Name: Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprenda a preparar suspensões de células não-cardiomiócitos viáveis de corações de camundongos pós-infarto do miocárdio para sequenciamento de RNA de célula única. Este protocolo de baixo custo revela heterogeneidade celular e apoia pesquisas em fisiopatologia cardíaca.

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Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LQ22H020010).

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Zhejiang e foram aprovados pelo Comitê Consultivo Animal da Universidade de Zhejiang.
1. Cirurgia de ligadura da artéria coronária descendente anterior (ligadura da ADA)
NOTA: Camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade foram utilizados como modelos. Os corações foram colhidos 2 semanas após o IM. A cirurgia de ligadura da artéria coronária descendente anterior foi realizada como previamente descrito e demonstrado11.
<ol><li>Desinfetar os instrumentais cirúrgicos com etanol 70% antes da cirurgia.</li>
	<li>Pesar o rato e, em seguida, anestesiar o rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg). Observe o reflexo de pinça dos pés e meça a frequência respiratória para avaliar a profundidade da anestesia durante o procedimento.</li>
	<li>Coloque o rato na mesa de operação com uma almofada de aquecimento a 37 °C. Use pomada oftálmica para evitar a desidratação ocular.</li>
	<li>Depilar o peito e o pescoço precordiais esquerdos com creme depilatório e usar cotonetes para remover os pelos. Desinfetar a pele com iodóforo, seguido de álcool a 70% para limpar a área três vezes.</li>
	<li>Realizar uma incisão cervical mediana (0,8-1,0 cm) ao microscópio. Separe a pele, o músculo e o tecido ao redor da traqueia e, em seguida, insira uma cânula de 20 G na traqueia. NOTA: Observe ao inserir a cânula na traqueia sob visão microscópica para garantir que o tubo não seja inserido no esôfago.</li>
	<li>Conecte o mouse a um ventilador de roedores regulado para 0,2 mL de volume corrente com 150 golpes por minuto.</li>
	<li>Incisar obliquamente o tórax do rato ao longo da linha hemiclavicular com uma tesoura estéril. Dissecar o tecido subcutâneo para expor as costelas.</li>
	<li>Use tesoura estéril para cortar a pele obliquamente ao longo da linha hemiclavicular esquerda (0,8-1,0 cm). Realizar toracotomia esquerda para separar a terceira e quarta costelas para expor o coração. Use um afastador de costela para uma visão clara.</li>
	<li>Abrir o pericárdio com pinça curva e, em seguida, ligar a artéria descendente anterior esquerda (abaixo do apêndice do átrio esquerdo) usando uma sutura de seda 7-0. Uma parede anterior pálida do ventrículo esquerdo indica que a perfusão miocárdica é interrompida com sucesso.</li>
	<li>Solte o afastador de costelas e costurar a incisão torácica em camadas com uma sutura de seda 5-0 enquanto expele ar do tórax. Costurar a incisão do pescoço com uma sutura de seda de sutura 5-0.</li>
	<li>Remova o tubo traqueal do camundongo assim que sua respiração espontânea for restaurada. Injetar intraperitonealmente 0,5 mL de solução salina estéril pré-aquecida. Injetar buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h por via subcutânea para minimizar a dor.</li>
	<li>Finalmente, coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento para aguardar a reanimação. Monitore o mouse para garantir que ele não sofra de dispneia excessiva ou hemorragia por meio da observação visual.</li>
	<li>Devolva o rato à sua gaiola depois de acordar. Durante a primeira semana, monitore o mouse diariamente para verificar se sua mobilidade, higiene e hábitos alimentares estão adequados. De acordo com as necessidades do experimento, colher o coração em diferentes momentos após o IM. OBS: Neste protocolo, a suspensão unicelular foi preparada com o coração 2 semanas após o IM.</li>
</ol>2. Preparo da suspensão unicelular cardíaca
<ol><li>Preparação das soluções e mídias<ol><li>Tampão de dissociação do tecido cardíaco: Misturar 10 mg de colagenase IV (600 U/mL), 5 mg de dispase II (0,5 U/mL) e 50 μL de DNase I (100 μg/mL) em 5 mL de RPMI 1640. Pré-aqueça este meio a 37 °C em banho-maria antes de usar.</li>
		<li>Tampão de lavagem celular: Preparar BSA a 1% ou FBS a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, PH 7.4) e manter a 4 °C ou no gelo.</li>
		<li>Solução de perfusão: Pré-resfriar PBS (PH 7.4) como solução de perfusão.</li>
		<li>Tampão de lise de hemácias (RBC): Use o tampão de lise de hemácias conforme mencionado pelo fabricante. OBS: Consulte a Tabela de Materiais para obter a lista de reagentes e equipamentos utilizados neste estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanasiar o camundongo por uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (150 mg/kg).</li>
	<li>Dissecção cardíaca<ol><li>Coloque o rato em decúbito dorsal fixando os membros posteriores no lugar com fita adesiva.</li>
		<li>Borrife o corpo com etanol a 70% e, em seguida, corte verticalmente através da pele abdominal e músculos, evitando perfurar o fígado. Abra cuidadosamente o tórax, evitando perfurar o coração.</li>
		<li>Use o PBS pré-resfriado (PH 7,4) para perfundir o ventrículo esquerdo até que o fluido de perfusão incolor seja observado (aproximadamente 15 mL de PBS [pH 7,4] são necessários).</li>
		<li>Levante suavemente o coração do tórax com pinças e corte o excesso de tecido preso à parte externa do coração com tesoura oftálmica. Colocar o coração em 1 mL de PBS pré-resfriado (PH 7,4) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissociação enzimática do tecido cardíaco<ol><li>Transfira o coração de camundongo para um poço de uma placa de 24 poços com 150 μL do tampão de dissociação do tecido cardíaco colocado no gelo e corte-o em pequenos pedaços (~1 mm) com uma tesoura.</li>
		<li>Transfira o tecido cardíaco picado para um tubo de centrífuga de 15 mL com 5 mL do tampão de dissociação tecidual. NOTA: O volume recomendado do tampão de dissociação do tecido cardíaco é de 5 mL/coração.</li>
		<li>Colocar o tubo da centrífuga no agitador alternativo termostático eléctrico a 125 rpm durante 1 h a 37 °C. Pipetar a suspensão de tecido para cima e para baixo 10 vezes a cada 20 min.</li>
		<li>Filtrar a suspensão celular através de um filtro celular de 70 μm para remover o tecido não digerido e aglomerados. Adicione 25 mL do tampão de lavagem celular para enxaguar o tubo original e, em seguida, transfira-o para enxaguar o filtro celular. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm para remover ainda mais os aglomerados celulares.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda a amostra celular em 1x tampão de lise eritrocitária por 5 min à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Adicionar quatro vezes mais volume do tampão de lavagem celular e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL do tampão de lavagem celular. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL do tampão de lavagem celular.</li>
		<li>Misturar 18 μL da suspensão celular com 2 μL de solução corante laranja de acridina (AO)/iodeto de propídio (PI) (9:1) e adicionar 10 μL da mistura a uma lâmina de câmara de contagem. Avalie o número de células e a viabilidade usando um contador automático de células.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).</li>
<li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+in+myocardial+injury%2C+repair%2C+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443(2022).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).</li>
<li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681(2021).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li>
<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para isolar cardiomiócitos únicos de corações de camundongos pós-IM. O protocolo pode ser aplicado para isolar diferentes tipos de células no microambiente pós-IM com alta qualidade, incluindo células imunes, células endoteliais e fibroblastos. Três fatores essenciais são cruciais para a obtenção de uma suspensão celular de alta qualidade para o sequenciamento de uma única célula. A primeira é a configuração da digestão enzimática. É importante controlar o tempo de diges...

