Name: Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a avaliar a ativação de caspases em células imunes inatas usando macrófagos de medula óssea. Este método permite estudar vias de morte celular como piroptose, apoptose e necroptose em modelos de infecção e câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos aos membros do laboratório Kanneganti por seus comentários e sugestões, e agradecemos a J. Gullett, PhD, pelo apoio à edição científica. O trabalho em nosso laboratório é apoiado pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 e CA253095 (para T.-D.K.) e pelas Instituições de Caridade Associadas Sírias Libanesas Americanas (para T.-D.K.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

T.-D.K. é consultor da Pfizer.

O monitoramento da clivagem e ativação da caspase fornece uma das imagens mais abrangentes da ativação inata do PCD imune como parte da resposta imune inata. O protocolo aqui descrito demonstra uma estratégia para monitorar a ativação da caspase em resposta às infecções por IAV, HSV1 e F. novicida e ao gatilho estéril LPS + ATP, mas inúmeros outros estímulos podem induzir PCD e poderiam ser utilizados nesse método, como tem sido demonstrado em várias publicações 44,48,49,50,51,52,53,54,56...

O sistema imunológico inato atua como a primeira linha de defesa durante a infecção e em resposta a estímulos estéreis, como lesão tecidual e alterações na homeostase. Sensores imunes inatos na superfície celular e no citoplasma respondem a padrões moleculares associados a patógenos ou danos (PAMPs ou DAMPs, respectivamente) para desencadear vias de sinalização inflamatória e respostas celulares. Um dos principais processos da resposta imune inata é a indução da morte celular para remover células infectadas ou danificadas e impulsionar ainda mais respostas imunes inatas e adaptativas. A morte celular programada (PCD) é um processo altamente conservado em todas as espécies, destacando sua importância evolutiva como um mecanismo imunológico inato.
Existem várias vias inatas de PCD imunes que podem ser ativadas em todos os tipos de células. As caspases são uma família-chave de proteases altamente conservadas, intracelulares e dependentes de cisteína que são críticas em muitas vias de PCD, incluindo a via de apoptose tradicionalmente não inflamatória, bem como vias inflamatórias de PCD, como piroptose, necroptose e PANoptose 1,2,3,4,5 . Existem 11 caspases humanas e 10 murinas que estão bem definidas, bem como pseudocaspases que podem ser funcionais, e a maioria é expressa constitutivamente como pró-caspases monoméricas ou diméricas inativas que requerem clivagem para ativação 6,7. As caspases também contêm domínios importantes para o recrutamento e formação de complexos multiproteicos. Estes incluem o domínio de ativação e recrutamento da caspase (CARD), que pode ser encontrado na caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 e caspase-11, ou o domínio efetor da morte (DED), que é encontrado na caspase-8 e caspase-10. Através de sua atividade proteolítica e sua capacidade de formar complexos multiproteicos, as caspases são fatores críticos da PCD imune inata.
O papel das caspases na PCD imune inata foi identificado pela primeira vez na apoptose, onde as caspases iniciadoras, caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10, ativam as caspases carrasco, caspase-3, caspase-6 e caspase-7, para conduzir a morte celular 8,9,10,11,12. As caspases do iniciador podem ser ativadas por diversas cascatas de sinalização; a via extrínseca ativa a caspase-8 através da sinalização do receptor de morte induzida por ligantes extracelulares, e a via intrínseca ativa a caspase-9 através da ruptura da integridade mitocondrial13. As caspases iniciadoras ativadas clivam o ligador separando as grandes e pequenas subunidades catalíticas das caspases do carrasco para produzir suas formas ativas. As caspases do carrasco então clivam seus substratos para desmontar a célula, resultando em degradação do DNA, blebbing da membrana, fragmentação nuclear e liberação de corpos apoptóticos14,15. Esse processo geralmente termina em uma forma não lítica e não inflamatória de morte celular quando acoplado à depuração imediata das células moribundas por eferocitose16. No entanto, defeitos na eferocitose ou falta de células fagocíticas podem levar ao acúmulo de células apoptóticas, que então sofrem morte celular lítica e inflamatória17,18.
As caspases inflamatórias, incluindo caspase-1 (humana e rato), caspase-4 e caspase-5 (humana) e caspase-11 (rato), foram descobertas para serem ativadas durante uma forma de PCD IMUNE INATA INFLAMATÓRIA (III-PCD) chamada piroptose. A ativação da caspase-1 está associada à formação de inflamassomas, que são complexos multiproteicos contendo um sensor imune inato citosólico, uma molécula adaptadora (proteína speck-like associada à apoptose contendo um CARD [ASC]) e caspase-1. A formação desse complexo permite que a caspase-1 sofra autoproteólise mediada por proximidade para liberar sua forma ativa, que pode clivar substratos-alvo, incluindo as citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL)-1β e IL-18 e a molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . A casspase-11, a caspase-4 e a caspase-5 também podem ativar o GSDMD sem a formação a montante do inflamassoma após a detecção de PAMPs como o lipopolissacarídeo (LPS)19,20. Essas caspases sofrem dimerização seguida de oligomerização e autoclivagem para ativação após a ligação ao LPS citosólico, o que leva à ativação do inflamassoma não canônico 24,25,26 e ativação da caspase-1 de forma intrínseca à célula para induzir a maturação da IL-1β e IL-18 20. A maturação e a liberação dessas citocinas pró-inflamatórias caracterizam essas caspases como "inflamatórias". Além disso, descobriu-se que a caspase-8 apoptótica localiza-se no inflamassoma, fornecendo uma ligação entre os processos apoptóticos e piropóticos. Estudos descobriram que a caspase-8 apoptótica também é crítica para regular outra forma de PCD chamada necroptose. A perda de caspase-8 resulta na ativação espontânea de serina-treonina quinase 3 (RIPK3) mediada por uma pseudoquinase de linhagem mista mediada por receptores (MLKL) para conduzir a via III-PCD da necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
Embora as caspases tenham sido historicamente classificadas como "apoptóticas" ou "inflamatórias" com base no tipo de morte celular que iniciam, evidências crescentes sugerem que há uma extensa conversa cruzada entre as vias inatas da PCD imune através das caspases 3,4. Por exemplo, a caspase-1 inflamatória dos inflamassomos cliva a caspase-7 apoptótica em seu local de ativação canônica34. A ativação da caspase-1 também pode levar à clivagem de substratos apoptóticos, como a poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1)36. Em células sem GSDMD, a caspase-1 também pode clivar a caspase-337,38. Além disso, a caspase-3 canonicamente apoptótica pode clivar a gasdermina E (GSDME) para induzir a PCD17,18 e também processa a GSDMD em uma forma inativa40. Além disso, o recrutamento da caspase-8 para o complexo inflamassoma tem sido observado 39,40,41,42,43,44,45, e a caspase-8 é um regulador chave da ativação do inflamassoma canônico e não canônico 39. Há também papéis sobrepostos e redundantes para a caspase-8 e a caspase-1 em muitas condições inflamatórias, e a PCD imune inata caracterizada pela ativação de componentes piropóticos, apoptóticos e necroptóticos ocorre em todo o espectro da doença 39,46,47,48,49,50.
