Name: Avaliação da hipersensibilidade mecânica induzida por lesão nervosa em ratos usando um ensaio de dor operante orofacial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a avaliar hipersensibilidade mecânica em ratos com dor orofacial neuropática usando o dispositivo OPAD automatizado. Este método reduz o estresse animal e o viés do experimentador em pesquisa de neurociência.

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Este estudo é financiado pela Facial Pain Research Foundation.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida e cumpriram os padrões estabelecidos no National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Aqui, a avaliação da hipersensibilidade mecânica usando o OPAD é descrita usando um modelo de rato de dor orofacial neuropática. Um esquema da linha do tempo utilizada no estudo é mostrado na Figura 1. Todas as avaliações comportamentais foram realizadas por experimentadoras do sexo feminino.
1. Animais
<ol><li>Ratas Sprague-Dawley domésticas (n = 8/grupo, 150-200 g) em pares em uma sala com temperatura controlada (22 °C ± 1 °C) com um ciclo claro-escuro de 12 h:12 h. Fornecer comida e água ad libitum. Mantenha os ratos na instalação por 5 dias para aclimatação antes dos experimentos.</li>
	<li>Realizar os ensaios de dor operante no mesmo dia da semana e horário (9h-11h).</li>
	<li>No final dos experimentos, eutanasiar os ratos por decapitação após anestesia com isoflurano.</li>
</ol>2. Criação do OPAD
<ol><li>Coloque bandejas de gotejamento de leite, gaiolas de plexiglas e grades de piso de metal no OPAD. Anexe a fiação às gaiolas. Coloque o suporte da garrafa no poste de metal na parte de trás do dispositivo.</li>
	<li>Prepare uma proporção de 2:1 de água para leite condensado adoçado como solução de recompensa, abrindo uma lata de leite condensado adoçado e despejando-a em um copo de 1 L. Adicione ~600 mL de água da torneira a 300 mL de leite. Inicialmente mexa a solução usando uma colher e, em seguida, use uma barra de agitação e o agitador de placa quente. Em seguida, encha os frascos de recompensa com a solução de leite e mantenha a solução de leite em estoque a 4 °C. NOTA: Cubra a solução de leite em pó com um invólucro alimentar de plástico. Aqueça a solução de leite antes de cada utilização. A solução de leite de estoque na geladeira pode coagular após uma semana. Quando coagula, pode ocluir o tubo de lambida. Portanto, descarte-o e prepare uma nova solução de estoque.</li>
	<li>Coloque as garrafas de leite de recompensa no porta-garrafas e ajuste-as para que o bico possa ser alcançado pelo animal. Aperte o botão esquerdo do suporte para fixar o frasco no lugar.</li>
	<li>Ligue as gaiolas usando o interruptor no painel frontal.</li>
</ol>3. Configurando um protocolo e criando um arquivo de experimento
Observação : primeiro, configure o protocolo para executar o experimento. O protocolo descreve como o software ANY-maze executa o experimento.
<ol><li>Abra o software. Digite a senha. Clique em Log me on ou pressione Enter.</li>
	<li>Clique em Nova | de experimento vazia Menu Protocolo .<ol><li>Selecione o modo que este protocolo usará e nomeie o protocolo. Em Aparelho, clique em Protocolo sem nome, clique na seção selecione o modo que este protocolo usará e, em Modos específicos do equipamento, selecione Modo de gaiola mecânica OPAD e clique em OK. Em seguida, nomeie o protocolo (por exemplo, mecânico OPAD).</li>
		<li>Adicione gaiolas OPAD.<ol><li>Em Aparelho, clique em Aparelho | Adicionar item encontrado na parte superior do painel Protocolo | Nova gaiola OPAD | Adicione todas as gaiolas OPAD conectadas. NOTA: Antes de adicionar as gaiolas, certifique-se de que todas as gaiolas estão ligadas.</li>
		</ol></li>
		<li>Adicione estágios de teste de experimento.<ol><li>Em Teste, clique em Estágios | Primeiro estágio e nome Estágio (por exemplo, Dia de Linha de Base 1). Digite 10 min para a duração do teste. Para adicionar mais estágios, clique em Adicionar item encontrado na parte superior do painel Protocolo | Nova Etapa. NOTA: Cada etapa refere-se à sessão em que um ensaio é executado. Por exemplo, para 10 dias de treinamento, são necessárias 10 etapas. A duração do teste pode ser aumentada ou diminuída com base no delineamento experimental.</li>
		</ol></li>
		<li>Atribua grupos de tratamento.<ol><li>Em Informações Adicionais, clique em Grupos de tratamento. Verificar Utilizar grupos de tratamento | O usuário atribuirá manualmente os animais aos seus grupos. NOTA: O software referenciado (consulte a Tabela de Materiais) também permite que os animais sejam atribuídos aleatoriamente ou em uma ordem específica. Os experimentos podem ser executados às cegas. Para ver os grupos de tratamento atribuídos, desmarque Executar experimentos às cegas.</li>
