Name: Preparação de RNAs Longos Citoplasmáticos e Nucleares a partir de Células Primárias e Cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda a isolar RNAs nucleares e citoplasmáticos de células cultivadas com este protocolo eficiente e econômico. Valide a qualidade por qPCR e estude interações intracelulares relevantes para pesquisas em biologia celular e câncer.

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Apoiado por doações da Sociedade Americana de Hematologia, da Fundação Robert Wood Johnson, da Fundação de Caridade Doris Duke, da Fundação Edward P. Evans e do Instituto Nacional do Câncer (1K08CA230319).

As células K562 são utilizadas para o presente estudo. Este protocolo foi otimizado para funcionar para 1 x 10 6-5 x 106 milhões de células. No entanto, o procedimento pode ser ampliado para quantidades maiores de células, aumentando os volumes adequadamente.
1. Preparação do tampão de lise 0.25x
<ol><li>Preparar tampão de lise 0,25x misturando os seguintes componentes fornecidos na Tabela 1A. NOTA: As amostras requerem aproximadamente 300 μL de tampão de lise 0,25x. Volume recomendado = número de amostras x 300 μL.</li>
</ol>2. Separação das frações nuclear e citoplasmática
<ol><li>Pellet as células usando tubos de 1,5 mL via centrifugação por 5 min a 2000 x g (temperatura ambiente). Rejeitar o sobrenadante utilizando uma pipeta aspirante. NOTA: As células K562 foram utilizadas durante este protocolo. No entanto, o protocolo pode ser adaptado a várias linhagens celulares.</li>
	<li>Ressuscite o pellet em 300 μL de tampão de lise gelado 0,25x. NOTA: Mantenha no gelo por 2 min e gire o tubo a cada 45 s para garantir a lise adequada das células.</li>
	<li>Gire os tubos à velocidade mais alta (12.000 x g) a 4 °C durante 2 minutos.</li>
	<li>Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e coloque-o em um novo tubo de 1,5 mL. Esta será a fração citoplasmática. Aproximadamente 300 μL da fração citoplasmática serão atingidos.</li>
	<li>O pellet restante será a fração nuclear. Adicionar 500 μL de PBS gelado ao pellet e centrifugar a 2.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Observação : durante esta etapa, o excesso de DNA é removido.</li>
</ol>3. Limpeza de RNA usando um kit de purificação de RNA
NOTA: Este protocolo foi alcançado utilizando um kit de purificação de RNA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
<ol><li>Separe as amostras de RNA citoplasmático e as amostras citoplasmáticas nucleares (pois as etapas de fracionamento variam entre elas).<ol><li>Para separar a fração citoplasmática, adicione 1.050 μL de tampão de lise RLT de 3,5x (ver Tabela de Materiais) e vórtice brevemente. Em seguida, adicione 750 μL de etanol a 90% e carregue-o na coluna do kit de limpeza de RNA. NOTA: A solução deve ser bem misturada antes de ser carregada na coluna.</li>
		<li>Para separar a fração nuclear, adicione 600 μL de tampão de lise 3,5x e vórtice. Em seguida, adicione 600 μL de etanol a 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregue frações citoplasmáticas e nucleares em colunas de RNA (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para o restante da etapa 3, as amostras citoplasmáticas e nucleares seguem o mesmo procedimento. No entanto, certifique-se de que essas amostras permaneçam independentes umas das outras.<ol><li>Carregue frações citoplasmáticas e nucleares em colunas de RNA e gire por 30 s a 8.000 x g à temperatura ambiente. Descarte o excesso de fluxo.</li>
		<li>Adicione 350 μL de tampão de lavagem de um kit de purificação comercialmente disponível (tampão RW1, consulte Tabela de Materiais), gire novamente e descarte o fluxo.</li>
		<li>Adicionar solução de DNAse (1U/uL) durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 350 μL de tampão de lavagem, gire novamente e descarte o fluxo.</li>
		<li>Adicione 500 μL de tampão de lavagem suave (PSE, consulte Tabela de materiais), gire novamente e descarte o fluxo. Adicione 500 μL de tampão de lavagem suave, gire novamente, mas apenas por 2 min.</li>
		<li>Mova a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 30 μL de água à coluna de spin. Deixe a coluna descansar por 1 minuto antes de girar.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Validação da separação nuclear-citoplasmática
<ol><li>Realizar a síntese de cDNA<ol><li>Uma vez que os compartimentos subcelulares do RNA tenham sido extraídos e purificados, confirme a separação dos compartimentos usando qPCR. Para fazer isso, primeiro, converta o RNA em cDNA usando um kit comercialmente disponível seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais).</li>
		<li>Prepare o mastermix da transcriptase reversa. Adicione o modelo de RNA. Incubar reações em um termociclador. NOTA: Para hexâmeros aleatórios, os parâmetros de ciclagem utilizados são fornecidos no Quadro 2A. Utilizar imediatamente a reação da transcriptase reversa ou conservar a -20 °C (Tabela 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e análise.<ol><li>Diluir a síntese de cDNA com água DEPC (ver Tabela de Materiais) para ter uma concentração final de 20 ng/mL.</li>
