Name: Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a otimizar o protocolo ATAC-seq para células epiteliais em pesquisa de epigenética do câncer. Este método mapeia regiões de cromatina aberta usando digestão com Tn5 e amplificação por PCR.

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Agradecemos à instalação da UND Genomics Core pela excelente assistência técnica.
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] e fundos iniciais fornecidos pela Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade de Dakota do Norte, Departamento de Ciências Biomédicas [a M.T.].

1. Preparações antes do início da experiência
<ol><li>Preparar o depósito regulador de lise. NOTA: O buffer de isolamento nuclear ideal pode ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos testar tanto o tampão hipotônico utilizado no artigo original8 quanto um tampão CSK12,13 para cada tipo de célula usando a coloração azul de tripano.<ol><li>Para preparar o tampão hipotônico (tampão Greenleaf), misture 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.</li>
		<li>Para preparar o tampão CSK, misture 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Garantir que as condições de cultura celular sejam ótimas; examinar as células sob um microscópio de luz para se certificar de que não há níveis elevados de apoptose.</li>
	<li>Ligue a centrífuga para que atinja 4 °C.</li>
</ol>2. Colheita de células
<ol><li>Aspirar meios de uma cultura de células com <80% de confluência. As células são tipicamente cultivadas em um prato de 35 mm ou 60 mm, com base no número de células necessárias, tratamentos, etc.</li>
	<li>Lave as células com 1 mL ou 3 mL de PBS.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL ou 1 mL de tripsina e incube por 2-3 min (dependendo dos tipos de células). Use cuidadosamente uma pipeta de 1 mL para misturar bem.</li>
	<li>Adicione 1 mL ou 2 mL de meio ao prato e misture bem. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células em um tubo de 15 mL por 3 min a 300 x g. NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células.</li>
	<li>Aspirar o meio e ressuspender as células em 1 mL ou 2 mL de meio. NOTA: É fundamental preparar uma solução homogênea de célula única. Para tecidos, um homogeneizador Dounce pode ser usado para homogeneizar tecidos e minimizar grandes aglomerados de células ou agregados. Alguns tecidos requerem filtração (por exemplo, filtros celulares) e/ou classificação celular FACS para isolar células viáveis e obter uma única solução celular.</li>
	<li>Conte as células usando um contador de células. NOTA: Neste estudo, foi utilizado um contador de células automatizado (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Centrifugar o volume celular necessário (por exemplo, um volume contendo 1 x 106 células com base na contagem de células) a 300 x g durante 3 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Ressuspeite o pellet celular contendo 1 x 106 células em 1 mL de PBS frio. NOTA: Se o número de células for inferior a 1 x 10 6 células, diminua o volume PBS frio para preparar a solução celular na mesma concentração (1 x 106 células/mL).</li>
</ol>3. Lise celular
<ol><li>Transfira 25 μL (= 2,5 x 104 células) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.</li>
	<li>Adicione 25 μL de tampão de lise e ressuspenda as células por pipetagem suave para cima e para baixo. Incubar no gelo por 5 min</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante. NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.</li>
</ol>4. Marcação Tn5
<ol><li>Ressuspender imediatamente o pellet em 25 μL de mistura de reacção Tn5. A mistura de reação Tn5 é a seguinte: 12,5 μL de 2x tampão de DNA de tagmentação (tampão TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 e 11,25-7,5 μL de água livre de nuclease. NOTA: A concentração padrão de Tn5 é de 2,5 μL para 2,5 x 104 células.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C. NOTA: Misture a solução a cada 10 minutos.</li>
</ol>5. Purificação do DNA
NOTA: A purificação é necessária antes da amplificação. A purificação do DNA é feita usando o kit de purificação MinElute PCR (Tabela de Materiais).
<ol><li>Adicionar 5 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2).</li>
	<li>Adicione imediatamente 125 μL de Buffer PB e misture bem.</li>
	<li>Siga o protocolo do kit de purificação por PCR a partir da etapa 2.<ol><li>Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL.</li>
		<li>Aplicar a amostra na coluna de rotação e na centrífuga durante 1 min a 17.900 x g a RT.</li>
		<li>Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.</li>
		<li>Adicionar 750 μL de Buffer PE à coluna de rotação e centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT.</li>
		<li>Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.</li>
		<li>Centrifugar a coluna de rotação por 5 minutos para secar completamente a membrana.</li>
		<li>Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.</li>
		<li>Eluir os fragmentos de DNA com 10 μL de tampão EB.</li>
		<li>Deixe a coluna repousar por 1 min em RT.</li>
		<li>Centrífuga por 1 min a 17.900 x g em RT para eluír o DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Amplificação por PCR
NOTA: A amplificação por PCR de DNAs transpostos (marcados) é necessária para o sequenciamento. Os adaptadores de kit Nextera (Tabela de Materiais) foram usados neste exemplo. Os primers utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.