		</ol></li>
		<li>Atribuir identificações de animais (ID).<ol><li>Clique no menu Protocolo ; em Informações Adicionais, clique em Animal ID e marque Usar minhas IDs para se referir a animais.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Clique no menu Experimentar .<ol><li>Digite um título de experimento.</li>
		<li>Nomeie os tratamentos clicando em Exibir tratamentos e digite os nomes dos tratamentos (por exemplo, Tratamento 1: CCI-ION, Tratamento 2: simulado).</li>
		<li>Adicione animais e atribua tratamentos e identificações de animais clicando em Exibir animais | Adicione animais, insira o número de animais que serão testados e clique em OK. Aguarde até que a lista de animais apareça e adicione identificações e tratamentos para cada rato. NOTA: Uma lista de status que aparece ao lado de ID do animal será definida como Normal no início do estudo. Os animais podem ser removidos posteriormente do cronograma de testes, alterando seu status para Aposentado ou Excluído.</li>
	</ol></li>
	<li>Salve o protocolo clicando no menu Protocolo | Salvar protocolo encontrado na parte superior do painel Protocolo . Digite o nome do arquivo e a senha do software (ANY-maze) e clique em Salvar. NOTA: Os protocolos salvos podem ser reutilizados para novos experimentos.</li>
	<li>Salve o arquivo de experimento clicando em Arquivo | Salve, digite a senha do software e clique em Salvar.</li>
</ol>4. Sessões de treinamento e teste de linha de base
NOTA: Traga ratos para a sala pelo menos 15 minutos antes do teste se a sala de testes comportamentais estiver na mesma instalação de alojamento de animais. Se eles forem transportados para uma sala de testes fora da instalação animal, dê aos ratos 1 h para se aclimatarem à sala.
<ol><li>Antes dos registros basais, treine os ratos nas OPADs por 2 semanas (5 dias / semana, 10 minutos / dia) para pressionar seus rostos contra as barras de metal cravadas para receber a solução de leite. NOTA: Uma imagem representativa de barras cravadas e um rato executando o ensaio é mostrada na Figura 2.</li>
	<li>Configure o equipamento OPAD.</li>
	<li>Ligue as gaiolas usando o interruptor no painel frontal. Procure a luz verde na gaiola, o que significa que a gaiola está pronta para testar.</li>
	<li>Clique duas vezes no arquivo de experimento salvo para abrir. Digite a senha. Clique em Log me on ou pressione Enter.</li>
	<li>Aguarde até que o menu Testes apareça. No lado esquerdo da tela, anote o número de animais e a gaiola correspondente (por exemplo, o animal 1 será testado na gaiola 1), o estágio que será executado naquele dia e o status do teste ("pronto"). No lado direito da tela, observe o gráfico de cada animal que mostra o número de lambidas e contatos.</li>
	<li>Observe a tela das gaiolas que exibe o ID do animal a ser testado. Coloque cada rato na gaiola correspondente e pressione o botão na gaiola duas vezes. Observe que a luz verde se transformará em uma luz laranja assim que o teste for iniciado, e um som de aviso será ouvido quando a sessão de teste terminar.</li>
	<li>Durante os primeiros 2 dias de treinamento, coloque garrafas de leite completamente na gaiola para permitir que os ratos bebam leite sem entrar em contato com o estímulo.</li>
	<li>Nos dias 3-8 de treinamento, uma vez que os animais comecem a beber, mova as garrafas progressivamente para trás para incentivar os ratos a pressionar seus rostos contra as barras cravadas.</li>
	<li>Nos dias 9-10 de treinamento, uma vez que os animais pressionam totalmente contra as barras cravadas e os números de lambida são consistentes (um mínimo de 500 lambidas durante as sessões de teste de 10 minutos), observe a localização da garrafa de leite para cada animal e use essa distância para gravações de linha de base.</li>
	<li>Após 2 semanas de treinamento, colete dados da distância da garrafa de leite observada por 5 dias como linha de base (10 min/dia).</li>
</ol>5. Indução da dor neuropática orofacial e avaliação da hipersensibilidade mecânica
NOTA: Após as medidas basais, os ratos foram submetidos à cirurgia de CCI-ION, que envolveu ligadura bilateral do ION, conforme descrito anteriormente20. Ratos de controle tiveram cirurgia simulada. Nenhuma analgesia pré ou pós-operatória foi utilizada no procedimento, pois pode alterar o curso temporal da neuropatia. CUIDADO: Os resíduos de isoflurano devem ser eliminados através de recipientes de carvão. As lâminas e agulhas do bisturi devem ser eliminadas nos resíduos de risco biológico.
