Name: Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a aplicar força mecânica diretamente no núcleo celular usando microesferas magnéticas e imagem de fluorescência confocal. Este método não invasivo revela mecanismos de mecanossensibilidade nuclear em células vivas.

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Este projeto é financiado pelo UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), o UFHCC Pilot Award (X. T. e Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) e UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Agradecemos sinceramente as discussões intelectuais e o apoio técnico do Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurocirurgia), Dr. Tian He (Universidade de Harvard), Dr. Youhua Tan (Universidade Politécnica de Hong Kong), Dr. Jessie L-S Au (Instituto de Farmacologia de Sistemas Quantitativos), Dr. David Hahn (Universidade do Arizona), e Equipe de Suporte da Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Estamos profundamente gratos pelo apoio efetivo de todos os membros dos laboratórios de pesquisa de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann e Guan e todos os membros da equipe do Departamento de MAE da UF.

1. Manutenção de células B2B projetadas por CRISPR/Cas9
<ol><li>Cultura de células B2B em frasco T25 com RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Manter as células B2B em incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Subcultura das células B2B quando a confluência atingir 70% a 80%.</li>
	<li>Armazenar a linhagem celular B2B em meio de cultura RPMI-1640 com 10% (v/v) de DMSO em um freezer de -80 °C.</li>
	<li>Use as células B2B com um número de passagem menor que 10 nos experimentos.</li>
</ol>2. Cultura celular
<ol><li>Semeie as células em uma placa de Petri com fundo de vidro.<ol><li>Deslocar o balão que contém células B2B no seu interior da incubadora para o armário de biossegurança.</li>
		<li>Retirar o meio de cultura no balão utilizando uma pipeta aspiradora com uma bomba de vácuo ligada.</li>
		<li>Lavar o balão com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
		<li>Remova o PBS usando a pipeta de aspiração.</li>
		<li>Adicionar 0,5 ml de solução de tripsina a 0,05% para separar as células do fundo do substrato do balão.</li>
		<li>Colocar o balão na incubadora durante 5 minutos.</li>
		<li>Deslocar o balão para o armário de biossegurança. Adicionar 5 ml de novo meio de cultura ao balão e pipetar a solução para cima e para baixo.</li>
		<li>Deposite 50 μL do meio com células (300 células/μL) na placa de Petri com fundo de vidro. Adicionar 2 mL de meio de cultura à placa de Petri.</li>
		<li>Coloque a placa de Petri na incubadora. Aguarde 12 h para que as células se liguem.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultive as células com microesferas magnéticas.<ol><li>Pesar 0,2 g de microesferas de ferro carbonilo de diâmetro médio de 7 μm (a seguir designadas por microesferas de 7 μm, ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Use uma pipeta para suspender as microesferas em 1 mL de meio de cultura RPMI-1640.</li>
		<li>Leve a placa de Petri com células B2B para o gabinete de biossegurança.</li>
		<li>Adicionar 200 μL do meio contendo microesferas à placa de Petri. NOTA: Adicione o meio rapidamente para evitar a precipitação das microesferas.</li>
		<li>Coloque a placa de Petri de volta na incubadora até que as microesferas sejam internalizadas pelas células. Verifique a internalização a cada 6 h para determinar o tempo ideal para internalização para diferentes linhas celulares.</li>
		<li>Para verificar a internalização, realize imagens de fluorescência confocal para visualizar o limite de microesferas e celular. Se a microesfera for internalizada pela célula, ela estará dentro do limite celular.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualização do núcleo