<ol><li>Configure a seguinte reação de PCR em tubos de PCR de 200 μL (50 μL para cada amostra). A mistura de reação de PCR é a seguinte: 10 μL de DNA eluído (etapa 5.), 2,5 μL de 25 mM Adapter 1, 2,5 μL de 25 mM Adapter 2, 25 μL de 2x PCR master mix e 10 μL de água livre de nuclease</li>
	<li>Executar o programa de amplificação por PCR parte 1 (Tabela 2). NOTA: Para a amplificação inicial, as mesmas condições são usadas para todas as amostras que usam um termociclador padrão.</li>
	<li>QPCR em tempo real (total de 14,5 μL por amostra)<ol><li>Usando 5 μL do produto da parte 1 de amplificação de PCR (etapa 6.2.), configure a seguinte reação, desta vez incluindo ouro SYBR e detecção em uma máquina de PCR em tempo real.</li>
		<li>Preparar a mistura de reação de PCR da seguinte forma: 5 μL de produto de PCR da etapa 6.2., 0,75 μL de ouro SYBR (diluído 1000x), 5 μL de mistura mestre de PCR 2x e 3,75 μL de água livre de nuclease. NOTA: Os números de ciclo precisos para amplificação de biblioteca antes de atingir a saturação para cada amostra são determinados por qPCR (Tabela 3) para reduzir o viés de GC e tamanho na PCR10. O SYBR Gold foi diluído com água isenta de nuclease. Para a confecção da solução diluída, 1 μL de SYBR Gold (concentração estoque de 10.000x) foi adicionado a 999 μL de água isenta de nuclease. O tempo de execução do RT-qPCR mencionado na Tabela 3 é de cerca de 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Determine o número necessário de ciclos de PCR adicionais usando os parâmetros de execução da etapa 6.3.<ol><li>Número de ciclos = 1/4 de intensidade máxima (saturada) de fluorescência (tipicamente 3 ou 4 ciclos de PCR)</li>
	</ol></li>
	<li>Programa de amplificação por PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabela 4): Depois de determinar o número do ciclo, configure os PCRs com ciclos adicionais calculados na etapa 6.4.1. Por exemplo, se o número de ciclo calculado for 3, configure 3 ciclos no programa abaixo. O total de ciclos seria 8 (5 na etapa 6.2., mais 3 ciclos adicionais na etapa 6.5.)</li>
</ol>7. Purificação de contas
NOTA: Aqui, foram utilizadas contas AMPure XP (Table of Materials).
<ol><li>Aos produtos de PCR amplificados na etapa anterior, adicione 150 μL de contas em RT. NOTA: As contas caseiras AMPure14 podem ser usadas neste processo.</li>
	<li>Incubar por 15 min no RT.</li>
	<li>Coloque os tubos em um suporte magnético por 5 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Lave as contas com 200 μL de etanol a 80%. NOTA: 80% de etanol deve ser preparado fresco.</li>
	<li>Repita a etapa 7.4.</li>
	<li>Remova o etanol completamente.</li>
	<li>Secar as amostras ao ar por 10 min no RT.</li>
	<li>Ressuspender com 50 μL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCL pH 8,0).</li>
	<li>Repita a purificação das esferas (etapas 7.1.-7.9.) para minimizar ainda mais a contaminação do primer.</li>
</ol>8. Concentração de DNA e verificação de qualidade
<ol><li>Meça a concentração de DNA usando um kit de quantificação de ácido nucleico (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Verifique os fragmentos de DNA amplificados por eletroforese em gel usando SYBR Gold (0,5x TBE, gel de agarose a 1,5%) ou um sistema de eletroforese automatizado (por exemplo, TapeStation, bioanalisador).</li>
</ol>9. Sequenciamento
<ol><li>Realizar o sequenciamento de alto rendimento utilizando as amostras de DNA amplificado12,13. NOTA: As amostras de DNA amplificado estão prontas para sequenciamento de alto rendimento. Para reter informações de fragmentos de DNA nucleossomal, recomenda-se o sequenciamento de extremidade emparelhada sobre o sequenciamento de extremidade única. Ambas as extremidades dos fragmentos de DNA indicam onde a transposase se liga. Para mapear regiões abertas de cromatina, 30 milhões de leituras/amostra são normalmente suficientes.</li>
</ol>10. Análise dos dados
<ol><li>Filtragem de dados com base na qualidade da chamada base: Defina a pontuação média mínima de qualidade da base para 20 (99% de precisão).</li>
	<li>Aparamento do adaptador: remova as sequências do adaptador usando uma ferramenta apropriada. Observação : A ferramenta wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) foi usada para remover sequências de adaptador. Para bibliotecas ATAC-seq preparadas pelo Illumina Tn5, a seguinte sequência é usada como uma sequência adaptadora: CTGTCTCTTATACACATCT. O comprimento mínimo da sequência para reconhecer a contaminação do adaptador é definido como 5.</li>
	<li>Mapeamento do genoma: Mapeie as leituras para o genoma apropriado com Bowtie usando os seguintes parâmetros "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Um exemplo de mapeamento da qualidade das células basais de câncer de mama MDA-MB-231 está abaixo: Leituras com pelo menos um alinhamento relatado: 52,79% Leituras que não conseguiram alinhar: 13,10% Leituras com alinhamentos suprimidos devido a -m: 34,11%</li>
	<li>Eliminação de duplicação: Marque as duplicatas de PCR pelas ferramentas Picard16.</li>
	<li>Gerando um arquivo de cobertura de genoma para visualização de dados: converta as leituras de extremidade emparelhadas desduplicadas em fragmentos de leitura de extremidade única. Os rastros de cobertura do genoma são obtidos utilizando-se o genomeCoverageBed from bedtools17.</li>
</ol>