<ol><li>Anestesiar o rato na câmara de indução com uma mistura de O2 (1 L/min) e isoflurano a 4% e manter o estado anestésico com um cone nasal especializado durante a duração da cirurgia.</li>
	<li>Coloque o rato anestesiado em uma bancada cirúrgica e contenha-o. Mantenha a temperatura do corpo a 37 °C usando uma almofada de aquecimento. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem. Verifique a profundidade anestésica apertando o dedo do pé e inicie o procedimento quando o reflexo de retirada do dedo do pé não for mais observado.</li>
	<li>Realize o procedimento cirúrgico sob um microscópio estéreo. Abra a boca usando afastadores e retraia o lábio usando um pequeno clipe.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão entre a gengiva dorsal e o lábio usando uma lâmina de bisturi (# 15). Corte suavemente o tecido mole usando a ponta da lâmina do bisturi para revelar um ramo do ION.</li>
	<li>Coloque duas ligaduras de intestino crômico (#5-0) ao redor do ION usando uma agulha de seringa contundente e dobrada.</li>
	<li>Feche a ferida usando adesivo de tecido.</li>
	<li>Para a cirurgia simulada, exponha o ION usando o mesmo procedimento, mas não ligue o nervo.</li>
	<li>Após a cirurgia, forneça ração de roedores amolecida com leite por 2 dias para incentivar a alimentação e prevenir a desidratação.</li>
	<li>Teste os ratos na DAOP no dia seguinte à cirurgia por 3 dias consecutivos e, em seguida, 3 dias / semana (por exemplo, todas as terças, quintas e sextas-feiras) nas semanas seguintes até que os números de lambida atinjam seus valores basais. NOTA: A duração da sensibilidade mecânica induzida por CCI-ION pode depender do sexo, da tensão do roedor utilizado e do desempenho do experimentador. Assim, pode não ser preciso indicar uma certa duração para testar animais. Assim, o teste até que os números de lambida atinjam os valores basais é mais preciso.</li>
</ol>6. Limpeza do dispositivo
<ol><li>Quando o teste estiver concluído, saia do software clicando no ícone x no canto superior direito e aguarde que os dados sejam salvos automaticamente.</li>
	<li>Desligue as gaiolas usando o interruptor no painel frontal.</li>
	<li>Desconecte os fios das grades de piso de metal. Retire e lave as bandejas de gotejamento de leite, as gaiolas de plexiglas, as grades de piso de metal e os porta-garrafas com sabão de prato. Coloque tudo no rack de secagem.</li>
	<li>Limpe as barras com espinhos de metal, o dispositivo de teste e as bancadas de laboratório usando álcool isopropílico a 70%. NOTA: Os instrumentos precisam ser manuseados com cuidado. Use escovas macias enquanto limpa as garrafas de leite e lambe os tubos. Equipamentos sujos podem levar ao acúmulo de bactérias.</li>
</ol>7. Análise dos dados
<ol><li>Clique duas vezes no arquivo de experimento para abri-lo.</li>
	<li>Clique no menu Resultados . Selecione quais medidas (ou seja, lamber, entrar em contato) ou dias de teste para ver.</li>
	<li>Clique em Texto ou Gráfico ou Estatística encontrado na parte superior do painel Resultados para ver um relatório, gráfico ou de análise estatística.</li>
	<li>Para ver os dados brutos, clique no menu Dados . Clique em Salvar na parte superior do painel Dados para salvar os dados como uma planilha ou clique em Enviar para recebê-los por email.</li>
	<li>Para alterar ou adicionar mais variáveis para ver, clique em Selecionar dados, selecione as medidas e clique em Exibir planilha.</li>
	<li>Análise estatística<ol><li>Derive automaticamente o número de licks e contatos e a latência para a primeira lambida do software e exporte os dados do software para uma planilha.</li>
		<li>Calcular a relação L/F como índice de hipersensibilidade dividindo o número de lambidas pelo número de contatos21,22,23. NOTA: Neste estudo, um dos ratos do grupo sham foi excluído do estudo devido ao baixo número de lambeduras (<500 lambidas) antes da cirurgia.</li>
		<li>Analisar a significância estatística das diferenças entre L/F, o número de lambidas e os contatos, e a latência para a primeira lambida através de ANOVA de medidas repetidas bidirecionais seguidas pelas comparações múltiplas de Dunnett ou testes de comparações múltiplas de Šídák, quando apropriado. NOTA: P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Vlaeyen, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+predict+and+control+harmful+events%3A+Chronic+pain+and+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning.</a> Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).</li>
<li>Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVierck%2C+CJ+%22Emerging+Strategies+for+the+Treatment+of+Neuropathic+Pain%22">Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain</a>. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).</li>
</ol>

