Larvas de zebrafish como modelo para avaliar potenciais radiossensibilizadores ou protetores
25 de agosto de 2022
O peixe-zebra tem sido recentemente explorado como um modelo para validar potenciais modificadores de radiação. O presente protocolo descreve as etapas detalhadas para o uso de embriões de zebrafish para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o efeito de diferentes tratamentos e radiação.
Este protocolo descreve os passos detalhados para o uso de embriões de peixe-zebra para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o tratamento de diferentes drogas e radiação. Isso ajudará os leitores a definir uma triagem de drogas de rendimento semi-alto envolvendo exposição a raios-X usando embriões de peixe-zebra, que guiará na avaliação da radiotoxicidade e da eficácia de diferentes drogas usadas. Este procedimento pode ser usado para triar, validar ou avaliar diferentes drogas como potenciais radiossensibilizadores ou protetores, que podem ser mais explorados ou usados no campo da radioterapia ou radiobiologia do câncer.
Para começar, monitore os embriões em crescimento sob o microscópio de dissecação. Identificar o estágio adequado e remover quaisquer embriões mortos ou insalubres. Garantir o estadiamento embrionário adequado é a radiação e as doses de drogas serão dadas em um estágio específico de gastrulação.
Antes de iniciar o experimento, distribua cuidadosamente os embriões saudáveis nas placas experimentais com a ajuda de uma pipeta de Pasteur. Para cada grupo experimental, tomar de 15 a 20 embriões. Ao montar um experimento de radiação, inclua um grupo controle não irradiado e um grupo somente de radiação.
Distribua os embriões em uma placa de poço se os escudos de radiação puderem cobrir e proteger os poços extras da radiação enquanto os outros poços são expostos a uma dose de radiação específica. Caso contrário, use placas ou discos individuais para ver os embriões por dose de radiação. Ligue a máquina irradiadora de raios X e inicie a inicialização e o aquecimento da máquina.
Coloque a placa experimental sob o irradiador dentro da máquina no centro, garantindo que a placa esteja diretamente abaixo da fonte de raios X. E, em seguida, definir a dose e iniciar o raio-x. Após a conclusão da irradiação, retire as placas, desligue o programa da máquina, desligue a máquina e verifique as placas sob o microscópio imediatamente após a radiação.
Remover os embriões mortos e registrar seu número após avaliá-los ao microscópio dissecante. Retorne as placas para a incubadora a 28,5 graus Celsius. Coletar dados em intervalos de tempo pré-determinados após a radiação ser administrada.
Registre todas as observações possíveis, como sobrevivência, eficiência de eclosão, estágio de desenvolvimento, contagem de batimentos cardíacos, curvatura do corpo e da cauda, edema pericárdico e extensão do saco vitelino, microcefalia, desenvolvimento da bexiga natatória, motilidade ou atividade geral, etc. Para capturar imagens, escolha embriões representativos em uma lâmina limpa. Verifique os embriões sob o microscópio, oriente-os em uma direção específica.
A curva de sobrevivência dos embriões irradiados seis horas pós-fertilização mostrou que no grupo controle e nos embriões expostos a 2 cinzas e 5 cinzas, não houve morte significativa nos embriões. A contagem de batimentos cardíacos por minuto sugeriu que a frequência cardíaca diminuiu enormemente com o aumento das doses de radiação de raios-X. No grupo controle, a cada intervalo de 24 horas, observou-se aumento da frequência cardíaca.
Suspeita-se de deformação cardiovascular grave em embriões expostos a 15 cinzas e 20 cinzas, pois os batimentos cardíacos caíram enormemente. Diferentes defeitos fenotípicos e de desenvolvimento são descritos e avaliados para embriões expostos a doses variáveis de radiação em diferentes momentos. Observações morfológicas para flexão da coluna ou cauda, malformação da cabeça e microcefalia, defeitos no desenvolvimento, edema pericárdico, deformidades do saco vitelino, deformidades da bexiga natatória e alterações na estrutura ocular também foram realizadas Para o protocolo que demonstramos, a escolha de embriões saudáveis, a colocação adequada dos embriões no irradiador e a avaliação adequada das anormalidades cruzadas são a chave para este procedimento.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o uso de embriões de peixe-zebra para experimentos de triagem baseados em radiação. Ele apresenta abordagens observacionais para avaliar os efeitos de diversos tratamentos e da radiação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Radiobiologia
- Pesquisa sobre câncer
- Triagem de fármacos
Contexto
- Peixes-zebra são um modelo valioso para o estudo dos efeitos da radiação.
