Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

ATAC-seq nos permite identificar o status das regiões abertas da cromatina no genoma, que muitas vezes é alterado nos estados de doença em comparação com a condição normal. Menos entrada celular, um protocolo simplificado de digestão Tn5, seguido de isolamento de DNA fragmentado e preparação de biblioteca por amplificação por PCR e menor tempo experimental tornam uma técnica mais vantajosa. A comparação do cenário epigenético alterado pelo ATAC-seq entre condições normais e de doença pode lançar luz sobre os elementos reguladores da cromatina associados à doença e ser útil para o desenho de novas estratégias terapêuticas.

Esta técnica é fácil de executar, pois não inclui nenhuma etapa experimental crítica. Para obter resultados bem-sucedidos do ATAC-seq, ele requer apenas algumas etapas de padronização. Para começar, transfira 25 microlitros de uma suspensão celular contendo um milhão de células por mililitro em PBS para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro e centrífuga a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Descarte cuidadosamente o sobrenadante e adicione 25 microlitros de tampão de lise. Ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo e incube no gelo por cinco minutos. Centrifugar a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar cuidadosamente o sobrenadante.

Ressuspeite imediatamente o pellet em 25 microlitros de mistura de reação Tn5 e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Misture a solução a cada 10 minutos. Adicionar cinco microlitros de acetato de sódio 3 molares e 125 microlitros de tampão PB à solução de ADN marcada com Tn5.

Misture bem. Em seguida, coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mililitros e aplique a amostra na coluna de rotação. Centrifugar a 17.900 G por um minuto à temperatura ambiente e descartar o fluxo.

Adicione o buffer PE à coluna e gire a coluna. Coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta e centrifuga-a por cinco minutos para secar a membrana completamente. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.

Eluir os fragmentos de DNA com 10 microlitros de tampão EB e deixar a coluna repousar por um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a 17.900 G por um minuto à temperatura ambiente para eluír o DNA. Configure a reação de PCR em tubos de PCR de 200 microlitros e execute o Programa de Amplificação de PCR Parte Um.

Para QPCR em tempo real, prepare a mistura de reação de PCR adicionando cinco microlitros de produto de PCR, 0,75 microlitros de 1.000 vezes diluído SYBR Gold, cinco microlitros de 2X PCR Master Mix e 3,75 microlitros de água livre de nuclease. Determine o número necessário de ciclos de PCR adicionais usando os parâmetros de execução. Depois que o número do ciclo for determinado, configure PCRs com os ciclos adicionais calculados anteriormente.

Aos produtos de PCR amplificados, adicione 150 microlitros de contas e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Coloque os tubos em um suporte magnético por cinco minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave as contas com 200 microlitros de etanol a 80% e remova o sobrenadante.

Retire completamente o etanol e seque as amostras ao ar livre por 10 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, volte a suspender com 50 microlitros de tampão de eluição. Coloque o tubo em um suporte magnético e, em seguida, transfira o eluado para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mililitro.

Uma comparação da eficiência da lise celular usando azul de tripano é mostrada aqui. As células NMuMG foram tratadas com tampão hipotônico e tampão CSK e coradas com azul de tripano. Maior eficiência de lise celular foi observada em células tratadas com CSK.

As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas a partir de células de câncer de mama MDA-MB-231. Após a amplificação por PCR, os produtos de PCR foram analisados em gel de 1,5% de TBE 0,5X e 1,5% de agarose antes e após a purificação das contas. Os primers são removidos principalmente pela purificação inicial das contas.

Padrões de banda de DNA de 1X TAE 1%agarose gel eletroforese e uma eletroforese automatizada também são indicados. O SYBR Gold foi utilizado para visualizar os fragmentos de DNA mostrados aqui. Uma trilha do navegador do genoma mostrando o locus ERS1 é apresentada aqui.

A cobertura do genoma dos dados ATAC-seq em células T47D é mostrada nesta imagem. Foram utilizados cartilhas de uma publicação anterior e suas regiões-alvo são destacadas em amarelo. Um gráfico de barras representando o enriquecimento do primer amplicon em bibliotecas ATAC-seq é mostrado aqui.

As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas pelo buffer hipotônico ou um buffer CSK. A imagem representativa mostra a visualização do navegador do genoma para otimização ATAC-seq. Os dados ATAC-seq da condição de entrada de 25.000 células mostraram o maior enriquecimento de fragmentos livres de nucleossomos, enquanto a condição de entrada de 100.000 células apresentou os DNAs mononucleossômicos mais altos.

Trilhas do navegador do genoma mostrando dados ATAC-seq de diferentes números de células são apresentadas aqui. A análise de anotação de pico HOMER é representada nesta imagem representativa. O HOMER classificou cada pico como um pico proximal ou distal promotor.

O número de opções de entrada celular do tampão de lise celular e a concentração da enzima Tn5 dependente do tipo de célula são o parâmetro mais crítico que deve ser padronizado. A Tn5 fundida com a proteína A na técnica de corte e aderência é amplamente utilizada para identificar o local de ligação ao DNA para uma proteína de interesse usando anticorpos específicos para essa proteína de interesse.