John K. Neubert e Robert M. Caudle são os inventores do OPAD. Stoelting Co. é o fabricante do OPAD, e Richard Mills é um funcionário da Stoelting. A taxa de publicação foi paga pela Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert e Robert M. Caudle são proprietários anteriores da Velocity Laboratories, uma empresa que fornece testes comportamentais de taxa por serviço usando ensaios de dor operante.

A dor desencadeada pela estimulação mecânica inócua da face e da mucosa intraoral é uma característica proeminente das condições de dor orofacial, incluindo neuralgia do trigêmeo e distúrbios da articulação temporomandibular24,25. Embora a dor neuropática do trigêmeo seja clinicamente bem descrita, a avaliação dos comportamentos nociceptivos neuropáticos em roedores é um desafio. Ensaios de dor que medem comportamentos reflexivos são os métodos mais utilizados na pesquisa pré-clínica da dor. No entanto, o estresse relacionado ao aparelho de teste, a incapacidade de avaliar o estado afetivo e o viés do experimentador levantam preocupações quanto à utilidade e validade dos ensaios reflexos26.
Este estudo introduz a avaliação da sensibilidade mecânica na região orofacial de ratos, demonstrando sua sensibilidade ao CCI-ION por meio de um ensaio de dor baseado em operação. O mesmo sistema operante também pode ser usado para testar a sensibilidade mecânica de camundongos. Deve-se notar que as cepas de camundongos e ratos podem apresentar variação em sua resposta ao CCI-ION e, portanto, os níveis de hipersensibilidade mecânica podem diferir. Com base em nossa experiência, os ratos Sprague-Dawley geralmente desenvolvem uma hipersensibilidade mecânica estável 2 semanas após o CCI-ION, eles começam a se recuperar 4 semanas após o CCI-ION e, após 6 semanas de CCI-ION, vemos a recuperação da cirurgia. 
Nesse protocolo, a hipersensibilidade mecânica foi quantificada medindo-se o número de lambidas e os contatos, L/F e latência à primeira lambida. Os dados demonstraram que o CCI-ION resultou em diminuição da L/F e do número de respostas de lambida e aumento da latência à primeira resposta de lambida, indicando que os animais não estavam dispostos a pressionar o rosto contra barras cravadas devido ao aumento da sensibilidade à dor orofacial. 
OPAD é um ensaio de recompensa-conflito no qual os animais devem suportar estímulos nociceptivos para acessar uma recompensa palatável. O comportamento de lamber no ensaio pode ser afetado pelo comportamento apetitoso. Além disso, neste estudo, foram utilizados ratos que tinham pelos faciais. Com base na experiência prévia com ensaios de dor operante, entre os roedores, as cepas sem pelos são melhores para detectar contatos faciais16; no entanto, no momento da publicação, as cepas de ratos sem pelos não estavam mais disponíveis comercialmente. Isso pode ser considerado uma limitação do estudo. Como também usamos apenas ratas Sprague-Dawley, diferenças relacionadas ao sexo e à cepa nas respostas à dor devem ser antecipadas. 
Há também algumas etapas críticas para garantir resultados ótimos com o ensaio. Os dados precisos de lambida e contato devem aparecer como blocos vermelhos e brancos sólidos no software referenciado, respectivamente (consulte a Figura 3). A distância entre os picos e a garrafa de leite é crucial para o sucesso do experimento. Se a ponta da garrafa de leite estiver muito à frente, o animal não fará contato com os picos e o software não registrará corretamente os contatos ou lamberá os números. Por outro lado, se a garrafa de leite estiver muito para trás, os contatos se registrarão, mas o animal não poderá alcançar o leite. Durante as sessões de treinamento, os dados de lambida podem aparecer como blocos brancos sólidos, já que a ponta da garrafa de leite está muito à frente. Ele se transforma em blocos sólidos vermelhos uma vez que a garrafa de leite é empurrada para trás. Por alguma razão, se os dados de lambida começarem a aparecer como blocos brancos da distância que foi observada, empurrar a garrafa um pouco e mover o suporte de leite ligeiramente para baixo / para cima pode ajudar. 
Vários pontos também podem ser considerados como limitações do sistema de dor operante orofacial aqui descrito. O treinamento dos roedores é necessário e leva semanas. Antes de cada sessão de teste, a restrição alimentar é necessária em camundongos, mas não em ratos. Camundongos sem jejum demonstraram ter números de lambedura baixos e inconsistentes em comparação com camundongos em jejum27. Como o sistema OPAD é um modelo de recompensa-conflito, ele pode ser afetado pelo comportamento apetitoso dos animais ou por uma droga que afeta o apetite. Ter vários aparelhos também é vantajoso para reduzir o tempo total para testar os animais, o que pode aumentar os custos. No entanto, os ensaios de dor operante orofacial ainda são vantajosos em relação aos ensaios convencionais baseados em reflexos, pois permitem o teste de vários animais ao mesmo tempo e limitam a interação animal-experimentador.
O condicionamento operante durante os estados de dor modifica o comportamento humano e animal de acordo com suas consequências28. O uso de um modelo de recompensa-conflito é, portanto, vantajoso para avaliar as condições de dor, pois permite que os animais realizem respostas operantes. Isso é mais relevante clinicamente porque as características dos comportamentos operante envolvem intenção, motivação e, tipicamente, processamento cortical29. Como os animais se aproximam voluntariamente da garrafa de recompensa e podem se retirar livremente das barras cravadas a qualquer momento, isso integra centros superiores do cérebro e permite a avaliação dos estados afetivo-motivacionais relacionados à dor10. Assim, os ensaios de dor operante fornecem dados superiores ao avaliar a dor e os analgésicos in vivo. Eles também ajudam a entender os processos nociceptivos no sistema trigêmeo, contribuindo assim para o avanço do campo da dor orofacial.

