Name: Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprenda a quantificar a caspase-9 em tecido retiniano usando imunohistoquímica e microscopia confocal. Este método permite investigar funções apoptóticas e não apoptóticas em modelos de oclusão de veia retiniana.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 e pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) dos National Institutes of Health (NIH), número de prêmio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT), e o Departamento de Defesa do Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
1. Preparação do tecido retiniano e criossecção
<ol><li>Eutanasiar os animais por meio de anestesia intraperitoneal (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e perfundir os camundongos submetidos a RVO (ver8 para detalhes) com paraformaldeído a 4% (PFA) usando uma bomba peristáltica. NOTA: Dedo do pé beliscar o animal para confirmar a profundidade da anestesia antes de prosseguir com a eutanásia e perfusão. Detalhes sobre a perfusão podem ser encontrados em16.</li>
	<li>Colha os olhos por enucleação cuidadosa usando fórceps e coloque o globo em 1 mL de PFA a 4%. Deixe os olhos durante a noite a 4 °C. Lave os olhos três vezes por 10 min, adicionando 1 mL de 1x PBS e colocando-os no agitador.</li>
	<li>Mergulhe os olhos em 1 mL de sacarose a 30% por 3 dias, até que eles se depositem no fundo do tubo, indicando absorção da sacarose.</li>
	<li>Encha os olhos com um composto de temperatura de corte ideal usando uma seringa de 30 G, até que o olho tenha uma aparência arredondada (aproximadamente 50 μL).</li>
	<li>Incorpore os olhos em um criomuldo com composto de temperatura de corte ideal até que os olhos estejam cobertos e congelem a -80 °C até que estejam prontos para a criosecção.</li>
	<li>A seção incorporou os olhos a 20 μm em lâminas de vidro usando um criostato.<ol><li>Remova o bloco composto de temperatura de corte ideal do criomolde.</li>
		<li>Coloque-o no mandril do criostato adicionando o composto de temperatura de corte ideal e colocando o bloco no manuseio. Deixe-o dentro do criostato até congelar.</li>
		<li>Prossiga para cortar o bloco a 20 μm até que o tecido da retina seja visto. NOTA: Isso pode ser confirmado com um microscópio de luz com ampliação de 30x (objetiva de 3x, oculares de 10x). Os tecidos podem ser distinguidos dos meios OCT por cor e forma.</li>
		<li>Colete o tecido da retina em lâminas de microscópio em uma série de quatro seções por lâmina. NOTA: Consulte a Figura 1A para sugerir a colocação de seções da retina.</li>
	</ol></li>
	<li>Rotule os slides com um ID que desidentifique o tratamento e o genótipo.</li>
	<li>Conservar as lâminas a -20 °C até à coloração.</li>
</ol>2. Imuno-histoquímica
NOTA: Use tecido criopreservado fixo para imuno-histoquímica para manter a morfologia celular. Escolha seções que estejam no nível das imagens de tomografia de coerência óptica (OCT) adquiridas in vivo7. Use as duas primeiras séries de lâminas coletadas do criostato ou seções de 150 μm no tecido da retina.
<ol><li>Coloque os slides em uma câmara de deslizamento escura e úmida.</li>
	<li>Permeabilização e bloqueio: Lave as seções transversais da retina com 300 μL de 1x PBS por 5 min para remover a OCT e descartar depois.</li>
	<li>Permeabilizar o tecido adicionando 300 μL de 1x PBS com Triton X-100 a 0,1% por 2 h à temperatura ambiente (RT) e descartar após.</li>
	<li>Bloquear o tecido adicionando 300 μL de tampão bloqueador (10% de soro de cabra normal (NGS), 1% de albumina sérica bovina (BSA) em 1x PBS, filtrado) e deixar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Anticorpos primários: Diluem os anticorpos primários em tampão de bloqueio. Os anticorpos primários utilizados incluem anti-cl-caspase-9 à 1:800, anti-CD31 à 1:50 e anti-caspase-7-488 (anticorpo marcado directamente) à 1:150. NOTA: Siga as recomendações do fabricante para a diluição adequada dos anticorpos primários.<ol><li>Despeje o tampão de bloqueio das seções e aplique 100 μL do coquetel de anticorpos primários nas lâminas da retina.</li>
		<li>Incubar as secções transversais durante a noite a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave as seções quatro vezes por 5 min com 300 μL de 1x PBS. NOTA: Se as seções de tecido forem muito frágeis, as lavagens devem ser removidas usando ação capilar, aplicando um tecido no canto da lâmina para evitar o deslocamento das seções da retina.</li>
	<li>Para evitar a marcação cruzada de anticorpos primários criados na mesma espécie hospedeira, complete a coloração com anticorpos secundários antes de aplicar os anticorpos diretamente marcados.</li>
	<li>Anticorpos secundários: Diluir os anticorpos secundários em tampão de bloqueio a uma concentração de 0,1%. Por exemplo, para detectar anti-cl-caspase-9, um anticorpo criado em coelho, use cabra-anti-coelho-568 secundário.<ol><li>Aplique 200 μL do coquetel de anticorpos secundários nas retinas.</li>