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<li>Schep, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+nucleosome+fingerprints+enable+high-resolution+mapping+of+chromatin+architecture+within+regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions.</a> Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesses financeiros relevantes ou materiais que se relacionem com a pesquisa descrita neste artigo.

ATAC-seq tem sido amplamente utilizado para mapear regiões de cromatina abertas e ativas. A progressão das células cancerígenas é frequentemente impulsionada por alterações genéticas e reprogramação epigenética, resultando em acessibilidade alterada da cromatina e expressão gênica. Um exemplo dessa reprogramação é visto durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e seu processo reverso, a transição mesenquimal-epitélica (MET), que são conhecidos por serem os principais processos de reprogramação celular durante a met...

A acessibilidade à cromatina é um requisito fundamental para a regulação da expressão gênica em larga escalagenômica 1. Alterações na acessibilidade à cromatina são frequentemente associadas a vários estados de doença, incluindo câncer 2,3,4. Ao longo dos anos, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para permitir que os pesquisadores sondem a paisagem da cromatina mapeando regiões de acessibilidade à cromatina. Alguns deles incluem DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (isolamento assistido por formaldeído de elementos reguladores)6, MAPit (protocolo de acessibilidade à metiltransferase para modelos individuais)7 e o foco deste artigo, ATAC-seq (ensaio para cromatina acessível à transposase)8. O DNase-seq mapeia regiões acessíveis empregando uma característica fundamental da DNase, a saber, a digestão preferencial de DNA nu livre de histonas e outras proteínas, como fatores de transcrição5. O FAIRE-seq, semelhante ao ChIP-seq, utiliza reticulação e sonicação de formaldeído, exceto que não há imunoprecipitação envolvida, e as regiões livres de nucleossomos são isoladas por extração de fenol-clorofórmio6. O método MAPit utiliza uma metiltransferase GC para sondar a estrutura da cromatina na resolução de molécula única7. ATAC-seq baseia-se na transposase hiperativa, Tn58. A transposase Tn5 liga-se preferencialmente a regiões de cromatina abertas e insere adaptadores de sequenciamento em regiões acessíveis. O Tn5 opera através de um mecanismo de "cortar e colar" mediado por DNA, pelo qual a transposase pré-carregada com adaptadores se liga a locais de cromatina abertos, corta o DNA e liga-se aos adaptadores8. As regiões ligadas a Tn5 são recuperadas por amplificação por PCR usando primers que recozidos para esses adaptadores. FAIRE-seq e DNase-seq requerem uma grande quantidade de material de partida (~100.000 células a 225.000 células) e uma etapa de preparação de biblioteca separada antes do sequenciamento9. Por outro lado, o protocolo ATAC-seq é relativamente simples e requer um pequeno número de células (<50.000 células)10. Ao contrário das técnicas FAIRE-seq e DNase-seq, a preparação da biblioteca de sequenciamento do ATAC-seq é relativamente fácil, pois a amostra de DNA isolada já está sendo marcada com os adaptadores de sequenciamento por Tn5. Portanto, apenas a etapa de amplificação por PCR com primers apropriados é necessária para concluir a preparação da biblioteca, e as etapas de processamento prévias, como reparo final e ligadura do adaptador, não precisam ser realizadas, economizando tempo11. Em segundo lugar, o ATAC-seq evita a necessidade de conversão, clonagem e amplificação de bissulfito com primers específicos da região necessários para o MAPit7. Devido a essas vantagens, o ATAC-seq tornou-se um método extremamente popular para definir regiões abertas de cromatina. Embora o método ATAC-seq seja simples, várias etapas exigem otimização para obter dados de alta qualidade e reprodutíveis. Este manuscrito discute procedimentos de otimização para a preparação padrão da biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente três parâmetros: (1) composição do tampão de lise, (2) concentração de transposase Tn5 e (3) número de células. Além disso, este artigo fornece dados de exemplo das condições de otimização usando