A dor crônica afeta milhões de americanos anualmente1. Infelizmente, a dor crônica é difícil de tratar, pois as terapias existentes são relativamente ineficazes na mitigação da dor crônica e muitas vezes têm efeitos colaterais indesejados com o uso a longo prazo 2,3,4. Os ensaios pré-clínicos tradicionais de dor, como o ensaio de von Frey, baseiam-se em resultados reflexivos ou respostas estimuladas pela dor5. Embora o ensaio de von Frey tenha sido usado por décadas para medir a alodinia mecânica, ele é suscetível a vários fatores de confusão, notadamente o viés do experimentador6. O uso do teste de von Frey para avaliar a dor orofacial também é problemático devido ao grau de contenção necessário para proteger a cabeça do animal para testar com sucesso a área facial, o que pode produzir efeitos de estresse indesejados, como aumentar a dor ou, inversamente, a analgesia induzida pelo estresse.
Comportamentos estimulados pela dor também são suscetíveis a resultados falso-positivos7 e não explicam o componente afetivo da dor, que é parte integrante da experiência de dor humana8. Portanto, há um interesse crescente no uso de modelos de dor operante que avaliam comportamentos deprimidos pela dor que abrangem os componentes sensoriais e afetivos da dor para melhorar o conteúdo e a validade preditiva em testes pré-clínicos. O ensaio de avaliação da dor orofacial operante aqui descrito baseia-se em um paradigma de recompensa-conflito 9,10,11. Neste ensaio, o roedor pode escolher entre receber um reforçador positivo e submeter-se a um estímulo nociceptivo ou renunciar à recompensa e evitar o estímulo nociceptivo, controlando assim a quantidade de dor que experimenta. Ao contrário dos ensaios de dor tradicionais, o ensaio baseado em operação é independente do experimentador e não é suscetível a resultados falso-positivos devido a efeitos sedativos indesejáveis.
Sensações nocivas da cabeça e da face são transportadas pelos ramos oftálmico, maxilar e mandibular do nervo trigêmeo. A lesão ou inflamação do nervo trigêmeo aumenta a sensibilidade dos neurônios sensoriais a estímulos térmicos ou mecânicos12,13,14,15. Os ensaios de dor orofacial baseados em operantes fornecem uma medida automatizada da dor orofacial térmica ou mecânica transmitida pelo nervo trigêmeo em roedores 11,12,16,17,18. A estimulação com estímulos não nocivos e nocivos é uma distinção importante entre testar alodinia térmica e mecânica e hiperalgesia na região orofacial com a DAOP, pois podem representar manifestações de diferentes mecanismos subjacentes.
No ensaio térmico orofacial, os animais pressionam o rosto contra termodes lisos para acessar a recompensa. Os termodos podem ser ajustados para várias temperaturas frias, quentes e quentes, permitindo assim a avaliação do comportamento sob condições neutras ou nociceptivas. No ensaio mecânico orofacial, os animais pressionam o rosto contra barras cravadas durante o teste operante; como esses picos causam algum nível de desconforto, os roedores podem beber menos quando seus rostos tocam os picos em comparação com as superfícies lisas dos termodes. Assim, o ensaio mecânico orofacial operante pode avaliar o efeito de diferentes graus de estimulação nociceptiva mecânica. Demonstramos anteriormente que a DAOP é um método útil e confiável para avaliar a termização aguda9, bem como a mecânica aguda19, a nocicepção e a hiperalgesia.
Este artigo relata o uso de uma versão recém-desenvolvida do OPAD para avaliar a nocicepção mecânica e a hipersensibilidade. Além disso, por meio de validação, demonstramos a capacidade do CCI-ION de induzir neuropatia crônica que resulta em uma resposta previsível na OPAD. Também detalhado é como usar o OPAD e seu software associado para obter e analisar rapidamente dados comportamentais de roedores.

<table><tbody><tr><td>Software de rastreamento de vídeo ANY-maze</td><td>Stoelting</td><td>60000</td><td></td></tr><tr><td>Escovas de limpeza de garrafas</td><td>ANY</td><td>ANY</td><td>Escovas de tamanhos diferentes para garrafas e tubos</td></tr><tr><td>Tamanho de sutura de intestino crômico 5-0</td><td>Ethicon</td><td>687-G</td><td></td></tr><tr><td>Sabão de louça</td><td>ANY</td><td>ANY</td><td>Esponja de</td></tr><tr><td>prato</td> líquido <td>ANY</td><td>ANY Versão</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.3.1&nbsp;</td><td>GraphPad Software, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético de placa de aquecimento</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H4000-HS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td> pivetal <td>Fisher Scientific</td><td>60-001-56</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Dechra</td><td></td><td>Puralube Vet, pomada oftálmica de petrolato</td></tr><tr><td>Sistema de Armazenamento do Sistema de Dispositivo de Avaliação da Dor Operante (OPAD)</td><td></td><td>67500</td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td><td></td> de Oxigênio <td>Toalha de</td></tr><tr><td>Papel</td> Médico <td>QUALQUER</td><td>QUALQUER Embalagem</td><td></td></tr><tr><td>de alimento de plástico</td><td>QUALQUER</td><td>QUALQUER</td><td></td></tr><tr><td>Barras de agitação poligonais</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-124</td><td></td></tr><tr><td>Copos de vidro reutilizáveis Berzelius (1 L)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FB1021000</tr><tr><td>Lâmina de bisturi #15</td><td>FST</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para pequenos animais</td><td>VetFlo</td><td>VetFlo-1205S</td><td></td></tr><tr><td>Colher</td><td>QUALQUER</td><td>QUALQUER</td> Ratos <td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley, fêmeas</td><td>Charles River Laboratories,&nbsp; Microscópio estéreo boom USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omano</td><td>OM2300S-GX4</td><td></td></tr><tr><td>Leite condensado adoçado</td><td>Borden&nbsp;</td><td></td> Adesivo de tecido <td>da marca Eagle</td></tr><tr><td></td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento de circulação de água e bomba</td><td>Gaymar</td><td>Modelo TP-500</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da hipersensibilidade mecânica induzida por lesão nervosa em ratos usando um ensaio de dor operante orofacial

Assessment of Nerve Injury-Induced Mechanical Hypersensitivity in Rats Using an Orofacial Operant Pain Assay