		<li>Incubar o tecido por 2 h no RT.</li>
		<li>Lave as seções quatro vezes por 5 min com 300 μL de 1x PBS.</li>
		<li>Coloração dos núcleos por 5 min com 300 μL de DAPI a uma diluição de 0,02%.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave uma vez por 5 min com 300 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Coloque uma tampa nas seções da retina usando 500 μL de meio fluoromount-G, que preserva o sinal fluorescente, e coloque cuidadosamente a tampa na parte superior da lâmina, evitando bolhas.</li>
</ol>3. Imagem confocal
<ol><li>Adquira imagens das seções coradas com microscopia confocal.<ol><li>Ligue o microscópio confocal.</li>
		<li>Coloque o slide no palco.</li>
		<li>Ajuste o foco para ver a seção da retina claramente. NOTA: Tire pelo menos quatro imagens por seção e imagem quatro seções por retina. Consulte o esquema de imagem da retina para áreas de imagem sugeridas (Figura 1B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem de caspase, coloração vascular e nuclear usando um microscópio confocal que possui aquisição de pilha Z, usando uma objetiva de 20x ou 40x. NOTA: Os parâmetros de imagem e a configuração do software devem ser constantes para todas as imagens em um experimento. O objetivo de 20x fornece uma visão geral das camadas da retina, que são bem definidas pela coloração nuclear. A objetiva de 40x fornece mais detalhes celulares.<ol><li>Defina os tempos apropriados de exposição e intensidade do laser por canal clicando em adquirir configurações.</li>
		<li>Defina a pilha Z para visualizar toda a seção clicando em Série Z e configure parâmetros para cima e para baixo para cobrir a profundidade do tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Salve as imagens seguindo o ID mascarado atribuído durante a criossecção.</li>
</ol>4. Quantificação dos níveis de caspase
<ol><li>Arraste arquivos de imagem de 405, 470, 555 e 640 canais para o console da FIJI.</li>
	<li>Clique em Imagem > Cores > Mesclar Canais.</li>
	<li>Atribua cores aos arquivos da seguinte maneira: vermelho a 555, verde a 470, cinza a 405, ciano a 640.</li>
	<li>Comprima a pilha Z clicando em Imagem > Pilha > Projeto Z.</li>
	<li>Clique em Tipo de projeção: intensidade máxima.</li>
	<li>Abra a Interface de Canais clicando em Imagem > Ferramenta de Canais de Cor.</li>
	<li>Abra a interface Brilho e Contraste .</li>
	<li>Selecione parâmetros por canal.<ol><li>Vá para Canais e selecione um canal.</li>
		<li>Coloque o cursor sobre a célula expressa caspase e anote o valor do pixel.</li>
		<li>Coloque o cursor sobre o plano de fundo e anote o valor do pixel.</li>
	</ol></li>
	<li>Parâmetros de teste<ol><li>Vá para a interface Brilho e Contraste.</li>
		<li>Clique em Selecionar.</li>
		<li>Conecte o valor mínimo exibido (valor de pixel anotado da célula expressa caspase).</li>
		<li>Conecte o valor máximo exibido (valor de pixel anotado do plano de fundo).</li>
		<li>Clique em Ok.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita as etapas 4.8-4.9 para todos os canais.</li>
	<li>Teste os parâmetros escolhendo imagens aleatórias de tecido cego. Observação : edite os parâmetros de brilho e contraste somente se o valor de plano de fundo não for adequado para outras imagens.</li>
	<li>Uma vez que os parâmetros são definidos, abra os arquivos de imagem e comprima a pilha Z.</li>
	<li>Adicione os parâmetros de brilho e contraste para o canal de caspase e a isolectina, canal marcador vascular.</li>
	<li>Use a ferramenta de ponto para quantificar o número de áreas vasculares positivas usando a colocalização do marcador vascular com expressão de caspase como leitura de áreas positivas.</li>
	<li>Repita o passo 4.14, mas utilizando Hoechst como marcador de áreas neuronais positivas.</li>
	<li>Anote os valores em uma planilha por imagem.</li>
	<li>Média dos valores por seção.</li>
	<li>Média dos valores de seção - esta será a leitura por olho.</li>
</ol>5. Confirmação genética da relevância da caspase de células endoteliais-9
<ol><li>Utilizar retinas obtidas dos camundongos Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 submetidos ao RVO7.</li>
	<li>Imunocorar as retinas para caspase-9 (a caspase eliminada), caspase-7 (uma caspase efetora a jusante), marcadores vasculares e DAPI, conforme descrito acima na secção 2.</li>
	<li>Fotografar e quantificar conforme descrito acima nas seções 3 e 4.</li>
</ol>6. Visando a caspase-9 no RVO
<ol><li>Obter olhos dos camundongos submetidos a RVO seguido da aplicação do inibidor de caspase-9 Pen1-XBir3 topicamente aos olhos como em7.</li>
	<li>Imunocorar as retinas para caspase-7 (uma caspase efetora a jusante), marcadores vasculares e DAPI, conforme descrito acima na secção 2.</li>
	<li>Fotografar e quantificar conforme descrito acima nas seções 3 e 4.</li>
</ol>