<ol><li>Aquecer 1,5 mL do meio de cultura na incubadora por 15 min.</li>
	<li>Desligue a luz do armário de biossegurança. Leve a placa de Petri que contém a célula, o meio de cultura aquecido, a mancha nuclear e o Verapamil HCl para o gabinete de biossegurança. NOTA: Os componentes de coloração nuclear são sensíveis à luz. Evite a exposição à luz durante a operação.</li>
	<li>Diluir 1000x a mancha nuclear por DMSO a 100x.</li>
	<li>Diluir 100 mM Verapamil HCl por DMSO a 10 mM.</li>
	<li>Adicionar 15 μL de 100x de coloração nuclear e 15 μL de 10 mM de Verapamil HCl a 1,5 mL de meio de cultura. Misture bem pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Retire o meio de cultura da placa de Petri. Adicionar o meio de cultura contendo coloração nuclear na placa de Petri.</li>
	<li>Coloque as células de volta na incubadora por mais de 2 h.</li>
</ol>4. Preparação do hardware de aplicação de força magnética
<ol><li>Imprima em 3D todas as peças usando acrilonitrila butadieno estireno (ABS) e monte-as seguindo o projeto CAD (Figura 1A). O projeto CAD está incluído na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Use fita dupla face para conectar o ímã ao dispositivo de movimentação de ímã (Figura 1A).</li>
	<li>Coloque o dispositivo de movimento magnético ao lado do estágio do microscópio. Use os três botões para ajustar a localização espacial do ímã até que ele possa se mover acima da placa de Petri entre 13 mm e 120 mm. NOTA: Certifique-se de que o limite superior da distância entre o ímã e a placa de Petri seja o maior possível para evitar a aplicação de força indesejada nas microesferas magnéticas. 120 mm é o valor máximo nesta configuração experimental. Certifique-se de que o ímã não interfira com as peças do microscópio, incluindo objetivos e estágios motorizados.</li>
	<li>Ajuste o ímã para a posição z mais alta (a 120 mm).</li>
</ol>5. Forçar a aplicação e a imagem de células vivas
<ol><li>Configuração da câmara ambiental para imagens de longo prazo<ol><li>Aplique solução de etanol a 75% para esterilizar e limpar completamente a câmara ambiental.</li>
		<li>Coloque a câmara ambiente no estágio motorizado do microscópio invertido.</li>
		<li>Abra o tanque de CO 2 e defina a taxa de entrada de CO2 para 160 mL/min.</li>
		<li>Ajuste a temperatura da câmara para 44 °C (Topo), 42 °C (Banho) e 40 °C (Palco).</li>
		<li>Adicione 20 mL de água purificada no banho da câmara ambiente para manter 90% de umidade.</li>
		<li>Retire a placa de Petri com fundo de vidro que contém células-alvo da incubadora de cultura de tecidos e coloque-a na câmara.</li>
		<li>Aplique a braçadeira de metal da câmara ambiente para fixar a posição da placa de Petri. NOTA: A placa de Petri deve ser firmemente presa na câmara, porque a força magnética pode mover a placa se ela não estiver presa.</li>
		<li>Feche a tampa da câmara.</li>
	</ol></li>
	<li>Otimização de parâmetros de imagem<ol><li>Otimize o tamanho do pinhole: O pinhole bloqueia os fótons fora de foco. Um tamanho de pinhole maior produz mais fótons fora de foco, mas uma imagem mais brilhante. Um tamanho de pinhole menor produz uma imagem mais focada e mais fraca. Certifique-se de otimizar o tamanho do orifício para obter imagens confocais em foco com a relação sinal-ruído apropriada.</li>
		<li>Otimize a intensidade do laser: A intensidade do laser determina a intensidade da excitação e, portanto, a emissão de luz. A baixa intensidade do laser proporciona uma baixa relação sinal-ruído. Uma intensidade de laser muito alta causará fotobranqueamento. Ajuste a intensidade do laser de acordo.</li>
		<li>Otimize o tamanho e as etapas da etapa: as etapas e o tamanho da etapa determinam quantas imagens serão obtidas em uma pilha Z. Tamanhos de passos menores e mais passos aumentarão a resolução da pilha Z, mas também aumentarão o fotobranqueamento. Neste experimento, o tamanho do passo de 1 μm foi usado para as células com ~15 μm de altura celular.</li>