O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns e sua mortalidade está aumentando em todo omundo1. O IM é causado por um suprimento sanguíneo insuficiente para o miocárdio circundante, que pode ser resultado de um bloqueio da artéria coronária que ocorre com a ruptura da placa aterosclerótica. Embora a intervenção coronária percutânea (ICP) tenha reduzido as taxas de mortalidade de pacientes com IAM agudo, a alta prevalência de insuficiência cardíaca pós-IAM continua sendo um problema2. A principal fisiopatologia subjacente à insuficiência cardíaca pós-IM é a resposta compensatória do organismo às lesões cardíacas, que envolve a substituição do músculo cardíaco morto por cicatrizes fibróticas não contráteis. Essas respostas adaptativas dependem significativamente da inflamação local mediada pelas interações entre múltiplos tipos celulares e células do tecido cardíaco, e essa inflamação é atualmente considerada como um potencial alvo terapêutico para reduzir a formação de cicatriz fibrótica e, assim, proteger contra a insuficiência cardíacapós-IAM3,4. Curiosamente, o microambiente no local do infarto experimenta uma transição tempo-dependente nos tipos e funções celulares infiltrantes em diferentes estágios do IM 1,5. Muitos estudos têm demonstrado que os não-cardiomiócitos (por exemplo, células imunes, fibroblastos e células endoteliais) desempenham papéis centrais na inflamação pós-infarto agudo do miocárdio e no reparo tecidual 5,6. Nos últimos anos, o sequenciamento unicelular tem sido amplamente utilizado como uma poderosa ferramenta para elucidar o envolvimento e as funções de não-cardiomiócitos no microambiente pós-IM7,8. Isso fornece informações sobre a fisiopatologia da lesão e reparo pós-IM e o desenvolvimento de terapias potenciais contra a insuficiência cardíaca pós-IAM.
O sequenciamento de RNA de alto rendimento (RNA-Seq) é uma técnica usada para estudar transcriptomas inteiros em grande detalhe usando sequenciamento de próxima geração (NGS)7,8,9. Recentemente, o desenvolvimento do scRNA-Seq revolucionou o campo da pesquisa biomédica. Em comparação com o sequenciamento convencional em massa, o scRNA-Seq analisa perfis de expressão gênica e heterogeneidade transcricional em nível unicelular 7,8. Essa técnica promove significativamente a pesquisa da fisiopatologia celular do IM 9,10 ao identificar diferentes tipos celulares circulantes no microambiente pós-IM e desvendar a interação entre cardiomiócitos e não cardiomiócitos. Esses achados contribuem ainda mais para a descoberta de novos alvos terapêuticos para a insuficiência cardíaca pós-IAM. Em geral, o experimento pós-MI baseado em scRNA-seq inclui três seções principais: (1) o estabelecimento do modelo animal pós-IM; (2) a preparação da suspensão celular; e (3) sequenciamento das amostras e análise dos dados. Notavelmente, a preparação da suspensão celular é a etapa mais crítica na preparação do experimento scRNA-Seq, pois a qualidade da suspensão celular determina a precisão dos resultados.
Este protocolo é projetado para extrair uma suspensão de células não-cardiomiócitos do tecido cardíaco pós-IM; Significativamente, os detalhes específicos para manter a viabilidade e resolução da célula são incluídos. Enquanto isso, os equipamentos utilizados nesse protocolo, como kits cirúrgicos para camundongos, ventiladores de roedores e centrífugas, podem ser encontrados na maioria dos centros de experimentação animal e laboratórios biomédicos, e, portanto, o custo do experimento desse protocolo é relativamente baixo. Além disso, se considerados os momentos e locais de infarto como variáveis, esse protocolo pode ser aplicado para simular uma ampla gama de cenários clínicos, especialmente para as complicações pós-IM.