<ol><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
<li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamirez%2C+MLG+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22">Seminars in Cell & Developmental Biology</a>. 82, Academic Press. 79-85 (2018).</li>
<li>Troy, C. M., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+therapeutic+targets+in+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Caspases: therapeutic targets in neurologic disease.</a> Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).</li>
<li>Avrutsky, M. I., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9%3A+a+multimodal+therapeutic+target+with+diverse+cellular+expression+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 1728(2021).</li>
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<li>Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+caspases+in+the+nervous+system%3A+implications+for+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62980(2021).</li>
<li>Tisch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+modulates+physiological+and+pathological+angiogenesis+during+retina+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).</li>
<li>Chi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+promotes+the+activation+of+NLRP3+and+caspase-8+inflammasomes+via+NF-kappaB+pathway+in+acute+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 137(2015).</li>
<li>Thomas, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+mediates+site-specific+retinal+ganglion+cell+death+after+blunt+ocular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Akpan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+delivery+of+caspase-9+inhibitor+reduces+caspase-6-dependent+axon%2Fneuron+loss+and+improves+neurological+function+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke.</a> The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).</li>
<li>Kuida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+apoptosis+and+cytochrome+c-mediated+caspase+activation+in+mice+lacking+caspase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9.</a> Cell. 94 (3), 325-337 (1998).</li>
<li>Troy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+the+balance%3A+alternative+participation+of+the+caspase-2+and+-9+pathways+in+neuronal+death+induced+by+nerve+growth+factor+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram os seguintes interesses concorrentes: C.M.T. tem os seguintes pedidos de patente US20200164026, US20190142915 e US20150165061. C.M.T. e S.S. têm um pedido de patente 20140024597 nos EUA. C.M.T., A.M.P. e M.I.A. têm um pedido de patente US2020058683. C.M.T. e Y.Y.J. têm um pedido de patente WO2018013519. M.I.A e C.M.T estão listados como inventores em um pedido de patente WO/2020/223212 pelos curadores da Universidade de Columbia, na cidade de Nova York. Os demais autores declaram não haver interesses concorrentes.