Com base nesse crosstalk entre caspases inflamatórias e apoptóticas, uma lacuna fundamental na compreensão mecanicista da imunidade inata e PCD foi identificada, levando à descoberta da PANoptosis. A PANoptose é uma forma única de III-PCD que é ativada em resposta a patógenos, PAMPs, DAMPs e alterações na homeostase e é regulada por PANoptossomos - complexos macromoleculares multifacetados que integram componentes de outras vias de morte celular 44,50,51,52,53,54,55 . A totalidade dos efeitos biológicos na PANoptose não pode ser individualmente explicada por piroptose, apoptose ou necroptose isoladamente 3,4,35,36,39,46,47,48, uma vez que a PANoptose é caracterizada pela ativação de múltiplas caspases, incluindo caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 e/ou caspase-7, dependendo do contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . A PANoptose tem sido cada vez mais implicada em doenças infecciosas e inflamatórias, bem como em cânceres e terapias oncológicas 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
Dado o papel essencial das caspases nas vias de morte celular, inclusive na apoptose, piroptose, necroptose e PANoptose, é importante desenvolver técnicas para caracterizar sua ativação e compreender toda a complexidade das vias da PCD. O protocolo aqui detalha um método para estimular as células e medir a ativação subsequente das caspases (Figura 1). Este método aproveita a clivagem proteolítica das caspases, que geralmente é necessária para a sua ativação, como um meio de estudá-las. Através do western blotting, os tamanhos das proteínas podem ser determinados, permitindo a visualização clara e diferenciação de pró-caspases inativas e suas formas ativadas e clivas.
As principais vantagens deste protocolo são 1) sua capacidade de avaliar a ativação de múltiplas caspases em paralelo a partir de uma única população de células endógenas para determinar com mais precisão a ativação da PCD e 2) o uso de técnicas laboratoriais relativamente simples que não requerem treinamento extensivo ou equipamentos caros. Protocolos anteriores usaram western blotting, repórteres fluorescentes ou coloração de anticorpos para monitorar a ativação da caspase em sobrenadantes de cultura, lisados celulares e teciduais, células inteiras via microscopia e in vivo 67,68,69,70,71, mas essas técnicas geralmente monitoram apenas uma ou duas caspases em uma amostra. Além disso, enquanto substratos peptídicos sintéticos contendo sítios de clivagem da caspase que fluorescem sobre a clivagem têm sido usados para monitorar a ativação da caspase em lisados celulares ou teciduais69, esses substratos muitas vezes podem ser clivados por mais de uma caspase, dificultando a determinação da ativação específica de caspases individuais neste sistema. Além disso, o uso de western blotting em vez do uso de repórteres fluorescentes ou outros métodos baseados em tags permite que os pesquisadores usem células endógenas em vez de criar linhagens celulares específicas com genes repórteres. Existem múltiplas vantagens no uso de células endógenas, incluindo o fato de que muitas linhagens celulares imortalizadas são deficientes em moléculas-chave de morte celular72,73, o que poderia afetar os resultados. Além disso, o uso de células endógenas permite a avaliação de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliais e células endoteliais, em vez de uma única linhagem. Western blotting também é uma técnica relativamente simples e econômica que pode ser realizada em laboratórios em todo o mundo sem a necessidade de equipamentos grandes e caros ou configurações complicadas.
Esse protocolo é amplamente aplicável em toda a biologia para entender as funções dependentes da morte celular e independentes da morte celular das caspases, incluindo seus papéis e funções de andaimes em outras vias de sinalização inflamatória74. A aplicação deste método permite uma abordagem unificada no estudo das vias inatas da PCD imune e da sinalização inflamatória entre doenças e condições, e este protocolo pode ser usado para identificar processos regulatórios críticos e conexões mecanicistas que informarão o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>gel de poliacrilamida a 12% com 10 poços&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 poços</td><td>Agulha Corning</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18 G&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 25 G&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 50 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de célula M&nbsp;</td><td>Placas</td><td>de cultura de tecidos Corning 431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>frasco de cultura de tecidos de 182 cm2</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Acessório branco trans bandeja</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-1</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-11</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-3</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-7</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-8</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-9</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-3 clivado&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-7 clivado&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; anticorpo caspase-8 clivado&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com HRP de camundongo&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com HRP anti-coelho&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com HRP anti-rato&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; &beta;-Actina anticorpo (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Tripticase Caldo de Soja</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Banho de esferas</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biofotômetro D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Raspadores de células Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Produtos Científicos CellTreat 229315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imager de quimioluminescência (Amersham 600)&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; câmara</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td>Papel de filtro <td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr> Pinça <tr><td></td><td>de 1703965</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (cepa U112)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>Gel releaser&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>Vírus Herpes simplex 1 (cepa HF)</td> <td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de glicose alta&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano anticorpo caspase-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano anticorpo caspase-8</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora umidificada&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Vírus Influenza A (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>construído por Hoffmann et al.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células L929</td><td>Linha celular ATCC</td><td>CCL-1</td><td>para criar meios condicionados</td></tr><tr><td>L-cisteína L-cisteína&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP substrato</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>substrato HRP de sensibilidade padrão</td></tr><tr><td>Células MDCK</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>linha celular para determinar o título viral IAV</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 solução&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina&nbsp;</td><td>Placa de Petri Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido inibidor de protease</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF&nbsp;</td><td>Agitador</td><td>de balanço Millipore IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri quadrada</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de decapagem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Super Signal Femto HRP substrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td>substrato HRP de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>Sistema semi-seco Trans-Blot&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo ultrapuro (LPS) de E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>linha celular para determinação do título viral HSV1</td></tr></tbody></table>

avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

A imunidade inata fornece a primeira linha crítica de defesa em resposta a patógenos e insultos estéreis. Um componente mecanicista chave dessa resposta é o início da morte celular imune programada inata (PCD) para eliminar células infectadas ou danificadas e propagar respostas imunes. No entanto, o excesso de PCD está associado à inflamação e patologia. Portanto, entender a ativação e a regulação da PCD é um aspecto central da caracterização das respostas imunes inatas e da identificação de novos alvos terapêuticos em todo o espectro da doença.
Este protocolo fornece métodos para caracterizar a ativação inata da PCD imune monitorando caspases, uma família de proteases dependentes de cisteína que são frequentemente associadas a diversas vias da PCD, incluindo apoptose, pirotose, necroptose e PANoptose. Os relatos iniciais caracterizaram caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10 como caspases iniciadoras e caspase-3, caspase-6 e caspase-7 como caspases efetoras na apoptose, enquanto estudos posteriores encontraram as caspases inflamatórias, caspase-1, caspase-4, caspase-5 e caspase-11, impulsionam a piroptose. Sabe-se agora que há uma extensa conversa cruzada entre as caspases e outras moléculas inatas imunes e de morte celular através das vias PCD previamente definidas, identificando uma lacuna de conhecimento fundamental na compreensão mecanicista da imunidade inata e PCD e levando à caracterização da PANoptosis. A PANoptose é uma via inata de PCD inflamatória imune única regulada por complexos PANoptosome, que integram componentes, incluindo caspases, de outras vias de morte celular.
Aqui, métodos para avaliar a ativação de caspases em resposta a vários estímulos são fornecidos. Esses métodos permitem a caracterização das vias de PCD tanto in vitro quanto in vivo, uma vez que as caspases ativadas sofrem clivagem proteolítica que pode ser visualizada por western blotting usando anticorpos ideais e condições de blotting. Foi estabelecido um protocolo e um fluxo de trabalho de western blotting que permitem a avaliação da ativação de múltiplas caspases de uma mesma população celular, proporcionando uma caracterização abrangente dos processos de PCD. Este método pode ser aplicado em todas as áreas de pesquisa em desenvolvimento, homeostase, infecção, inflamação e câncer para avaliar as vias PCD em todos os processos celulares na saúde e na doença.