A dor tem componentes sensoriais e afetivos. Ao contrário dos ensaios de dor tradicionais baseados em reflexos, os ensaios de dor operante podem produzir resultados clinicamente mais relevantes, abordando os aspectos cognitivos e motivacionais da dor em roedores. Este trabalho apresenta um protocolo para avaliação da hipersensibilidade mecânica após lesão crônica por constrição dos nervos infraorbitários (CCI-ION) em ratos utilizando um sistema de dor operante orofacial. Antes da cirurgia CCI-ION, os ratos foram treinados em um dispositivo de avaliação da dor orofacial (OPAD) para beber leite condensado adoçado enquanto faziam contato facial com as barras de metal cravadas e o tubo de lambida.
Neste ensaio, os ratos podem escolher entre receber leite como um reforçador positivo ou escapar de um estímulo mecânico aversivo que é produzido por uma fileira vertical de pequenos picos em forma de pirâmide em cada lado do orifício de acesso à recompensa. Após 2 semanas de treinamento na OPAD e antes da cirurgia CCI-ION, os dados de sensibilidade mecânica basal foram registrados por 5 dias para cada rato durante uma sessão de teste de 10 minutos. Durante uma sessão, o sistema operante registra automaticamente o número de ativações da garrafa de recompensa (lambidas) e contatos faciais, duração do contato e latência para a primeira lambida, entre outras medidas.
Após as medidas basais, os ratos foram submetidos a CCI-ION ou cirurgia simulada. Nesse protocolo, a hipersensibilidade mecânica foi quantificada medindo-se o número de lambidas, a latência à primeira lambida, o número de contatos e a razão entre lambeduras e contatos faciais (L/F). Os dados mostraram que o CCI-ION resultou em uma diminuição significativa no número de lambidas e na relação L/F e um aumento na latência à primeira lambida, indicando hipersensibilidade mecânica. Esses dados apoiam o uso de ensaios de dor baseados em operação para avaliar a sensibilidade mecânica à dor em pesquisas pré-clínicas sobre dor.

Um exemplo de lambidas de um único rato no frasco de recompensa e contatos com as barras de metal cravadas no início do estudo e 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas após a cirurgia é apresentado na Figura 3. Durante os períodos não nocivos, os ratos geralmente têm longas sessões de beber (por exemplo, no início do estudo e recuperação após o CCI-ION: semana 6 na imagem) e, após o CCI-ION, os números de lambida diminuem, pois não conseguem manter contato facial com as barras cravadas por um longo período (Figura 3A), sem mudanças significativas nos períodos de consumo no grupo sham (Figura 3B).
Ratos com CCI-ION tiveram uma diminuição significativa no número de lambidas até 4 semanas após a cirurgia e um aumento na latência para a primeira lambida na semana da cirurgia (semana 0) e 1 semana após a cirurgia em comparação com a linha de base. Não houve alteração significativa no grupo simulado (Figura 4A,B). O CCI-ION produziu uma diminuição no número de contatos, mas essa diferença não foi significativa (Figura 4C). O CCI-ION também causou uma diminuição significativa no L/F, e a diminuição para o grupo CCI-ION foi maior do que a diminuição para o grupo sham (Figura 4D).
Esses resultados indicam que, após o CCI-ION, os ratos apresentam menos comportamento de recompensa ao beber leite, e demoram um pouco para fazer a primeira lambida, indicando um comportamento nocifensivo. No entanto, o CCI-ION não afeta seu desejo de alcançar o leite. Além disso, a diminuição da L/F de ratos com CCI-ION indica hipersensibilidade mecânica, pois a L/F é maior durante condições não dolorosas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do desenho do estudo. Abreviaturas: OPAD = dispositivo de avaliação da dor orofacial; CCI-ION = lesão crônica por constrição dos nervos infraorbitais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig02.jpg"> Figura 2: Imagem representativa de barras cravadas e de um rato realizando o ensaio. As barras cravadas são feitas de metal inoxidável. O comprimento de toda a barra é de 7 cm. A altura dos espigões é de 0,3 cm. A distância entre os espigões é de 0,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig03.jpg"> Figura 3: Tentativas de contato representativas e dados de lambida de um único rato operado por CCI-ION e sham durante a sessão de teste padrão de 10 minutos no início do estudo e 2 semanas, 4 semanas e 6 semanas após a cirurgia. Abreviaturas: CCI-ION = lesão crônica por constrição dos nervos infraorbitais; AS = após a cirurgia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig04.jpg"> Figura 4: Desenvolvimento de hipersensibilidade mecânica após CCI-ION em ratos Sprague-Dawley. (A) Ratos com CCI-ION (n = 8) tiveram uma diminuição significativa no número de lambeduras até 4 semanas após a cirurgia e (B) um aumento na latência para a primeira lambida na semana da cirurgia (semana 0) e 1 semana após a cirurgia (**p &lt; 0,01, *p &lt; 0,05: semanas após a cirurgia vs. linha de base. #p &lt; 0,05: CCI-ION vs. sham). Não houve diminuição significativa no grupo sham (n = 7, p &gt; 0,05). (C) CCI-ION ou cirurgia simulada não produziu nenhuma mudança significativa no número de contatos. (D) Ratos com CCI-ION apresentaram uma diminuição significativa da L/F na semana da cirurgia e 3 semanas após a cirurgia e exibiram uma tendência decrescente 2 semanas após a cirurgia. Em comparação com os ratos do grupo simulado, essa diminuição foi significativamente maior em ratos CCI-ION e começou 1 semana após a cirurgia e continuou até 3 semanas após a cirurgia. Não houve diferença significativa no grupo sham (**p &lt; 0,01, *p &lt; 0,05: semanas após a cirurgia vs. linha de base. # p &lt; 0,05: CCI-ION vs. sham). Nos gráficos, a linha vermelha representa o grupo CCI-ION e a linha azul representa o grupo sham. Os dados são apresentados como média ± EPM. As diferenças significativas foram analisadas por ANOVA de medidas repetidas bidirecionais seguida dos testes de comparação múltipla de Šídák ou Dunnett, conforme apropriado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve a avaliação da hipersensibilidade mecânica em um modelo de rato de dor orofacial neuropática usando um dispositivo de avaliação da dor orofacial baseado em operação.