		<li>Usando uma mistura mestra de PCR, prepare a reação para cada amostra usando instruções manuais, conforme listado abaixo.</li>
		<li>Adquirir sondas comerciais necessárias para detectar o fracionamento citoplasmático e nuclear. Use MALAT1 como marcador nuclear e TUG1 como marcador citoplasmático (ver Tabela de Materiais). NOTA: As sequências para MALAT1 e TUG1 são fornecidas na Tabela 3.</li>
		<li>Calcular o volume de cada componente multiplicando cada componente por 3 para cada uma das repetições técnicas para a amostra individual.</li>
		<li>Para cada amostra nuclear e citoplasmática, adquirir as seguintes misturas para cada uma: (a) Fração nuclear com MALAT1, (b) Fração citoplasmática com MALAT1, (c) Fração nuclear com TUG1 e (d) Fração citoplasmática com TUG1 (Tabela 1C).</li>
		<li>Vórtice brevemente para misturar soluções e transferir 20 μL da mistura para cada poço de uma placa de reação óptica (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Cubra a placa com uma película adesiva transparente utilizada para qPCR (ver Tabela de Materiais) e centrifugar a placa brevemente para eliminar as bolhas de ar e, em seguida, girar a amostra para baixo a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Usando um software de projeto e análise (consulte Tabela de Materiais), selecione a curva padrão para os parâmetros de ciclagem (Tabela 2B).</li>
		<li>Usando o software qPCR, selecione Configurar execução (Figura 1 Suplementar).</li>
		<li>Na página Propriedades do Arquivo de Dados, selecione Método e parâmetros do ciclo de entrada na Tabela 2B (Figura 2 Suplementar).</li>
		<li>Depois de inserir os parâmetros do ciclo, selecione a guia Placa e insira as amostras a serem executadas (Figura 3 Suplementar). Selecione Iniciar Execução. NOTA: As etapas descritas foram executadas em uma máquina qPCR usando um master mix comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar análise de dados<ol><li>Após a conclusão da execução, crie uma planilha de dados com o nome da amostra, o nome do destino e o ciclo de quantificação (Cq) (Tabela Suplementar 1).</li>
		<li>Comece com as amostras MALAT1 para calcular a fração nuclear. Subtraia a fração citoplasmática MALAT1 da fração nuclear MALAT1 (Tabela 4).</li>
		<li>Em seguida, calcule o ΔCq (2^(-value)) (Tabela 5).</li>
		<li>Continue com as amostras de MALAT1 para calcular a fração citoplasmática, subtraia a fração nuclear MALAT1 da fração citoplasmática MALAT1 e, em seguida, calcule o ΔCq (2^(-value)) (Tabela 6). NOTA: Olhando para o ΔCq, observa-se que a fração MALAT1 nuclear (destaque verde) tem um marcador MALAT1 maior do que o citoplasma (realce vermelho), mas agora a confirmação é necessária para garantir que a fração citoplasmática é predominantemente citoplasmática e que a fração nuclear não contém contaminação citoplasmática.</li>
		<li>Com amostras de TUG1, execute o mesmo cálculo acima (etapas 4.3.2-4.3.4) (Tabela 7). NOTA: Olhando para o ΔCq, observa-se que a fração citoplasmática TUG1 (destaque verde) possui um marcador TUG1 maior que a fração nuclear (realce vermelho), confirmando assim uma boa separação das frações citoplasmática e nuclear (Tabela 8, Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li>
<li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+localization+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li>
<li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+separate+nuclear%2C+cytosolic%2C+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li>
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<li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+positioning+system%3A+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li>
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<li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).</li>
<li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li>
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<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li>
<li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+biogenesis%2C+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhuysen%2C+J-M+%22Bacterial+Cell+Wall%22">Bacterial Cell Wall</a>. , Elsevier. (1994).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Enzyme+Structure+and+Mechanism%22">Enzyme Structure and Mechanism</a>. , (1985).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+win+the+battle+with+RNase%22">How to win the battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li>
<li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selinexor%2C+a+first-in-class+XPO1+inhibitor%2C+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, Supplement 1 233(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Ao longo do protocolo, algumas medidas foram tomadas para otimizar os elementos para serem mais eficazes para a linhagem celular de interesse. Embora as etapas dentro do protocolo sejam relativamente simples, análises e pequenos ajustes durante aspectos críticos do protocolo podem ser necessários. A etapa mais crítica do protocolo é modificar a concentração do tampão de lise para uma concentração adequada com base na linhagem celular de interesse e no alvo celular. Como a utilização do tampão de lise depende em grande pa...