células epiteliais aderentes cancerosas e não cancerosas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Natural</td></tr><tr><td>10 &micro; L XL Pontas TipOne</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Filtradas e de baixa retenção</td></tr><tr><td>100 &micro; L XL TipOne RPT tips</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>Filtrado e de baixa retenção</td></tr><tr><td>100 &micro; L XL Pontas TipOne</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840</td><td>Filtradas e de baixa retenção. Tubos</td></tr> de <tr><td>Centrífuga Cônicos</td> de Grau Chanfrado <td>15 mL Corning</td><td></td> 352096 <td></td></tr><tr><td>20 &micro; L TipOne Pontas RPT</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1810</td><td>Filtradas e de baixa retenção</td></tr><tr><td>200 &micro; L TipOne RPT tips</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td> Tubos de centrífuga <td>filtrados e de baixa retenção</td></tr><tr><td>de 50 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr>Grau de <td>análise YBP136010 genética</td>científica <td>ThermoFisher</td><td></td><td>Agarose</td></tr><tr><td>Todas as linhagens celulares utilizadas neste estudo são obtidas da centrífuga ATCC</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R Beckman</td><td>Coulter</td><td>364658</td><td>SX2415</td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Kit de purificação de contas</td></tr><tr><td>CellDrop Cell Counter</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop FL</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>BioUltra, anidro, &ge; 99% (titulação)</td></tr> <tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC615100020</td><td>Anidro; Fisher Scientific - Decon Labs Produtos de Esterilização</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - Testado TET</td><td>R& D Systems</td><td>S10350</td><td>Triplo 0.1 &micro; m filtrado</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td>[+] 4,5 g/L D-glicose; [+] L-Glutamina; [-] Piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Gibco PBS 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>(0,25%), vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>IBI Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Qubit Fluorômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>kit de purificação de DNA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>IBI Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>BioXtra, &ge; 98% (acidimétrico), pellets (anidro)</td></tr><tr><td>NEBPróximo PCR de Alta Fidelidade 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>Nextera Kit de Preparação de Amostras de DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td>2x TD e Tn5 Transposase</td></tr><tr><td>NP - 40 (IGEPAL CA-630)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I8896</td><td>para biologia molecular</td></tr><tr><td>Sistema de Detecção de PCR</td><td>BioRad</td><td>1855484</td><td>Sistema em tempo real CFX384. C1000 Touch Thermal Cycler</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1851</td><td>Certificado BioPerformance, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensaio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen; Kit de quantificação de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Quibit Tubos de</td> ensaio <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>MilliporeSigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td> <td>caseiro-pH</td> <td>5.2</td><td></td></tr> <tr><td>Sacarose</td><td>IBI Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Verde Supermix, 1.25 mL</td><td>BioRad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td>Flex-free, natural, polipropileno</td></tr><tr><td>TempPlate 384-WELL PCR PLATE</td><td>USA Scientific</td><td>1438-4700</td><td>Entalhe único. </td></tr><tr><td>Base Tris de</td> polipropileno natural <td>MilliporeSigma</td><td>648311</td><td>ULTROL Grade</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>IBI Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-121-1003</td><td>emparelhado</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>BioXtra, líquido viscoso</td></tr><tr><td>Água</td><td>MilliporeSigma</td><td>W3500</td><td>filtrada estéril, BioReagent, adequada para cultura de células</td></tr></tbody></table>