- O protocolo auxilia na avaliação da radiotoxicidade e da eficácia de fármacos.
- Ele contribui para a investigação de radiosensibilizadores e radioprotetores.
- A estadiamento dos embriões é essencial para uma dosagem precisa.
Objetivo do Estudo
- Validar potenciais modificadores da radiação utilizando embriões de peixe-zebra.
- Estabelecer um método de triagem de fármacos semialto rendimento.
- Orientar avaliações em radioterapia do câncer.
Métodos Utilizados
- Monitorar embriões de peixe-zebra sob um microscópio estereoscópico.
- Identificar e remover embriões não saudáveis.
- Aplicar doses de radiação e fármacos em estágios específicos de gastrulação.
- Realizar experimentos de triagem para avaliar os efeitos dos fármacos.
Resultados Principais
- Estabelecimento de um protocolo para triagem de fármacos com peixe-zebra.
- Identificação de tratamentos eficazes para radiotoxicidade.
- Validação de potenciais radiossensibilizadores e protetores.
- Orientação para pesquisas futuras em radioterapia do câncer.
Conclusões
- O modelo de peixe-zebra é eficaz para a validação de modificadores de radiação.
- Este protocolo pode aprimorar as metodologias de triagem de fármacos.
- Os achados podem contribuir para avanços no tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
As larvas de peixe-zebra fornecem uma plataforma rápida e escalonável in vivo para avaliar radiosensibilizadores e radioprotetores candidatos, atendendo a uma necessidade crítica de triagem funcional em estágios iniciais na descoberta de fármacos para radioterapia. Este modelo permite a avaliação quantitativa da radiotoxicidade e da eficácia do fármaco, apoiando a confiança preditiva e a redução de riscos mecanicistas no ponto de inflexão da validação pré-clínica. A integração de ensaios baseados em peixe-zebra nos processos de descoberta melhora a triagem de portfólios e acelera a identificação de modificadores da radiação promissores para aplicações em oncologia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a validação funcional de candidatos a radiosensibilizadores e radioprotetores em um sistema vertebrado.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao associar a exposição ao fármaco com desfechos fenotípicos e desenvolvimentais após irradiação.
- Facilita a testagem rápida de hipóteses sobre efeitos modificadores da radiação em um contexto de organismo inteiro.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma semi-alta em rendimento para triagem de bibliotecas de compostos com atividade radiomodificadora.
- Fornece desfechos quantitativos e reprodutíveis, como sobrevivência, frequência cardíaca e fenótipos morfológicos.
- Permite condições padronizadas de ensaio para comparação cruzada de fármacos candidatos e controles.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a desfechos relevantes para doenças ao modelar toxicidade induzida por radiação e proteção in vivo.
- Apóia a continuidade desde a descoberta inicial até a validação pré-clínica de modificadores da radiação.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para portfólios de medicamentos oncológicos direcionados ao aprimoramento da radioterapia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio com embrião de peixe-zebra conecta a fase inicial de descoberta à validação pré-clínica, permitindo a triagem rápida e a avaliação funcional de modificadores da radiação antes dos estudos em mamíferos.
- Biologia da Descoberta: Apoia o teste de hipóteses nulas para a modulação induzida por fármacos na resposta à radiação.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio com saídas fenotípicas quantitativas e reprodutíveis.
- Análises: Permite a comparação estatística de sobrevivência, desenvolvimento e parâmetros fisiológicos entre grupos de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Modela a radiotoxicidade e a proteção in vivo relevantes para as linhas de oncologia.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e escalável para triagem repetida de conjuntos diversos de compostos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na descoberta de modificadores da radiação.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho padronizados, reprodutíveis e escaláveis para triagem in vivo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento e a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em fármacos candidatos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de agentes modificadores da radiação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manejo de peixe-zebra, estadiamento de embriões e avaliação fenotípica.
- Requer acesso a equipamentos de irradiação com raios X e infraestrutura de imagem para análise do ponto final.
- Exige padronização entre equipes nos procedimentos do ensaio, nas doses e nos critérios de pontuação.
- Pode exigir adaptação para classes específicas de compostos ou doses de radiação.
- As limitações práticas incluem restrições na capacidade de processamento e a necessidade de um gerenciamento cuidadoso dos grupos controle.