As caspases são uma família de proteases com vários membros melhor estudada por seus papéis na morte celular e inflamação; no entanto, mais recentemente, uma variedade de funções de não-morte tem sido descoberta para alguns membros da família 4,5. Grande parte da nossa compreensão da função da caspase é derivada do trabalho em cultura de células e de dados inferenciais de doenças humanas. Embora seja apreciado que haja indução, ativação ou inativação aberrante de...

As caspases são uma família de proteases que regulam a morte celular do desenvolvimento, as respostas imunes e a morte celular aberrante na doença 1,2. Embora seja bem sabido que os membros da família da caspase são induzidos em uma variedade de doenças neurodegenerativas, entender qual caspase impulsiona a patologia da doença é mais desafiador3. Tais estudos requerem ferramentas para identificar, caracterizar e validar a função de membros individuais da família caspase. A análise das caspases individuais relevantes é importante tanto do ponto de vista mecanicista quanto terapêutico, pois a literatura possui múltiplos estudos que fornecem evidências dos diversos papéis das caspases 4,5. Assim, se o objetivo é direcionar uma caspase em uma doença para um benefício terapêutico, é fundamental ter um direcionamento específico do(s) membro(s) relevante(s) da família. As técnicas tradicionais para detectar os níveis de caspase no tecido incluem western blotting e abordagens enzimáticas e fluorométricas 3,6. No entanto, nenhuma dessas medidas permite a detecção específica de células dos níveis de caspase e, em alguns cenários, as caspases clivadas muitas vezes não podem ser detectadas pelas medidas tradicionais de análise de proteínas. Sabe-se que as caspases podem desempenhar diferentes papéis apoptóticos e não apoptóticos no mesmo tecido7, portanto, é necessária uma caracterização cuidadosa dos níveis de caspase específicos das células para a compreensão precisa das vias de desenvolvimento e da doença.
Este estudo mostra a ativação e a função da caspase em um modelo de hipóxia-isquemia neurovascular - oclusão da veia retiniana (RVO)7,8. Em um tecido complexo como a retina, existem vários tipos de células que podem ser afetadas pela hipóxia-isquemia induzida no RVO, incluindo células gliais, neurônios e vasculatura7. Na retina adulta de camundongos, há muito pouca expressão de caspases evidentes no tecido saudável, medida pela imuno-histoquímica (IHC)7, mas esse não é o caso durante o desenvolvimento9 ou em modelos de doença retiniana10,11. A IHC é uma técnica bem estabelecida na pesquisa biomédica e tem permitido a validação de alvos patológicos e patológicos, a identificação de novos papéis por meio da localização espacial e a quantificação de proteínas. Nos casos em que os produtos de caspase clivada não podem ser detectados por western blot ou análise fluorométrica, nem a localização celular específica de caspases distintas ou interrogação de vias de sinalização de caspase através da localização, então o IHC deve ser usado.
Para determinar a(s) caspase(s) funcionalmente relevante na RVO, a IHC foi utilizada com anticorpos validados para caspases e marcadores celulares. Os estudos prévios realizados em laboratório mostraram que a caspase-9 foi rapidamente ativada em um modelo de acidente vascular cerebral isquêmico e inibição da caspase-9 com um inibidor altamente específico protegido da disfunção neuronal e da morte12. Como a retina faz parte do sistema nervoso central (SNC), ela serve como um sistema modelo para consultar e investigar melhor o papel da caspase-9 em lesões neurovasculares13. Para este fim, o modelo de RVO em camundongo foi usado para estudar a localização e distribuição específicas da célula da caspase-9 e sua implicação na lesão neurovascular. A RVO é uma causa comum de cegueira em adultos em idade ativa que resulta de lesão vascular14. Verificou-se que a caspase-9 foi expressa de forma não apoptótica em células endoteliais, mas não em neurônios.
Como tecido, a retina tem a vantagem de ser visualizada como uma montagem plana, que permite a apreciação das redes vasculares, ou como seções transversais, que destacam as camadas neuronais da retina. A quantificação da expressão da proteína caspase em cortes transversais fornece contexto, em relação ao qual a caspase é potencialmente crítica na conectividade neuronal da retina e na função da visão, identificando a localização da(s) caspase(s) na retina. Após a identificação e validação, o direcionamento da caspase de interesse é alcançado usando a deleção específica de células induzíveis da caspase identificada. Para possíveis investigações terapêuticas, a relevância das caspases de interesse foi testada usando ferramentas específicas para inibir a caspase ativada. Para a caspase-9 uma célula persignificava inibidor altamente seletivo 7,15, Pen1-XBIR3 foi utilizada. Para este relato, foram utilizadas cepas C57BL/6J masculinas de 2 meses de idade e knockout endotelial induzível por tamoxifeno caspase-9 (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J. Esses animais foram expostos ao modelo de camundongo de RVO e C57BL/6J foram tratados com o inibidor seletivo da caspase-9, Pen1-XBir3. A metodologia descrita pode ser aplicada a outros modelos de doença nos sistemas central e periférico 7,15.