otimização atac-seq para pesquisa em epigenética do câncer

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) sonda a acessibilidade do ácido desoxirribonucleico (DNA) usando a transposase hiperativa Tn5. Tn5 corta e ligadura adaptadores para sequenciamento de alto rendimento dentro de regiões de cromatina acessíveis. Nas células eucarióticas, o DNA genômico é embalado em cromatina, um complexo de DNA, histonas e outras proteínas, que atua como uma barreira física à maquinaria transcricional. Em resposta a sinais extrínsecos, os fatores de transcrição recrutam complexos de remodelação da cromatina para permitir o acesso à maquinaria transcricional para a ativação do gene. Portanto, a identificação de regiões abertas da cromatina é útil ao monitorar as atividades do potenciador e do promotor de genes durante eventos biológicos, como a progressão do câncer. Uma vez que este protocolo é fácil de usar e tem um baixo requisito de entrada celular, o ATAC-seq tem sido amplamente adotado para definir regiões abertas da cromatina em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas. Para uma aquisição de dados bem-sucedida, vários parâmetros precisam ser considerados ao preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre eles, a escolha do tampão de lise celular, a titulação da enzima Tn5 e o volume inicial de células são cruciais para a preparação da biblioteca ATAC-seq em células cancerígenas. A otimização é essencial para gerar dados de alta qualidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos métodos de otimização ATAC-seq para tipos de células epiteliais.

Para obter dados ATAC-seq bem-sucedidos e de alta qualidade, é importante otimizar as condições experimentais. A preparação da biblioteca ATAC-seq pode ser separada em cinco etapas principais (Figura 1), a saber, lise celular, tagmentação (fragmentação e inserção do adaptador por Tn5), purificação do DNA genômico, amplificação por PCR e análise de dados. Como um processo inicial, o tampão de lise celular (isolamento nuclear) deve ser primeiro otimizado para cada tipo de célula. O tampão hipo...