		<li>Otimizar o tempo de exposição: O tempo de exposição determina quanto tempo a célula ficará exposta ao laser de excitação. Um baixo tempo de exposição diminuirá a relação sinal-ruído. Um alto tempo de exposição causará fotobranqueamento. Um tempo de exposição de 1 quadro por 4 s foi utilizado neste experimento.</li>
		<li>Otimização dos parâmetros de imagem: Altere um dos quatro parâmetros iterativamente e mantenha os outros parâmetros consistentes. A cada vez, meça a relação YAP N/C de cada imagem e compare a mudança da relação YAP N/C para determinar o nível de fotobranqueamento. Repita o processo de otimização até obter um equilíbrio entre a relação sinal-ruído, a velocidade da imagem e o fotobranqueamento.</li>
		<li>Defina as configurações de imagem usando os parâmetros de imagem otimizados para configurações de imagem mais rápidas durante os experimentos. NOTA: As configurações utilizadas neste estudo estão descritas na secção 5.3 dos parâmetros de imagiologia. Para otimizar os parâmetros de imagem das configurações na seção 5.3, use o mesmo método da etapa 5.2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplicação de força pequena e imagem confocal NOTA: O microscópio Nikon Ti2-E foi usado para imagens neste estudo, e as etapas detalhadas para a aquisição de imagens são dadas abaixo.<ol><li>Abra o microscópio invertido. Abra o aplicativo de software Elements.</li>
		<li>Defina magnetic_find de configuração. Verifique apenas o canal FITC. Defina PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidade do laser = 10. Defina a velocidade de digitalização para 1 quadro por 2 s clicando no botão 1/2 . Defina o tamanho do orifício para 1,2 UA clicando no botão 1,2 UA . Essa configuração será usada na etapa 5.3.5.</li>
		<li>Defina magnetic_YAP_Nucleus de configuração. Verifique o canal FITC. Defina PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidade do laser = 10. Defina a velocidade de digitalização para 1 quadro por 4 s clicando no botão 1/2 . Defina o tamanho do orifício para 1,2 UA clicando no botão 1,2 UA . Para obter a imagem do limite do núcleo e da intensidade da mancha nuclear, verifique o canal Cy5. Defina PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidade do laser = 10. O tamanho do orifício é otimizado para imagens 3D YAP. Não clique no botão 1.2 A.U . novamente depois de verificar o canal Cy5. Essa configuração será usada na etapa 5.3.7.</li>
		<li>Ative o DIA por meio do Elements, se necessário. Abra o SpinView, use um campo brilhante e ajuste o foco do objeto para obter uma imagem clara em foco das células. Use um objetivo de 10x para encontrar várias células únicas apropriadas em três condições: com uma única microesferas dentro, com várias microesferas dentro e sem nenhuma microesferas dentro. Mude para o objetivo de 40x. Nomeie esta posição com o número de posição apropriado.</li>
		<li>Elementos abertos. Clique em magnetic_find. Clique no botão Remover intertravamento.</li>
		<li>Clique em Digitalizar e ajuste a posição Z do plano focal. Clique nos botões Superior e Inferior para definir o limite inferior e superior para a pilha Z das células selecionadas. Pare a varredura clicando em Verificar novamente.</li>
		<li>Alterne para a configuração magnetic_YAP_Nucleus . Defina o nome do arquivo como before_small_force.nd2. Clique no botão Executar com a pilha Z gravada.</li>
		<li>Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 46 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante. Confira o vídeo para confirmar que as microesferas mostram o deslocamento induzido pela força magnética.</li>
		<li>Repita as etapas 5.3.5-5.3.7; defina o nome do arquivo como after_small_force.nd2.</li>