O fracionamento celular em componentes subcelulares permite o isolamento e o estudo de domínios bioquímicos definidos e auxilia na determinação da localização de processos celulares específicos e como isso pode afetar sua função1. O isolamento do RNA de diferentes localizações intracelulares pode permitir uma melhor precisão da análise genética e bioquímica dos eventos do nível de transcrição e outras interações entre o núcleo e o citoplasma, que serve como o objetivo principal do protocolo atual2. Este protocolo foi desenvolvido para garantir o isolamento de RNAs citoplasmáticos e nucleares para determinar seus respectivos papéis na exportação nuclear e para entender como a localização subcelular de RNAs no núcleo e citoplasma pode afetar sua função nos processos celulares. Utilizando materiais de um ambiente laboratorial típico, foi possível alcançar o fracionamento nuclear e citoplasmático de forma mais eficaz e menos dispendiosa do que os protocolos previamente estabelecidos, sem comprometer a qualidade dos resultados3.
Além disso, a troca de moléculas entre o citoplasma e o núcleo pode ser estudada diretamente separando essas regiões. Mais especificamente, a compreensão do transcriptoma é essencial para a compreensão do desenvolvimento e da doença. No entanto, os RNAs podem estar em diferentes níveis de maturação a qualquer momento e podem complicar a análise a jusante. Este protocolo permite a capacidade de isolar o RNA das frações subcelulares nucleares e citoplasmáticas, o que pode auxiliar nos estudos de RNA e permitir uma melhor compreensão de um RNA particular de interesse, como a localização de RNAs não codificantes ou a análise de junções de emenda dentro do núcleo.
Este protocolo foi otimizado para isolar RNAs longos citoplasmáticos e nucleares, incluindo mRNAs, rRNAs e RNAs longos não codificantes (lncRNAs), devido à seletividade de tamanho da coluna de purificação de RNA utilizada, que pode ser modificada para isolar outros RNAs de interesse. Anteriormente, a função de RNAs longos, como mRNAs e lncRNAs, dependia muito de sua respectiva localização dentro da célula 4,5. Portanto, o estudo da exportação do núcleo para os domínios subcelulares tornou-se mais direcionado para a compreensão do papel que a exportação de RNA ou outros componentes celulares pode ter na célula. Os lncRNAs servem como um excelente exemplo disso, pois sua tradução e efeitos subsequentes dependem em grande parte da proximidade e interações com outras formas de RNA6. Além disso, a troca de elementos celulares entre regiões nucleares e citoplasmáticas está ligada a mecanismos de resistência a diversos tratamentos contra o câncer7. O isolamento dos compartimentos intracelulares tem permitido o desenvolvimento de inibidores nucleares de exportação, o que tem diminuído os efeitos dos mecanismos de resistência a diferentes terapias8.
Após a separação do RNA nuclear e citoplasmático, são realizadas etapas para purificar o RNA de interesse. Como os kits de purificação de RNA são comumente encontrados em laboratórios e funcionam para purificar e isolar RNAs longos, eles servem bem ao propósito deste protocolo. Para a purificação de RNA, gerar proporções de 260:280 maiores que 1,8 é fundamental para garantir a qualidade das amostras para sequenciamento de RNA ou outros procedimentos similares que exijam altos níveis de pureza e isolamento. Valores irregulares de 260:280 indicam contaminação por fenol, demonstrando mau isolamento e resultados imprecisos9.
Uma vez que a purificação do RNA esteja completa e os valores de 260:280 estejam confirmados acima de uma faixa aceitável, a qPCR foi utilizada para validar os resultados de isolamento das frações nuclear e citoplasmática. Para tanto, foram utilizados primers específicos para a região de interesse para demonstrar os níveis de fracionamento nuclear e citoplasmático. Nesse protocolo, MALAT1 e TUG1 foram utilizados como marcadores nucleares e citoplasmáticos, respectivamente10. Juntos, eles permitem a demonstração de altos níveis de fracionamento nuclear com MALAT1, enquanto o fracionamento citoplasmático deve ser baixo. Por outro lado, quando o TUG1 é usado, espera-se que os níveis de fracionamento citoplasmático sejam maiores do que os níveis de fracionamento nuclear.
Utilizando este protocolo, foi possível isolar RNAs com base em sua posição de ação dentro da célula. Devido ao amplo acesso a muitos materiais e à utilização de apenas tampão de lise e técnicas de centrifugação baseadas em densidade durante este experimento, a aplicabilidade a outros tipos de RNA e outros componentes celulares é generalizada. Isso pode fornecer informações importantes, lançando luz sobre eventos de expressão específicos do local que, de outra forma, seriam indistinguíveis sem separação.