<table><tbody><tr><td>Laranja de Acridina / Mancha de Iodeto de Propídio</td><td>Logos biosystems</td><td>F23001</td><td></td></tr><tr><td>Automatizado&nbsp; Célula&nbsp; Contador</td><td>Logos biosystems</td><td>L20001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Servicebio</td><td>G5001</td><td>Efeito citoprotetor</td></tr><tr><td>Contagem de células Slides</td><td>Logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>Enzimas digestivas</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td>Enzimas digestivas</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>Previne a aglomeração de células</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 40&mu; m Filtro de Células</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Remova aglomerados de células</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 70&mu; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Remova o tecido não digerido e aglomerados</td></tr> Flow <tr><td>Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>OU QING SI</td><td></td><td></td></tr> 10054963976859 <tr><td>Porta-agulha</td><td>FST</td><td>12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps oftálmico</td><td>RWD</td><td>F14012-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura oftálmica</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lise Buffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702-120ml</td><td>Remove glóbulos vermelhos</td></tr><tr><td>Rib Retractor</td><td>FST</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador para Roedores</td><td>Harvard</td><td>730043</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Solvente&nbsp; solução de enzima</td></tr><tr><td>Estéril Scissor</td><td>RWD</td><td>S14014-10</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de uma suspensão de células não-cardiomiócitos para sequenciamento de rna de célula Única de um coração de camundongo adulto pós-infarto do miocárdio

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, com mortalidade crescente em todo o mundo. Os não-cardiomiócitos representam mais da metade da população total de células cardíacas e contribuem para compensações adaptativas em caso de lesão miocárdica, incluindo respostas inflamatórias, reparo tecidual e formação de cicatrizes. Para estudar o microambiente cardíaco pós-IM, o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é amplamente utilizado para identificar diferentes tipos de células cardíacas e comunicações intercelulares. Dentre os procedimentos de preparação da amostra de scRNA-seq, o preparo da suspensão celular é uma das etapas mais críticas, pois a viabilidade celular pode afetar a qualidade dos resultados do scRNA-seq. Portanto, projetamos um protocolo experimental para preparar uma suspensão de células não-cardiomiócitos de corações de camundongos pós-IM com um foco extra em melhorar a viabilidade celular através da escolha de enzimas digestivas leves, controle do tempo de digestão e aplicação de classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Finalmente, isolamos as células CD45+ da suspensão de células não-cardiomiócitos obtidas através deste protocolo e, em seguida, realizamos scRNA-seq.