		<li>Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Em seguida, abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 120 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante.</li>
		<li>Repita as etapas 5.3.5-5.3.7 e defina o nome do arquivo como before_large_force.nd2.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplicação de grande força e imagem confocal<ol><li>Remova a tampa da câmara ambiente para permitir que o ímã atinja 13 mm acima do fundo da placa de Petri.</li>
		<li>Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 13 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante. Confira o vídeo para confirmar que as microesferas mostram o deslocamento induzido pela força magnética.</li>
		<li>Repita as etapas 5.3.5-5.3.7 e defina o nome do arquivo como after_large_force.nd2.</li>
		<li>Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Em seguida, abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 120 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante.</li>
		<li>Repita as etapas 5.3.5-5.3.7; defina o nome do arquivo como retract_large_force.nd2.</li>
		<li>Feche a tampa da câmara ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita as etapas 5.2 e 5.3 para vários campos de exibição para obter mais dados, se necessário.</li>
</ol>6. Processamento de imagens e análise de dados
<ol><li>Quantificação da relação N/C YAP<ol><li>Abra o Fiji ImageJ. Abra as imagens .nd2 tiradas na etapa 5.</li>
		<li>Clique em Analisar > Definir Medidas. Área de verificação, densidade integrada, valor cinza médio e descritores de forma.</li>
		<li>Use o canal Cy5 para identificar o núcleo. Clique em Seleções à mão livre para usar a ferramenta de seleção livre para delinear o núcleo. Além disso, verifique a macro de máscara nuclear automática no ImageJ (consulte a Tabela de materiais).</li>
		<li>Clique em Analisar > Medir no canal FITC. O valor medido da Média é a intensidade média do YAP nuclear DN.</li>
		<li>Use o canal Cy5 para identificar o núcleo. Use o canal FITC para identificar a célula. Clique em Seleções à mão livre para usar a ferramenta de seleção livre para selecionar uma região de interesse dentro do citoplasma e evitar a microesferas magnéticas. Esta região de interesse não deve incluir o núcleo.</li>
		<li>Clique em Analisar > Medir no canal FITC. O valor medido da Média é a intensidade média citoplasmática do YAP DC.</li>
		<li>Calcule a razão YAP N/C = D N / DC.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação da forma nuclear e intensidade da coloração nuclear normalizada<ol><li>Abra o Fiji ImageJ. Abra as imagens .nd2 tiradas na etapa 5.</li>
		<li>Clique em Analisar > Definir Medidas. Área de verificação, densidade integrada, valor cinza médio e descritores de forma.</li>
		<li>Use o canal Cy5 para identificar o núcleo. Clique em Seleções à mão livre para usar a ferramenta de seleção livre para delinear o núcleo.</li>
		<li>Clique em Analisar > Medir no canal Cy5. O valor medido da Média é a intensidade da mancha nuclear. O valor medido de Circ. é a circularidade nuclear.</li>
		<li>Para comparar a intensidade da mancha nuclear em diferentes estados de força, toda a intensidade da mancha nuclear é dividida pela intensidade da mancha nuclear em "before_small_force.nd2" para gerar a intensidade da mancha nuclear normalizada.</li>
	</ol></li>
</ol>

Não há conflitos de interesse a declarar.

A internalização das microesferas magnéticas (secção 2.2) é crítica porque as microesferas extracelulares não podem aplicar força diretamente ao núcleo. A aplicação de força e a imagem (secção 5.3) são etapas críticas nesta experiência, e a força necessária para deformar o núcleo e induzir consequências biológicas significativas pode ser dependente da amostra. A magnitude da força neste experimento (0,8 nN e 1,4 nN) pode ser aumentada ainda mais para desencadear a detecção de mecano nuclear em células menos sensíveis.</p...