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

ATAC-seq nos permite identificar o status das regiões abertas da cromatina no genoma, que muitas vezes é alterado nos estados de doença em comparação com a condição normal. Menos entrada celular, um protocolo simplificado de digestão Tn5, seguido de isolamento de DNA fragmentado e preparação de biblioteca por amplificação por PCR e menor tempo experimental tornam uma técnica mais vantajosa. A comparação do cenário epigenético alterado pelo ATAC-seq entre condições normais e de doença pode lançar luz sobre os elementos reguladores da cromatina associados à doença e ser útil para o desenho de novas estratégias terapêuticas.Esta técnica é fácil de executar, pois não inclui nenhuma etapa experimental crítica. Para obter resultados bem-sucedidos do ATAC-seq, ele requer apenas algumas etapas de padronização. Para começar, transfira 25 microlitros de uma suspensão celular contendo um milhão de células por mililitro em PBS para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro e centrífuga a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte cuidadosamente o sobrenadante e adicione 25 microlitros de tampão de lise. Ressuspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo e incube no gelo por cinco minutos. Centrifugar a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar cuidadosamente o sobrenadante.Ressuspeite imediatamente o pellet em 25 microlitros de mistura de reação Tn5 e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Misture a solução a cada 10 minutos. Adicionar cinco microlitros de acetato de sódio 3 molares e 125 microlitros de tampão PB à solução de ADN marcada com Tn5.Misture bem. Em seguida, coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mililitros e aplique a amostra na coluna de rotação. Centrifugar a 17.900 G por um minuto à temperatura ambiente e descartar o fluxo.Adicione o buffer PE à coluna e gire a coluna. Coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta e centrifuga-a por cinco minutos para secar a membrana completamente. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.Eluir os fragmentos de DNA com 10 microlitros de tampão EB e deixar a coluna repousar por um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a 17.900 G por um minuto à temperatura ambiente para eluír o DNA. Configure a reação de PCR em tubos de PCR de 200 microlitros e execute o Programa de Amplificação de PCR Parte Um.Para QPCR em tempo real, prepare a mistura de reação de PCR adicionando cinco microlitros de produto de PCR, 0,75 microlitros de 1.000 vezes diluído SYBR Gold, cinco microlitros de 2X PCR Master Mix e 3,75 microlitros de água livre de nuclease. Determine o número necessário de ciclos de PCR adicionais usando os parâmetros de execução. Depois que o número do ciclo for determinado, configure PCRs com os ciclos adicionais calculados anteriormente.Aos produtos de PCR amplificados, adicione 150 microlitros de contas e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Coloque os tubos em um suporte magnético por cinco minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave as contas com 200 microlitros de etanol a 80% e remova o sobrenadante.Retire completamente o etanol e seque as amostras ao ar livre por 10 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, volte a suspender com 50 microlitros de tampão de eluição. Coloque o tubo em um suporte magnético e, em seguida, transfira o eluado para um tubo de microcentrífuga fresco de 1,7 mililitro.Uma comparação da eficiência da lise celular usando azul de tripano é mostrada aqui. As células NMuMG foram tratadas com tampão hipotônico e tampão CSK e coradas com azul de tripano. Maior eficiência de lise celular foi observada em células tratadas com CSK.As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas a partir de células de câncer de mama MDA-MB-231. Após a amplificação por PCR, os produtos de PCR foram analisados em gel de 1,5% de TBE 0,5X e 1,5% de agarose antes e após a purificação das contas. Os primers são removidos principalmente pela purificação inicial das contas.Padrões de banda de DNA de 1X TAE 1%agarose gel eletroforese e uma eletroforese automatizada também são indicados. O SYBR Gold foi utilizado para visualizar os fragmentos de DNA mostrados aqui. Uma trilha do navegador do genoma mostrando o locus ERS1 é apresentada aqui.A cobertura do genoma dos dados ATAC-seq em células T47D é mostrada nesta imagem. Foram utilizados cartilhas de uma publicação anterior e suas regiões-alvo são destacadas em amarelo. Um gráfico de barras representando o enriquecimento do primer amplicon em bibliotecas ATAC-seq é mostrado aqui.As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas pelo buffer hipotônico ou um buffer CSK. A imagem representativa mostra a visualização do navegador do genoma para otimização ATAC-seq. Os dados ATAC-seq da condição de entrada de 25.000 células mostraram o maior enriquecimento de fragmentos livres de nucleossomos, enquanto a condição de entrada de 100.000 células apresentou os DNAs mononucleossômicos mais altos.Trilhas do navegador do genoma mostrando dados ATAC-seq de diferentes números de células são apresentadas aqui. A análise de anotação de pico HOMER é representada nesta imagem representativa. O HOMER classificou cada pico como um pico proximal ou distal promotor.O número de opções de entrada celular do tampão de lise celular e a concentração da enzima Tn5 dependente do tipo de célula são o parâmetro mais crítico que deve ser padronizado. A Tn5 fundida com a proteína A na técnica de corte e aderência é amplamente utilizada para identificar o local de ligação ao DNA para uma proteína de interesse usando anticorpos específicos para essa proteína de interesse.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um ensaio de cromatina transposase-acessível sequenciando (ATAC-seq) em linfócitos humanos registrados CD4 +. O protocolo foi modificado para minimizar contaminando leituras de DNA mitocondriais de 50% para 3%, através da introdução de um novo buffer de Lise.

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Apresentamos um protocolo para ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) especificamente em adipócitos usando classificação nuclear com tecidos adiposos isolados de camundongos repórteres transgênicos com marcação de fluorescência nuclear.

ATAC-Seq específico de adipócitos com tecido adiposo usando classificação de núcleo ativado por fluorescência

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.

Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4

Aprenda a otimizar o protocolo ATAC-seq para células epiteliais em pesquisa de epigenética do câncer. Este método mapeia regiões de cromatina aberta usando digestão com Tn5 e amplificação por PCR.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

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