Uma suspensão unicelular com alta vitalidade foi obtida com a aplicação da seção 2 deste protocolo. No entanto, fragmentos celulares ainda puderam ser observados (Figura 1A); portanto, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) foi realizada para melhorar ainda mais a qualidade16. Após o FACS, o tamanho médio das células diminui de 9,6 μm para 9,1 μm ( Tabela 1), o que sugere que a proporção de fragmentos celulares pode ser efetivamente ...

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar uma quantidade suficiente de cardiomiócitos únicos não cardiomiócitos com alta viabilidade de um coração de camundongo pós-infarto do miocárdio (IM). Isso pode ser usado para sequenciamento subsequente de célula única, análise de citometria de fluxo e cultura de células primárias.

Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Nosso protocolo garante a viabilidade celular e a eficiência de isolamento da suspensão de célula única a custos relativamente baixos. Os custos relativamente baixos e a exigência de equipamentos laboratoriais são as principais vantagens dessa técnica. O sequenciamento unicelular revela a heterogeneidade dos não cardiomiócitos na fisiopatologia cardíaca, além de fornecer ideias para estudos básicos e clínicos para doenças cardíacas.Esse protocolo pode ser utilizado nesses estudos sobre o ambiente cardiovascular pós-IAM, como o envolvimento de células imunes. Para preparações de primeira vez, sugiro que atenção extra deve ser dada à amostra de pepsina e tempo de digestão. Uma vez preparados os tampões e as soluções conforme descrito no manuscrito, colocar um camundongo eutanasiado que teve um infarto do miocárdio duas semanas antes em posição supina sobre a mesa cirúrgica.Fixe os membros posteriores com fita adesiva. Para excisar o coração, borrife o corpo com etanol 70%. Faça uma incisão vertical através da pele e músculos abdominais, evitando o fígado.Sem puncionar o coração, abra cuidadosamente o tórax e profuse o ventrículo esquerdo com solução PBS pré-resfriante até que o fluido de perfusão fique incolor. Usando pinças, levante suavemente o coração e corte o excesso de tecidos presos ao seu exterior com tesouras oftálmicas. Coloque o coração em um mililitro de PBS pré-resfriado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Transfira o coração para um poço de uma placa de 24 poços colocada no gelo. Pipetar 150 microlitros do tampão de dissociação cardíaca no poço e cortar o coração em pedaços de um milímetro usando tesoura. Transfira o tecido cardíaco picado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros do tampão de dissociação do tecido.Coloque o tubo em um agitador alternativo termostático. Pipetar a suspensão para cima e para baixo 10 vezes a cada 20 minutos. Para remover aglomerados e tecido não digerido, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrômetros usando 25 mililitros de tampão de lavagem celular.Enxágue o tubo da centrífuga e o filtro celular. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 micrômetros para remover mais aglomerados celulares. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Ressuspender a amostra celular em cinco volumes de tampão de lise eritrocitária e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Agora, adicione quatro volumes do tampão de lavagem celular em suspensão e centrífuga celular, conforme demonstrado anteriormente. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mililitros do tampão de lavagem celular e centrífuga novamente.Ao final da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lavagem celular. Pegue 18 microlitros da suspensão em outro tubo de centrífuga e adicione dois microlitros de solução corante de iodeto de propídio laranja acridina. Adicione 10 microlitros desta solução corada a uma lâmina da câmara de contagem.Avalie o número de células e a viabilidade usando um contador automático de células. Fragmentos celulares foram observados na suspensão cardíaca unicelular. A classificação celular ativada por fluorescência efetivamente reduziu a proporção de fragmentos celulares e aglomeração celular, resultando na diminuição do tamanho médio das células.O sequenciamento de RNA provou uma separação óbvia de sete tipos de células imunes, como demonstrado pelo agrupamento não supervisionado e pela incorporação reduzida de vizinhos estocásticos distribuídos por T. Cada célula imune apresentou alta expressão de marcadores clássicos. O tecido cardíaco precisa ser cortado pequeno o suficiente para evitar a digestão incompleta, o que leva a muitos nódulos celulares na suspensão celular.A suspensão unicelular obtida por este protocolo pode ser posteriormente aplicada na análise de fluxo de cultura celular primária. Esse protocolo beneficia os estudos sobre o microambiente da infecção miocárdica, o que pode ajudar os pesquisadores a olhar além dos tecidos cardíacos e considerar a infecção miocárdica como um problema sistemático.

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Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.

Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.

Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.

Preparação de uma Suspensão Unicelular de Artérias Carótidas de Camundongos para Sequenciamento Unicelular

Aprenda a preparar suspensões de células não-cardiomiócitos viáveis de corações de camundongos pós-infarto do miocárdio para sequenciamento de RNA de célula única. Este protocolo de baixo custo revela heterogeneidade celular e apoia pesquisas em fisiopatologia cardíaca.

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Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio

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