Este estudo tem como objetivo desenvolver e aplicar uma nova técnica para elucidar a mecanobiologia do núcleo, combinando os atuadores magnéticos que aplicam força mecânica diretamente no núcleo celular e a microscopia de fluorescência confocal que simultaneamente visualiza as alterações estruturais e funcionais subcelulares. As células detectam sinais biofísicos extracelulares, incluindo rigidez tecidual 1,2,3,4, pressão do fluido intersticial e tensão de cisalhamento 5,6,7, topologia/geometria da superfície 8,9,10,11,12 e tensão de tensão/compressão13,14, 15,16. Os sinais biofísicos são convertidos em sinais bioquímicos e desencadeiam potenciais alterações a jusante da expressão gênica e dos comportamentos celulares - um processo conhecido como mecanotransdução 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Para estudar os processos de mecanotransdução, uma infinidade de técnicas foram desenvolvidas para aplicar força mecânica nas células, como microscopia de força atômica28, dispositivo de alongamento celular29, sensor de força bio-MEMS (sistemas microeletromecânicos) 15,30,31, reologia de cisalhamento 32 e Sistema de Visão Estéreo 33 . Uma revisão recente resume as abordagens para aplicar pistas mecânicas extracelulares e interferir no mecananosense34. Até o momento, a maioria desses métodos aplica força na membrana plasmática celular, e as células recebem diretamente esses sinais biofísicos extracelulares por meio de receptores de membrana, como integrina, caderina, canais iônicos e receptores acoplados à proteína G. Posteriormente, eles transmitem o sinal para o citoesqueleto e núcleo intracelular. Por exemplo, usando a translocação de proteína associada ao sim (YAP) como um indicador de mecanosensoriamento, as células mostram sentir os sinais mecânicos de rigidez do substrato e tensão extracelular da membrana celular e transmiti-los através do citoesqueleto para o núcleo para induzir a translocação citoplasma para núcleo YAP28,35.
Evidências recentes sugerem que o próprio núcleo celular é um mecano-sensor independente 8,36,37. Isso é comprovado por experimentos realizados no núcleo isolado colhido de células, onde foi revelado que os núcleos mudam adaptativamente sua rigidez em resposta à força mecânica diretamente aplicada sobre eles36. Durante muitas condições fisiológicas, os núcleos em células tumorais e saudáveis detectam sinais biofísicos extracelulares e alteram suas propriedades mecânicas e montagens38,39,40. Por exemplo, após o extravasamento, a rigidez nuclear das células tumorais diminui e mantém a maciez por mais de 24 h38. Durante a migração através do espaço intersticial confinado, os núcleos das células tumorais frequentemente perdem e recuperam sua integridade estrutural39. No entanto, a forma como o núcleo detecta o sinal biofísico é desconhecida, embora várias proteínas do envelope nuclear e famílias de proteínas tenham sido encontradas envolvidas, como a lamina A / C e o ligador do complexo nucleoesqueleto e citoesqueleto (LINC)38,41. Assim, novos métodos não invasivos que podem aplicar força diretamente ao núcleo dissociarão o efeito da transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto e ajudarão a elucidar os mecanismos moleculares anteriormente inacessíveis do mecanismo nuclear.
Pesquisas que empregaram pinças ópticas para manipular organelas42 e microesferas injetadas nas células43 mostraram a capacidade tecnológica de aplicar diretamente força no núcleo. No entanto, a técnica óptica-pinça tem várias limitações: (1) pinças ópticas de baixo rendimento geralmente manipulam apenas uma célula ou microesferas de cada vez; e (2) o potencial fotodano e a temperatura artefato-deformação do nuclear requerem dezenas de pN36, e a potência necessária correspondente do laser é de cerca de 10 mW por pN44,45. Essa intensidade de laser é suficiente para desencadear fotodanos nas células e perturbar as funções celulares durante o experimento46.
A força magnética aplicada através de microesferas dentro de células vivas mostra o potencial de aplicar força diretamente no núcleo e supera as limitações das pinças ópticas. Uma vez que as microesferas são entregues no citoplasma, um campo magnético pode exercer uma força magnética em várias microesferas simultaneamente de uma maneira de alto rendimento. O campo magnético não influencia as funções celulares47, mas gera força de pN a nN, o que é suficiente para induzir a deformação nuclear 36,48,49. Até o momento, a manipulação de microesferas magnéticas tem sido aplicada na membrana plasmática celular48, no interior do citoplasma50, na actina F51, no interior do núcleo47 e no núcleo isolado36. No entanto, a manipulação magnética de microesferas nunca foi usada para aplicar força mecânica direta no envelope nuclear para estudar a mecanotransdução no núcleo.