<table><tbody><tr><td>Agilent Tapestation</td><td></td><td>Agilent G2991BA</td><td>O sistema Agilent TapeStation é uma solução de eletroforese automatizada para o controle de qualidade de amostras de DNA e RNA.</td></tr><tr><td>0,5% Nonidet P-40</td><td>Thermo-Fischer</td><td>28324</td><td>Usado na fabricação de tampão de lise</td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 8,0</td><td>Thermo-Fischer</td><td>15568025</td><td>Usado na fabricação de tampão de lise</td></tr><tr><td>MALAT1 GE Ensaio</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00273907_s1</td><td>Utilizado para confirmação da fração nuclear.</td></tr><tr><td>Placa de Reação Óptica MicroAmp de 96 Poços com Código de Barras</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4326659</td><td>A Placa de Reação Óptica MicroAmp de 96 Poços com Código de Barras da Applied Biosystems é otimizada para fornecer precisão e uniformidade de temperatura incomparáveis para amplificação rápida e eficiente de PCR. Esta placa, construída a partir de uma única peça rígida de polipropileno em um formato de 96 poços, é compatível com os sistemas de PCR em tempo real de 96 poços da Applied Biosystems e termocicladores.</td></tr><tr><td>Filme Adesivo Óptico MicroAmp</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4311971</td><td>O Filme Adesivo Óptico MicroAmp da Applied Biosystems reduz a chance de contaminação poço a poço e evaporação da amostra quando aplicado a uma microplaca durante o qPCR</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-023</td> A <td>solução salina tamponada com fosfato (PBS) é uma solução salina balanceada que é usada para uma variedade de aplicações de cultura de células, como lavagem de células antes da dissociação, transporte de células ou amostras de tecido, diluição de células para contagem e preparação de reagentes.</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de RNA Qiagen - Mini kit Rneasy Os</td> kits de limpeza de RNA <td>Qiagen</td><td>74106</td><td>permitem a limpeza eficiente de RNA de reações enzimáticas e a limpeza de RNA purificado por diferentes métodos. Inclui buffers RW1, RLT, RW1 mencionados em todo o protocolo.</td></tr><tr><td>Software qPCR QuantStudio 6</td><td>Thermo-Fischer</td><td>A43180</td><td>utilizado durante o protocolo. Inclui software de design e análise para analisar amostras de fracionamento</td></tr><tr><td>Tampão RLT Tampão</td> de lise <td>Qiagen</td><td>79216</td><td>do kit de limpeza de RNA</td></tr><tr><td>Tampão RPE Tampão</td><td>de lavagem 1018013</td><td>Qiagen</td><td>do kit de limpeza de RNA</td></tr><tr><td>Tampão RW1 Tampão</td> de lavagem <td>Qiagen</td><td>1053394</td><td>do kit de limpeza de RNA</td></tr><tr><td>Ensaios de expressão gênica Taqman</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4331182</td><td>Os ensaios de expressão gênica TaqMan da Applied Biosystems representam a maior coleção de ensaios pré-projetados do setor, com mais de 2,8 milhões de ensaios em 32 espécies eucarióticas e vários micróbios. Os ensaios de expressão gênica TaqMan permitem que você obtenha resultados rapidamente, sem perda de tempo otimizando os primers SYBR Green e sem tempo extra gasto executando e analisando curvas de fusão.</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4305719</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix é a solução de reagente ideal quando você precisa de uma mistura mestre para várias aplicações de DNA de nuclease de 5 '. Os reagentes da Applied Biosystems foram validados com ensaios TaqMan e sistemas em tempo real da Applied Biosystems para garantir sempre um desempenho sensível, preciso e confiável.</td></tr><tr><td>Ensaio TUG1 GE</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00215501_m1</td><td>Utilizado para confirmação da fração citoplasmática.</td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC UltraPure A água tratada com DEPC</td><td>Thermo-Fischer</td><td>750024</td><td>UltraPure é adequada para uso com RNA. É preparado por incubação com dietilpirocarbonato (DEPC) a 0,1% e, em seguida, é autoclavado para remover o DEPC. Filtrado estéril.</td></tr></tbody></table>