<table><tbody><tr><td>anti-Caspase-7 488</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB-56529AF488</td><td>uso a 1:150</td></tr><tr><td>anti-cl-Caspase-9</td><td>Cell Signaling</td><td>9505-S</td><td>uso a 1:800</td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>uso a 1:50</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Disco Giratório Biovision</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 2.3.0</td><td>código aberto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fluormount G</td><td>Fisher</td><td>50-187-88</td><td></td></tr><tr><td>Roboz</td><td></td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 camundongos</td><td>gerados</td><td></td><td>em laboratório ver Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Isolectina (594, 649)</td><td>Uso do vetor</td><td>DL-1207</td><td>a 1:200</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão&nbsp;</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen1-XBir3</td><td>gerado</td><td></td> em laboratório, <td>consulte Avrutsky 2020</td></tr><tr><td>Prism 9.1</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Fisher</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Vis-a-View 4.0</td><td>Sistemas Visitron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação da caspase-9 imunocorada em tecido retiniano

Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue

A família das caspases é conhecida por mediar muitas vias celulares além da morte celular, incluindo diferenciação celular, pathfinding axonal e proliferação. Desde a identificação da família das proteases de morte celular, tem havido uma busca por ferramentas para identificar e expandir a função de membros específicos da família em estados de desenvolvimento, saúde e doença. No entanto, muitas das ferramentas de caspase atualmente disponíveis comercialmente que são amplamente utilizadas não são específicas para a caspase alvo. Neste relato, delineamos a abordagem que usamos para identificar, validar e direcionar a caspase-9 no sistema nervoso usando um novo inibidor e abordagens genéticas com leituras imuno-histoquímicas. Especificamente, utilizamos o tecido neuronal da retina como modelo para identificar e validar a presença e a função das caspases. Essa abordagem permite o interrogatório de funções específicas da caspase-9 apoptóticas e não apoptóticas do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular, e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.