Neste trabalho, uma técnica simples é desenvolvida para entregar microesferas magnéticas no citoplasma de forma não invasiva e usar essas microesferas para aplicar força mecânica no núcleo (Figura 1). Aqui, linhagens celulares B2B humanas normais projetadas por CRISPR/Cas9 que expressam endogenamente o YAP marcado com mNeonGreen21-10/11 são usadas para validar o método. A YAP é uma proteína mecano-sensível, e a translocação da YAP é regulada pela detecção mecânica nuclear14,28. A abordagem knock-in regulada por CRISPR/Cas9 foi escolhida para marcar YAP endógeno com uma proteína fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Embora a edição CRISPR seja conhecida por ter eficiência incompleta e efeito fora do alvo, os protocolos em publicações anteriores integraram a classificação por fluorescência para selecionar a inserção correta do quadro de leitura aberta52,53,54. Com essa camada adicional de seleção, nenhum evento de marcação fora do alvo foi observado em mais de 20 linhagens celulares geradas anteriormente52,53,54,55. Esta é uma construção de proteína fluorescente dividida, mas, em princípio, qualquer tag fluorescente expressável poderia ser utilizável. Esta abordagem de marcação é superior aos métodos transgênicos ou de anticorpos. Primeiro, ao contrário da expressão transgênica, a proteína marcada mantém a dosagem do gene de cópia única e se expressa no contexto fisiológico da rede reguladora de genes nativos, limitando desvios na concentração, localização e interação da proteína. O método de marcação usado neste estudo alcança uma taxa de transferência e eficiência mais altas do que a marcação completa de FP. Também evita desafios associados à imunofluorescência devido a artefatos de fixação e à disponibilidade limitada de anticorpos de alta qualidade e alta especificidade. Em segundo lugar, a abordagem usada neste artigo faz uma perturbação mínima para a fisiologia celular e permite a revelação em tempo real de todos os YAPs endógenos autenticamente. Em contraste, outros métodos transgênicos comuns muitas vezes levam à superexpressão de YAP. A distribuição artificial resultante pode potencialmente causar citotoxicidade e afetar a detecção mecanogênica das células56,57,58.
Este estudo apresenta um protocolo para aplicar diretamente força sobre o núcleo através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas. Em resumo, os protocolos aqui apresentados demonstram como (1) entregar microesferas magnéticas na célula enquanto estão fora do núcleo, (2) manipular as microesferas para aplicar força magnética no núcleo, (3) realizar imagens fluorescentes confocais das células durante a manipulação e (4) analisar quantitativamente a relação YAP nuclear/citoplasma (N/C) durante todo o processo de aplicação da força. Os resultados sugerem que (1) através da endocitose, as microesferas magnéticas podem ser entregues de forma não invasiva no citoplasma das células B2B dentro de 7 h (Figura 2 e Figura 3); e (2) a força magnética quantificada aplicada diretamente no núcleo (Figura 4, Figura 5 e Figura 6) isoladamente pode desencadear diversas alterações da relação N/C YAP em células B2B projetadas por CRISPR/Cas9 (Figura 7 e Figura 8).