preparação de rnas longos citoplasmáticos e nucleares a partir de células primárias e cultivadas

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

A separação de componentes intracelulares tem sido uma ferramenta fundamental na biologia celular há muitos anos e tem sido capaz de fornecer informações úteis sobre como sua localização pode afetar sua função. Em particular, a separação do RNA nuclear e citoplasmático tornou-se importante no contexto das células cancerosas e na busca para encontrar novos alvos para drogas. A compra de kits para extração de RNA nuclear-citoplasmático pode ser dispendiosa quando muitos dos materiais necessários podem ser encontrados em um ambiente de laboratório típico. Usando o método atual, que pode substituir kits mais caros ou outros processos demorados, apenas um tampão de lise caseiro, uma centrífuga de bancada e colunas de purificação de isolamento de RNA são necessárias para isolar o RNA nuclear e citoplasmático. O tampão de lise é usado para lisar suavemente a membrana externa da célula sem afetar a integridade do envelope nuclear, permitindo a liberação de seus componentes intracelulares. Em seguida, os núcleos podem ser isolados por uma simples etapa de centrifugação, uma vez que possuem uma densidade maior do que a solução de lise. A centrifugação é utilizada para separar essas áreas com base em suas diferenças de densidade para isolar elementos subcelulares no núcleo daqueles no citoplasma. Uma vez que a centrifugação tenha isolado os diferentes componentes, um kit de limpeza de RNA é utilizado para purificar o conteúdo de RNA, e qPCR é realizada para validar a qualidade da separação, quantificada pela quantidade de RNA nuclear e citoplasmático nas diferentes frações. Níveis estatisticamente significativos de separação foram alcançados, ilustrando a eficácia do protocolo. Além disso, este sistema pode ser adaptado para o isolamento de diferentes tipos de RNA (RNA total, pequeno, etc.), o que permite o estudo direcionado das interações citoplasma-núcleo e auxilia na compreensão das diferenças na função do RNA que residem no núcleo e no citoplasma.

Para garantir que o isolamento nuclear e citoplasmático tivesse sido alcançado, uma qPCR foi realizada para validar os resultados. Para tanto, foram utilizados primers específicos da região de interesse para demonstrar os níveis de fracionamento nuclear e citoplasmático. Neste estudo, MALAT1 e TUG1 foram utilizados como primers nucleares e citoplasmáticos, respectivamente. Juntos, eles permitem a demonstração de altos níveis de fracionamento nuclear com MALAT1 como um controle positivo para elementos nucleares, enquanto ...

O presente protocolo oferece um método eficiente e flexível para isolar o RNA das frações nucleares e citoplasmáticas usando células cultivadas e, em seguida, validar usando qPCR. Isso efetivamente serve como um substituto para outros kits de preparação de RNA.

Preparação de RNAs Longos Citoplasmáticos e Nucleares a partir de Células Primárias e Cultivadas