Avaliação da hipersensibilidade mecânica induzida por lesão nervosa em ratos usando um ensaio de dor operante orofacial

Pain has sensory and affective components. Unlike traditional, reflex-based pain assays, operant pain assays can produce more clinically relevant results ...

O dispositivo de avaliação da dor orofacial, ou OPAD, é uma ferramenta valiosa para a pesquisa pré-clínica da dor, pois usa um paradigma de conflito de recompensa operante. Isso engloba nocicepção, aprendizagem e motivação, que são importantes na experiência da dor humana e na melhoria da validade translacional. Uma vantagem significativa do OPAD sobre os ensaios tradicionais baseados em reflexos é que ele é totalmente automatizado, o que elimina a necessidade de restringir os animais, prevenindo os efeitos do estresse relacionados e também reduz o viés do experimentador.Demonstrando a cirurgia CCI do nervo infraorbitário estará Darrice Montgomery, um técnico de laboratório do meu laboratório. Comece com a configuração do dispositivo de avaliação da dor orofacial, ou OPAD, colocando as bandejas de gotejamento de leite, gaiolas de plexiglass e grades de piso de metal. Fixe a fiação às gaiolas e coloque o porta-garrafas no poste de metal na parte de trás do dispositivo.Em seguida, coloque as garrafas de leite de recompensa no porta-garrafas de uma forma que o bico possa ser alcançado pelo animal. Aperte o botão esquerdo do suporte para fixar o frasco no lugar. Em seguida, ligue o painel frontal e ligue as gaiolas.Para configurar o protocolo, abra o software, digite a senha e clique em Log Me On ou pressione Enter. Clique em New Empty Experiment e no menu Protocol (Entrar). Em Aparelho, clique em Protocolo sem nome e selecione o modo que esse protocolo usará.Em Modos Específicos do Equipamento, selecione Modo de Gaiola Mecânica OPAD e nomeie o protocolo. Depois de garantir que todas as gaiolas estejam ligadas, adicione as gaiolas OPAD clicando em Aparelho e Adicionar Item na parte superior do painel de protocolo, seguido de selecionar Nova Gaiola OPAD e Adicionar Todas as Gaiolas OPAD Conectadas. Para adicionar os estágios de teste do experimento, vá para a guia Teste para selecionar os estágios e as guias Primeiro estágio e nomeie o estágio.Adicione 10 minutos como a duração do teste. Adicione mais estágios clicando em Adicionar Guia Item, seguido por Novo Palco. Em seguida, atribua os grupos clicando em Informações Adicionais e Grupos de Tratamento.Marque Grupos de Tratamento Usados, em seguida, selecione a opção O usuário atribuirá manualmente os animais a seus grupos. Atribua identificações de animais clicando no menu Protocolo. Em Informações Adicionais, clique em Animal ID e marque a opção Usar Minhas IDs para Referir-se a Animais.Defina o experimento digitando o título do experimento antes de clicar em Exibir Tratamentos e digitar os nomes do tratamento. Adicione animais e atribua os tratamentos e IDs de animais clicando em Exibir Animais e Adicionar Animais. Insira o número de animais a serem testados, seguido de OK.Quando a lista de animais aparecer, adicione a identificação do animal e o tratamento para cada rato. Salve o protocolo clicando no menu Protocolo seguido de Salvar Protocolo. Digite o nome do arquivo e a senha do software e clique em Salvar.Em seguida, salve o arquivo de experimento clicando no arquivo e, em seguida, salve, digitando a senha do software e clicando na guia Salvar. Depois de ligar as gaiolas, procure a luz verde na gaiola indicando que a gaiola está pronta para testar. Abra o arquivo de experimento salvo com um duplo clique.Digite a senha, clique em Conectar-me ou pressione Enter. No lado esquerdo do ecrã, anote o número de animais e a gaiola correspondente, o estágio em funcionamento nesse dia e o estado do ensaio. Observe a identificação do animal de teste na tela da gaiola.Coloque o rato na gaiola e pressione o botão na gaiola correspondente. Observe que a luz verde se transforma em uma luz laranja quando o teste é iniciado. Certifique-se de que o animal possa acessar a garrafa de recompensa enquanto faz contato suficiente com os picos mecânicos.No lado direito da tela, observe o gráfico de cada animal mostrando o número de lambidas e contatos. Um som de aviso é ouvido quando a sessão de teste termina. Coloque o rato anestesiado em uma bancada cirúrgica e contenha-o.Mantenha a temperatura do corpo a 37 graus Celsius usando uma almofada de aquecimento. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem. Use a lâmina de bisturi 15 para fazer uma pequena incisão entre a gengiva dorsal e o lábio.Remova o tecido mole usando a lâmina do bisturi e revele o ramo dos nervos infraorbitais, ou ION. Com a ajuda de uma agulha de seringa curvada contundente, coloque duas ligaduras intestinais cromáticas 5-O ao redor do ION e, em seguida, feche a ferida usando adesivo de tecido. As tentativas de contato e os dados de lambida de um único rato operado por CCI ION e Sham durante a sessão de teste padrão de 10 minutos no início do estudo, e duas semanas, quatro semanas e seis semanas após a cirurgia são apresentados aqui.O modelo revelou que durante os períodos não nocivos os ratos têm longas sessões de bebida. Após a lesão, o animal não pode manter contato facial com as barras cravadas por um longo período, resultando em uma diminuição do número de lambidas. No grupo Sham, não foram observadas mudanças significativas para o período de consumo.O número médio de lambidas entre os ratos operados por CCI ION e Sham no início do estudo não mostrou diferenças significativas. No entanto, o CCI ION reduziu significativamente o número de lambeduras até quatro semanas após a cirurgia e aumentou a latência para a primeira lambida durante a semana pós-cirurgia e uma semana após a lesão nervosa, indicando hiperalgesia mecânica. Não houve mudança significativa em ratos operados por Sham.Ao usar o OPAD, otimize a distância da garrafa de leite e a largura dos picos. É importante manter isso consistente para reduzir erros durante a coleta de dados.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Poupado do Nervo modelo animal de lesão é descrita aqui como um modelo do rato da dor neuropática periférica seguintes denervação parcial do nervo ciático por a lesão do tibial e nervo peroneal comum ramos, deixando o nervo sural restante intacto. Modificação comportamental resultante da alodinia mecânica é quantificada por filamentos de von Frey.