<table><tbody><tr><td>0,05 % Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>frasco Corning</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>7-&micro; m microesferas de ferro carbonílico de diâmetro médio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>A1R sistema confocal</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl Iron Powder CM</td><td>BASF</td><td>30042253</td><td>Meio de cultura de microesferas magnéticas</td></tr><tr><td>(RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Computador desktop</td><td>Dell</td><td></td><td>com sistema operacional Windows 10</td></tr><tr><td>Câmara ambiental TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>Institutos Nacionais de Saúde e o Laboratório de Instrumentação</td><td></td><td></td>Óptica e Computacional</tr><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Ímã</td><td>K& J Magnetics, Inc.</td><td>D99-N52</td><td></td></tr><tr><td>Monocromático&nbsp; Câmera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements plataforma</td><td>de software Nikon plataforma de software</td><td>Máscara</td><td></td></tr> de núcleo <tr><td>Máscara de https://github.com/KOLIUG/Nuclear macro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ NucSpot Live 650</td><td>Biotium</td><td>#40082</td><td>Coloração nuclear</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tamponado com fosfato solução salina (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ mover (arquivos CAD)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td></tr></tbody></table>

combinando o atuador de força magnética 3d e a imagem de fluorescência multifuncional para estudar a mecanologia do núcleo

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Uma questão fundamental na mecanobiologia é como as células vivas sentem estímulos mecânicos extracelulares no contexto da fisiologia e patologia celular. Acredita-se que a sensação mecano-celular de estímulos mecânicos extracelulares seja através dos receptores de membrana, do complexo proteico associado e do citoesqueleto. Avanços recentes na mecanobiologia demonstram que o núcleo celular no próprio citoplasma pode sentir independentemente estímulos mecânicos simultaneamente. No entanto, falta uma compreensão mecanicista de como o núcleo celular detecta, transduz e responde a estímulos mecânicos, principalmente por causa dos desafios técnicos no acesso e quantificação da mecânica do núcleo por ferramentas convencionais. Este artigo descreve o projeto, fabricação e implementação de um novo atuador de força magnética que aplica estímulos mecânicos 3D precisos e não invasivos para deformar diretamente o núcleo celular. Usando células modificadas por CRISPR/Cas9, este estudo demonstra que esta ferramenta, combinada com imagens fluorescentes confocais de alta resolução, permite a revelação da dinâmica em tempo real de uma proteína associada ao sim (YAP) mecanósquia em células individuais em função da deformação do núcleo. Este método simples tem o potencial de preencher a lacuna tecnológica atual na comunidade de mecanobiologia e fornecer respostas para a lacuna de conhecimento que existe na relação entre a mecanotransdução do núcleo e a função celular.

Projeto de um dispositivo de movimento magnético e aplicação de força magnética Para aplicar força no núcleo através das microesferas magnéticas, um dispositivo de movimento magnético foi projetado e construído para controlar a posição espacial do ímã. O dispositivo de movimento magnético contém uma estrutura central, três botões e trilhos para mover o ímã conectado nas direções x, y e z independentemente na resolução espacial de 1,59 mm por ciclo (Figura 1A). Uma vez que...

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Neste método, a força é aplicada diretamente ao núcleo. Isso desacopla o efeito de transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto, revelando os mecanismos moleculares do mecanosense nuclear. A força é aplicada dentro das células vivas de forma não invasiva.Em comparação com as pinças ópticas, o campo magnético e a força magnética não afetam as funções celulares e têm maior rendimento. Comece a cultivar as células com microesferas magnéticas pesando 0,2 gramas de microesferas de ferro carbonila com sete micrômetros de diâmetro médio. Suspenda as microesferas em um meio de cultura RPMI 1640 mililitro usando uma pipeta.Em seguida, leve a placa de Petri com células B2B para o armário de biossegurança e adicione rapidamente 200 microlitros do meio contendo microesferas na placa de Petri. Coloque a placa de Petri em uma incubadora até que as microesferas sejam internalizadas pelas células. Abra o microscópio invertido e, usando imagens de fluorescência confocal, determine o tempo ideal para a internalização das linhagens celulares a cada seis horas, visualizando o limite de microesferas, nucleares e celulares.As microesferas internalizadas estarão presentes dentro do limite celular. Para aplicativos de pequena força e imagens de células vivas, abra o aplicativo de software