação: Bussman J e Schulte-Merker S. (2011) Desenvolvimento 138: 4327-4332. DOI: 10.1242/dev.068080.</td></tr><tr><td>Plasmídeo, pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (Universidade de Sheffield)</td><td>-</td><td>Para transcrição in vitro usando o promotor SP6 (plasmídeos contendo outros marcadores de marcação de membrana podem ser usados); mRNA encapsulado sintetizado para ser injetado a 100-200 pg no estágio de uma célula.</td></tr><tr><td>Controlador de pulso&nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750-Ferro</td> <td>de</td></tr> <tr><td>solda</td> <td>-</td><td></td><td>--</td></tr> <tr><td>Tricaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato / MS-222; para ser dissolvido em água de peixe e usado a 0,6 mM.</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer / Quorum Technologies Inc</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>fórceps de relojoeiro, nº 5</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Fio, platina</td><td>Goodfellow</td><td>PT005142 / 12</td><td>0,40 mm de diâmetro; uma alternativa cara de prata.</td></tr><tr><td>Fio, Silver</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>0,25 mm de diâmetro (uma faixa de diâmetro, ou seja, 0,25-0,5 mm, foi testada, o que produziu resultados semelhantes).</td></tr><tr><td>Peixe-zebra, myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (Hospital Geral de Massachusetts; Instituto de Células-Tronco de Harvard)</td><td>-</td><td>ZFIN nome oficial: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp; Citação: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yord e aacute; n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Nat Commun. 21 de janeiro de 2016;7:10358. DOI: 10.1038/ncomms10358.</td></tr><tr><td>Peixe-zebra, &alpha;-actina:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)</td><td>-</td><td>ZFIN nome oficial: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citação: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A e Currie PD. Perda de tropomodulina4 no mutante peixe-zebra tr&auml; A GE causa formação de bastonetes citoplasmáticos e fraqueza muscular que lembra a miopatia nemalina. Dis Model Mech. 2014 Dez; 7(12):1407-15. DOI: 10.1242/dmm.017376.</td></tr><tr><td>Peixe-zebra, &beta;-actina: HRAS-EGFP</td> <td>-</td><td></td> <td>nome oficial da ZFIN: Tg (Ola.Actb: Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp; Citação: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I e Kimelman D. Visualizando a morfogênese em embriões de peixe-zebra transgênicos usando corante de éster metílico BODIPY TR como uma contracoloração vital para GFP. Dev Dyn. Fevereiro de 2005; 232(2):359-68. DOI: 10.1002/dvdy.20252.</td></tr><tr><td>Software</td><td>Zeiss</td> <td>de ZEN-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

Vários métodos podem ser usados para visualizar células individuais em todo o corpo de peixes-zebra embrionários, larvais ou juvenis vivos. Mostramos que peixes vivos com membranas plasmáticas marcadas fluorescentemente podem ser escaneados em um microscópio confocal de varredura a laser, a fim de determinar o volume de tecido muscular e o número de fibras musculares presentes. Abordagens eficientes para a medição do número e tamanho celular em animais vivos ao longo do tempo são descritas e validadas contra métodos de segmentação mais árduos. São descritos métodos que permitem o controle da atividade elétrica muscular e, portanto, contrátil. A perda de atividade contrátil do músculo esquelético reduziu muito o crescimento muscular. Em larvas, é descrito um protocolo que permite a reintrodução da atividade contrátil evocada elétrica padronizada. Os métodos descritos minimizam o efeito da variabilidade interindividual e permitirão a análise do efeito de estímulos elétricos, genéticos, medicamentosos ou ambientais em uma variedade de parâmetros de crescimento celular e fisiológico no contexto do organismo vivo. O acompanhamento a longo prazo dos efeitos medidos de uma intervenção definida no início da vida em indivíduos pode ser subsequentemente realizado.

Uma medida rápida e precisa do volume de somite Um método de preparação de amostras, aquisição de dados e análise volumétrica que permite a rápida medição do crescimento muscular em larvas de peixe-zebra é descrito. O tamanho do músculo pode ser medido em animais vivos usando peixes marcados em suas membranas plasmáticas com uma GFP direcionada à membrana (β-actina: HRAS-EGFP) ou mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). As larvas foram anestesiadas transitoriamente com tricaína, montadas em...

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Nosso protocolo nos permite estudar como os tecidos, como o músculo esquelético, regulam seu tamanho, o que continua sendo uma questão-chave na biologia celular e do desenvolvimento, com importantes implicações fisiológicas e médicas. A principal vantagem de nossa técnica é que o crescimento celular pode ser observado e medido em animais vivos in vivo com um alto grau de precisão espacial e temporal. O progresso na compreensão básica do crescimento muscular precoce pode destacar as origens do desenvolvimento de problemas musculares precoces e levar à descoberta da Novo Therapeutics para proteger contra a perda muscular em idosos e pacientes com distúrbios de perda muscular.Prepare 1%LMA em um tubo de 1,5 mililitro e mantenha-o em um bloco de calor de 37 graus Celsius para uso repetido. Selecione os peixes a serem montados e anestesiar transitoriamente cada peixe. Para evitar o choque térmico, remova a alíquota LMA do bloco de calor e deixe-a esfriar até logo acima da configuração.Pegue uma placa de Petri de 60 mililitros que tenha sido revestida com uma camada de 1%LMA e coloque-a no palco de um microscópio de dissecação. Transfira a larva com uma pipeta Pasteur de plástico de um m

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um...

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

Medições da força pode ser usada para demonstrar as alterações na função muscular, devido ao desenvolvimento, lesões, doença, o tratamento ou a toxicidade química. Neste vídeo, demonstramos um método para medir a força durante uma contração máxima de zebrafish músculos do tronco larval.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a medir o crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos com alta precisão espacial e temporal. Este método utiliza microscopia confocal e estimulação elétrica para investigar a regulação do crescimento muscular e suas implicações para distúrbios de perda muscular.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada (Vídeo) | JoVE Journal

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