Poupado da lesão do nervo Model (SNI) de alodinia mecânica induzida em camundongos

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Este vídeo demonstra um protocolo cirúrgico em um modelo de rato, detalhando as etapas desde a preparação da anestesia até a indução da lesão do nervo facial. Este protocolo é útil para estudar a regeneração nervosa e técnicas cirúrgicas em pesquisas médicas.

Induzindo uma lesão do nervo facial em um modelo de rato

Este vídeo demonstra a indução de dor neuropática orofacial em um modelo de rato pela ligação do nervo infraorbital. Isso resulta em danos e inflamação nos nervos, causando sinalização anormal da dor e mimetizando condições de dor crônica, que podem ser usadas para estudar o ensaio de dor orofacial.

Induzindo dor neuropática orofacial em um modelo de rato por meio de ligaduras nervosas infraorbitais

Apresentamos um sistema operante user-friendly, de alto rendimento para a avaliação dos comportamentos de dor em Despertai, roedores conscientes. O Dispositivo de Avaliação de Dor Orofacial (OPAD) pode avaliar a dor através de um paradigma de recompensa / conflito proporcionando assim uma forma mais humana de testes. Este protocolo irá produzir dados mais relevantes clinicamente e translacional a partir de roedores.

O uso do dispositivo de Avaliação de Dor Orofacial operante (OPAD) para medir as mudanças no comportamento nociceptivo

Um alongamento na duração da refeição representa o comportamento orofacial nociceptivo em roedores semelhante ao comportamento de guarda dos seres humanos com dor orofacial. Comer é um comportamento que não requer treinamento ou manipulação animal, requer participação cortical, e não está competindo com outros comportamentos induzidos experimentalmente, distinguindo este ensaio de reflexos alternativos ou medidas operárias.

Duração da Refeição como Medida de Respostas Nociceptivas Orofacial em Roedores

Este manuscrito descreve um modelo de roedor para estudar a dor neuropática do trigêmeo. Os métodos descritos incluem procedimentos cirúrgicos para realizar uma lesão de constrição crônica do nervo infraorbital do rato e os testes comportamentais pós-cirúrgicos para medir as mudanças no comportamento espontâneo e evocado que são indicativas de dor persistente e alodinia.

Crônica lesão por constrição de Infraorbital Nerve do Rato (Ion-CCI) para o Estudo do trigêmeo Dor neuropática

A cirurgia modificada é um método simplificado para o modelo de lesão nervosa poupada de camundongo ou rato que requer apenas uma ligadura e um corte para lesionar os nervos fibular e sural comuns.

Modelo de cirurgia de lesão nervosa poupada modificada de dor neuropática em camundongos

A ligadura parcial do nervo ciático induz dor neuropática crônica de longa duração, caracterizada por respostas exageradas a estímulos térmicos e mecânicos. Este modelo murino de dor neuropática é comumente usado para estudar terapias inovadoras para o tratamento da dor. Este artigo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico para melhorar a padronização e reprodutibilidade.

Ligadura parcial do nervo ciático: um modelo murino de dor neuropática crônica para estudar o efeito antinociceptivo de novas terapias

A lesão por constrição crônica do nervo infraorbital distal em camundongos induz mudanças no comportamento espontâneo (aumento da atividade de limpeza facial) e no comportamento nocifensivo em resposta à estimulação tátil (hiperresponsividade à estimulação capilar de von Frey) que são sinais de dor contínua e alodinia e serve como modelo para a dor neuropática do trigêmeo.

Lesão por Constrição Crônica do Nervo Infraorbital Distal (DIoN-CCI) em Camundongos para Estudo da Dor Neuropática do Trigêmeo

Aprenda a avaliar hipersensibilidade mecânica em ratos com dor orofacial neuropática usando o dispositivo OPAD automatizado. Este método reduz o estresse animal e o viés do experimentador em pesquisa de neurociência.

Avaliação da hipersensibilidade mecânica induzida por lesão nervosa em ratos usando um ensaio de dor operante orofacial

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