Elements. Para definir a configuração de localização magnética, clique no botão um sobre dois para definir a velocidade de digitalização para um quadro a cada dois segundos.Defina o tamanho do orifício para 1,2 unidade Airy. Verifique apenas o canal FITC e defina PMT HV como 70, deslocado como zero, intensidade do laser como 10. Para definir o núcleo YAP magnético de configuração, defina a velocidade de digitalização para um quadro a cada quatro segundos clicando no botão um sobre quatro.Em seguida, clique no botão da unidade 1.2 Airy para definir o tamanho do orifício para a unidade 1.2 Airy e verifique o canal FITC. Defina PMT HV como 70, deslocado como zero, intensidade do laser como 10. Para obter imagens do limite do núcleo e da intensidade da mancha nuclear, verifique o canal 5 da cianina 5.Não clique no botão da unidade 1.2 Airy e defina PMT HV para 70, deslocamento para zero e intensidade do laser para 10. O tamanho do orifício será otimizado para imagens tridimensionais de proteínas associadas ao YES. Em seguida, ative o DIA por meio de Elementos.Abra a visualização de rotação, use um campo brilhante e ajuste o foco do objeto para obter uma imagem clara em foco das células. Use um objetivo de 10X para encontrar várias células únicas apropriadas em três condições, como uma célula com uma única microesferas dentro, com várias microesferas dentro e sem nenhuma microesferas dentro. Em seguida, mude para a objetiva 40X e nomeie essa posição com o número de posição apropriado.Abra Elementos, clique em localizar magnético, remova o intertravamento, digitalize as guias e selecione os botões superior e inferior para ajustar a posição Z do plano focal para definir o limite inferior e superior para a pilha Z das células selecionadas. Pare a digitalização clicando em Analisar novamente. Alterne para a configuração do núcleo magnético YAP e defina o nome do arquivo como before_small_force.nd2.Clique no botão Executar com a pilha Z gravada. Alterne para o caminho da luz à direita e ligue o DIA. Abra a visualização de rotação e clique no botão de gravação.Mova o ímã para 46 milímetros acima do fundo da placa de Petri girando o botão do dispositivo de movimento do ímã. Salve e verifique o vídeo para confirmar o deslocamento de microesferas induzido pela força magnética. Repita o procedimento de varredura definindo o nome do arquivo como after_small_force.nd2.Em seguida, alterne para o caminho de luz à direita, ative o DIA e abra a visualização de rotação antes de clicar no botão de gravação. Gire o botão do dispositivo móvel do ímã até 120 milímetros acima da parte inferior da placa de Petri e salve uma sequência de imagens ou vídeos de campo brilhante. Repita as etapas de varredura definindo o nome do arquivo como before_large_force.nd2.As microesferas não podem emitir fluorescência sob excitação a laser no canal FITC ou cianina 5. Assim, as microesferas internalizadas foram identificadas pelo oco escuro localizado na imagem confocal de fluorescência da proteína e núcleo associados ao YES. A circularidade nuclear não mostrou diferença significativa entre as células de controle e as células com internalização de microesferas.A relação núcleo-citoplasma de células proteicas associadas ao YES de células de controle co-cultivadas com microesferas, mas sem internalização, e células com internalização de microesferas também não mostrou diferença significativa. A deformação do núcleo e a despolimerização da actina foram causadas pela força de compressão aplicada pelas microesferas em células contendo citoesqueleto. A curva de calibração da análise quantitativa de imagens fornecida pela relação quantitativa de deslocamento da força AFM.Com base nessa relação, estimou-se a força aplicada das contas. A deformação do núcleo e a translocação proteica associada ao YES foram observadas na aplicação ou liberação da força magnética. As mudanças de intensidade na proteína associada ao SIM no canal verde e nenhuma alteração na coloração do núcleo no canal vermelho confirmaram que a deformação nuclear induzida pela força magnética desencadeada pela translocação de proteína associada ao YES.A quantificação da mudança líquida da relação núcleo/citoplasma da proteína associada ao YES dentro de dois grupos confirmou que a força magnética aplicada às microesferas dentro do citoplasma induziu a translocação de proteínas associadas ao YES e alterou a relação núcleo-citoplasma da proteína associada ao YES. Antes de aplicar força e imagem, certifique-se de que as células internalizaram as microesferas magnéticas e as contas estão dentro do limite celular.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.

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Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Aprenda a aplicar força mecânica diretamente no núcleo celular usando microesferas magnéticas e imagem de fluorescência confocal. Este método não invasivo revela mecanismos de mecanossensibilidade nuclear em células vivas.

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