O protocolo descrito permite ao usuário analisar e quantificar os níveis de caspase-9 no tecido da retina. Além disso, apresenta ferramentas para identificar, validar e direcionar especificamente a caspase-9 e os substratos a jusante. As etapas resumidas permitem a análise quantificável dos níveis de caspase e da especificidade celular em fotomicrografias fluorescentes. Todas as figuras mostram fotomicrografias representativas e quantificação dos níveis de caspase indicados na retina total, células endoteliais e neurônio...

Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.

Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano

The family of caspases is known to mediate many cellular pathways beyond cell death, including cell differentiation, axonal pathfinding, and ...

Este protocolo fornece um método imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos. A principal vantagem desta técnica é que permite a interrogação de funções específicas da caspase-9 apoptótica e não apoptótica do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.Comece a quantificar os níveis de caspase usando imagens de microscopia confocal de cortes corados da retina. Para fazer isso, arraste os arquivos de imagem de 405, 470, 555 e 640 canais para o console de Fiji. Clique nas guias de imagem, cor e mesclagem de canais para atribuir cores aos arquivos.Em seguida, compacte a pilha Z clicando na pilha de imagens e no projeto Z. Selecione o tipo de projeção como intensidade máxima. Abra a interface do canal clicando na imagem seguida da ferramenta do canal de cores.Em seguida, abra a interface de brilho e contraste. Para selecionar os parâmetros por canal, vá para a guia do canal e escolha um canal. Coloque o cursor sobre o plano de fundo e anote o valor do pixel.Em seguida, coloque o cursor na célula expressa em caspase e anote o valor do pixel. Para testar os parâmetros, vá para a interface de brilho e contraste e clique em selecionar. Conecte o valor mínimo exibido ou o valor de pixel da célula expressa em caspase.Em seguida, conecte o valor máximo exibido ou o valor do pixel de plano de fundo antes de clicar em OK. Escolha as imagens aleatórias do tecido cego e repita a seleção de parâmetros por canal para testar os parâmetros para todos os canais. Depois que os parâmetros estiverem definidos, abra os arquivos de imagem e compacte a pilha Z.Adicione os parâmetros de brilho e contraste para o canal caspase e a isolectina para o canal marcador vascular. Use a ferramenta pontual e quantifique o número de áreas vasculares positivas usando a colocalização do marcador vascular com expressão de caspase como leitura de áreas positivas. Em seguida, usando ganchos como marcador de áreas neuronais positivas, quantifique o número de áreas vasculares positivas.Anote os valores em uma planilha por imagem e faça a média dos valores por seção. Média dos valores de seção, que será a leitura por olho. O protocolo identificou a localização celular das caspases e das camadas neuronais da retina nas quais as caspases são expressas.A secção transversal da retina permitiu a visualização dos núcleos da retina na camada ganglionar da retina ou RGL, camada internuclear ou INL, e da camada nuclear externa ou ONL quando corada com ganchos. Na seção transversal, os vasos sanguíneos da retina apareceram desconectados e separados suprindo as camadas plexiformes entre o RGL e o INL e entre o INL e o ONL. Cortes transversais da retina também identificaram a caspase-9 altamente regulada, um dia após a oclusão da veia retiniana.A inibição da caspase-9 foi mais eficaz na redução da expressão neuronal da caspase-7 em camundongos knockout de células endoteliais, o que validou a relevância funcional da caspase-9 endotelial. A análise representativa mostrou que a inibição da atividade da caspase-9 bloqueou farmacologicamente a expressão da caspase-7 após a oclusão da veia retiniana. O sucesso da técnica depende de uma cuidadosa preparação tecidual, bem como de IHC e imagens microscópicas para garantir a consistência, validade e confiabilidade dos dados.Este método pode ser combinado com a análise de western blotting para comparação semiquantitativa da sinalização da caspase. A técnica forneceu os passos para interrogar a eficácia de uma abordagem terapêutica visando a caspase-9 ativa na RVO. Esta abordagem também pode ser aplicada a outros tecidos, incluindo o cérebro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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