Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

A morfogênese de Candida albicans é desencadeada por uma miríade de sinais ambientais. Ao estudar a morfogênese in vivo, estamos determinando como o organismo se integra e responde a todos esses sinais ambientais. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite estudar a morfogênese na ausência de viés ou artefatos que possam ser introduzidos usando sistemas de modelos in vitro.

Muito poucas pessoas têm experiência com injeções intradérmicas. Eu recomendo fortemente que alguém novo nesta técnica entre em contato com seu veterinário de recursos animais para ajudar a aprendê-la. Demonstrando o procedimento estará Rohan Wakade, um pós-doutorando do nosso grupo de laboratório.

Comece por preparar o animal para a inoculação alimentando ração sem clorofila durante pelo menos sete dias antes da inoculação. Um dia antes da injeção, tome um pouco de células albicans do Canadá de uma colônia usando um palito de dente. Inocular 25 mililitros de YPD e repita este processo várias vezes para obter células de várias colônias diferentes.

Incubar a cultura durante a noite a 30 graus Celsius em uma incubadora de agitadores orbitais a 175 RPM. Centrifugar um mililitro de cultura por dois minutos a 500 x g, depois lavar a levedura três vezes com um mililitro de DPBS estéril. Ressuscite o pellet em um mililitro de DPBS estéril e dilua a cultura em 1 a 100.

Conte as células usando um hemocitômetro e, consequentemente, ajuste a densidade celular. Em seguida, crie o inóculo para injeção misturando volumes iguais da cepa referenciada e experimental. Usando um cotonete com ponta de algodão, aplique um creme depilatório sem receita médica liberalmente na superfície interna e externa de ambas as orelhas de um animal anestesiado.

Após dois a três minutos, limpe suavemente a orelha com uma gaze seca seguida de compressas saturadas em água estéril para remover completamente o resíduo de creme depilatório. Depois de esterilizar a superfície das orelhas com etanol a 70%, misture bem o inóculo invertendo o frasco para injetáveis várias vezes ou vortexando-o. Desenhe 20 a 30 microlitros de inóculo numa seringa de insulina.

Segure a agulha na posição vertical e toque suavemente na seringa para garantir que qualquer ar no cano esteja no topo. Ejete cuidadosamente o ar e o excesso de inóculo de volta para o tubo de inóculo ou um tubo de resíduos para que o êmbolo esteja na marca de 10 microlitros. Aplique sobre o balcão fita de pele de dupla face em um pequeno tubo de plástico cônico ou de fundo redondo e passe a orelha através da fita, evitando desalojar o cone do nariz da anestesia.

Mantendo a agulha da seringa quase paralela à pele e evitando grandes veias, insira a ponta da agulha na camada mais externa da pele até que o bisel esteja apenas coberto e injete lentamente o inóculo por via intradérmica. Uma boa injeção intradérmica levantará uma pequena bolha na pele. Mantenha a agulha no lugar por 15 a 20 segundos antes de removê-la da orelha para minimizar o vazamento.

Seguindo os protocolos institucionais, marque a gaiola com rótulos de risco biológico indicando que os animais na gaiola estão infectados com Candida albicans. Usando as mesmas culturas lavadas que foram usadas para preparar o inóculo, criar uma diluição de 1 a 50 células em RPMI 1640, suplementado com 10% de calor e soro fetal bovino ativado e incubar a 37 graus Celsius com tombo por quatro horas. Examine a amostra usando um microscópio.

Conte pelo menos 100 células, registrando o número de leveduras e células filamentosas para cada cepa. Gire a objetiva de longa distância de trabalho no lugar e coloque uma gota de fluido de imersão na lente. Abaixe a lente para evitar possíveis danos ao colocar a tampa.

Coloque a tampa número 1.5 deslize sobre a abertura do palco e cole-a no lugar. Levante a objetiva para que o fluido de imersão esteja em contato com a lente objetiva e com a tampa. Prenda um cone de anestesia no estágio do microscópio de tal forma que cubra totalmente o nariz do animal quando estiver em posição para imagem.

Coloque o nariz de um rato anestesiado no cone do nariz. Coloque uma gota de água estéril na tampa deslize acima da lente objetiva. Ajuste o cone do nariz de anestesia e posicione o mouse de tal forma que a orelha do rato esteja acima da gota de água.

Pegue outro deslize de cobertura e coloque a borda da tampa paralela ao corpo do mouse com a borda tocando o mouse onde a orelha encontra a cabeça. Usando um movimento de dobradiça, abaixe a borda livre da tampa deslize para o estágio do microscópio. À medida que o deslizamento da tampa vem contra o estágio do microscópio, ele achatará a orelha.

Cole a tampa superior deslize com segurança para manter a pressão suficiente para manter a orelha plana e evitar pegar o cabelo ou os bigodes do mouse na fita. A menos que um microscópio com uma câmara ambiental seja usado, cubra frouxamente o corpo do mouse com uma cortina estéril para manter um ambiente térmico normal. Usando luz branca, imagens de campo amplo, ajuste o plano de foco no tecido do ouvido e concentre-se nos glóbulos vermelhos que se movem nos vasos sanguíneos.

Para obter uma relação sinal/ruído forte o suficiente para que a morfologia possa ser determinada para todas as células no campo de visão, ajuste a potência do laser ou a velocidade de imagem. Para evitar danos nos tecidos, use a menor potência de laser possível. Escolha um campo de visão com formação clara de filamentos na cepa referenciada e onde a maioria dos organismos esteja espalhada o suficiente para que sua morfologia possa ser determinada.

Defina os planos superior e inferior de foco para uma pilha Z. Cobrir toda a profundidade da área infectada não é necessário, mas tenha em mente que os organismos na parte superior ou inferior do volume fotografado são tipicamente excluídos da análise. Adquira imagens Z-stack, pseudocolora cada canal para distinguir cada cepa e sobrepor os canais.

Salve as imagens. Use um software de imagem para realizar uma projeção máxima da pilha Z em uma imagem bidimensional. Conte cada organismo visto nas imagens de projeção máxima por tipo de deformação e morfologia.

A estirpe referenciada forma rapidamente filamentos in vitro. Considerando que o EFG1 Nulo não conseguiu formar os filamentos. O EFG1 Null também apresenta um defeito de filamentação significativo in vivo.

Aproximadamente 9% das células EFG1 Nulas cresceram como filamentos in vivo. Da mesma forma, a cepa mutante nula CYR1 apresentou um defeito de filamentação in vitro em comparação com a cepa referenciada. Em contraste, 53% das células mutantes nulas CYR1 cresceram como filamentos in vivo.

Os filamentos formados pelo mutante Nulo CYR1 foram mais curtos que a cepa referenciada. É fundamental manter a agulha paralela à pele durante a inoculação. O objetivo é colocar o inóculo logo abaixo da camada externa da pele.

Esta técnica também pode ser usada com cepas de camundongos que expressam uma proteína fluorescente em células hospedeiras de interesse, permitindo-nos estudar as interações do patógeno hospedeiro in vivo.