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Este protocolo é necessário para avaliar os diferentes papéis de elementos bioquímicos definidos no núcleo e citoplasma e para analisar as interações intracelulares entre esses domínios dentro de várias linhagens celulares. Esta técnica utiliza equipamentos de laboratório comuns e reagentes para separar de forma mais eficiente as frações citoplasmática e nuclear. Este protocolo pode fazê-lo de forma menos dispendiosa e mais rápida do que outros protocolos.À medida que os estudos sobre interações citoplasmáticas e nucleares se tornam mais difundidos, o impacto da localização nos eventos intracelulares pode se tornar melhor compreendido. A troca entre o citoplasma e o núcleo pode ser analisada, indicando se certas moléculas durante essas trocas podem levar ao desenvolvimento do câncer, como estudos sobre proteínas nucleares indicaram. A etapa mais crítica do protocolo é modificar a concentração do tampão de lise para uma concentração adequada.Como o uso do tampão de lise depende em grande parte da ruptura das membranas celulares e há variantes naturais na eficácia do tampão de lise em diferentes linhas celulares. Para começar, pellet as células, usando tubos de 1,5 mililitros via centrifugação por cinco minutos a 2000 G.Descartar o sobrenadante usando uma pipeta de aspiração. Ressuspeite o pellet em 300 microlitros de tampão de lise gelado.Em seguida, gire os tubos a uma velocidade de cerca de 12.000 G a quatro graus Celsius por dois minutos. Retire cuidadosamente o sobrenadante e coloque-o em um novo tubo de 1,5 mililitros. O pellet restante será a fração nuclear.Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS gelado ao pellet e centrífuga a 2000 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Para confirmar a separação dos compartimentos usando qPCR, primeiro, converta o RNA em DNA complementar usando um kit comercialmente disponível. Prepare a mixagem mestre da transcriptase reversa.Adicione o modelo de RNA. Incubar reações em um termociclador. Prossiga para a realização de reação e análise quantitativa em cadeia da polimerase.Comece diluindo a síntese de cDNA com água DEPC para ter uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro. Usando uma mistura mestra de PCR, prepare a reação para cada amostra usando instruções manuais. Adquirir sondas comerciais necessárias para detectar o fracionamento citoplasmático e nuclear.Use MALAT1 como marcador nuclear e TUG1 como marcador citoplasmático. Calcular o volume de cada componente multiplicando cada componente por três para cada uma das repetições técnicas para a amostra individual. Para cada amostra nuclear e citoplasmática, adquirir as misturas fração nuclear com MALAT1, fração citoplasmática com MALAT1, fração nuclear com TUG1 e fração citoplasmática com TUG1.Vórtice brevemente para misturar soluções e transferir 20 microlitros da mistura para cada poço de uma placa de reação óptica. Cubra a placa com uma película adesiva transparente utilizada para qPCR e centrifugar a placa brevemente para eliminar bolhas de ar e, em seguida, gire a amostra para baixo a 300 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Usando o software de projeto e análise, selecione a curva padrão para os parâmetros de ciclismo.Usando o software qPCR, selecione executar configuração. Na página de propriedades do arquivo de dados, selecione os parâmetros do método e do ciclo de entrada. Depois de inserir os parâmetros do ciclo, selecione a guia da placa e insira as amostras a serem executadas.Selecione Iniciar execução. Após a conclusão da execução, crie uma planilha de dados com o nome da amostra, o nome do destino e o ciclo de quantificação. Comece com as amostras MALAT1 para calcular a fração nuclear.Subtraia a fração citoplasmática MALAT1 da fração nuclear MALAT1. Continue com as amostras de MALAT1 para calcular a fração citoplasmática. Subtraia a fração nuclear MALAT1 da fração citoplasmática MALAT1 e, em seguida, calcule as duas CQ delta elevadas. Execute os cálculos com amostras TUG1.Quando o TUG1 está presente como um controle positivo para elementos citoplasmáticos, espera-se que os níveis de fracionamento citoplasmático sejam superiores aos níveis de fracionamento nuclear. Um resultado negativo onde os níveis de fracionamento citoplasmático são observados na amostra com MALAT1. Isso indica contaminação do RNA isolado da fração nuclear, potencialmente devido a concentrações de lise que são muito baixas ou muito altas.MALAT1 e TUG1 apresentaram a maior correlação com a separação nuclear e citoplasmática, confirmada por meio de Western blot e eletroforese de RNA, que confirmou a pureza e a qualidade das amostras. Além disso, a pureza dos extratos nuclear e citoplasmático pode ser demonstrada por um Western blot usando lamina como marcador para fração nuclear e alfa-tubulina como marcador positivo para a fração citoplasmática. Não foi observado pico na eletroforese do RNA citoplasmático, demonstrando alta qualidade e pouca ou nenhuma contaminação na amostra de RNA citoplasmático.O uso do tampão de lise é fundamental para o fracionamento adequado e otimizar a concentração do tampão de lise para a linha celular desejada de interesse é essencial. Esta técnica permite o estudo direcionado da interação nuclear e citoplasmática, que é amplamente aplicável a uma variedade de tópicos de pesquisa e permite uma melhor compreensão de como a localização de elementos biológicos específicos pode se correlacionar com sua função.

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