PANoptosis tem sido observada em resposta a numerosas infecções bacterianas, virais e fúngicas e outros estímulos inflamatórios, bem como em células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <sup clas...

Este protocolo descreve um método abrangente para avaliar a ativação da caspase (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 e caspase-11) em resposta a modelos in vitro e in vivo (em camundongos) de infecção, insultos estéreis e câncer para determinar o início de vias de morte celular, como piroptose, apoptose, necroptose e PANoptose.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Este protocolo fornece uma compreensão multifacetada da ativação dos processos de morte celular, o que pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos da doença e informar estratégias terapêuticas. Este protocolo baseia-se no uso de uma técnica mais simples e para acessar a ativação de múltiplas caspases imperativas a partir de uma única população de células endógenas para determinar grandemente a ativação. A morte de células imunes inatas tem sido implicada em todo o espectro da doença, de infecções a doenças inflamatórias e cânceres.Compreender os mecanismos moleculares da morte celular através da ativação da caspase pode fornecer insights críticos sobre os processos da doença. O Dr. Julieann, pesquisador associado de pós-doutorado de um laboratório, demonstrará o procedimento. Após isolar a medula óssea e diferenciar as BMDMs, infectar as células com o vírus influenza A.Calcule o volume de vírus necessário em uma multiplicidade de infecção de 20 unidades formadoras de placas. Remova o meio dos BMDMs e lave as células uma vez com 500 microlitros de PBS. Adicione 450 microlitros de vírus Influenza A em DMEM de alta glicose sem FBS inativado por calor a cada poço e incube as pl

evaluation-of-caspase-activation-to-assess-innate-immune-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a ativação de proteínas caspase em macrófagos humanos usando proteínas repórter de complementação de fluorescência bimolecular. Os pró-domínios da caspase-1 são fundidos com fragmentos não fluorescentes de proteínas de Vênus, que são recrutados para complexos inflamassomas. A proximidade dos inflamassomas induz o redobramento e fluorescência dos fragmentos de Vênus, confirmando a ativação da caspase nos macrófagos.

Visualização da ativação de caspase em macrófagos derivados de monócitos humanos

Este vídeo demonstra a avaliação de múltiplas ativações de caspase em macrófagos derivados da medula óssea por meio da estimulação com o vírus influenza. Após a lise dos macrófagos, inativação do lisado pelo calor e centrifugação, as caspases intracelulares são coletadas para análise imunológica subsequente.

Avaliação da ativação de múltiplas caspases em macrófagos

Ensaios Multiplex pode fornecer informações úteis para os mecanismos celulares básicos e eliminar o desperdício de reagentes e experiências repetitivas desnecessárias. Descrevemos aqui um ensaio multiplex atividade caspase-3/7, usando métodos fluorescentes e luminescentes à base, para determinar a viabilidade celular em um modelo in vitro hipotálamo seguinte desafio oxidativo com ácido palmítico.

Utilização de uma caspase Multiplexing ensaio para determinar a apoptose em um modelo de célula hipotalâmica

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho experimental que permite a detecção do processamento caspase-8 diretamente no complexo de sinalização indutor de morte (DISC) e determina a composição desse complexo. Essa metodologia possui amplas aplicações, desde a desvendação dos mecanismos moleculares das vias de morte celular até a modelagem dinâmica das redes de apoptose.

Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

A infecção pelo vírus da gripe A (IAV) ativa as caspases que clivam o hospedeiro e as proteínas virais, que, por sua vez, têm funções pró e antivirais. Empregando-se inibidores, interferência de RNA, mutagênese sítio-dirigida e técnicas de western blotting e RT-qPCR, foram identificadas caspases em células de mamíferos infectadas que clivam a cortactina do hospedeiro e as histonas desacetilases.

Identificando Caspases e seus motivos que clivam proteínas durante a infecção pelo vírus da gripe A

O presente protocolo descreve dois métodos para medir a atividade da caspase através de um substrato fluorogênico usando citometria de fluxo ou um espectrofluorômetro.

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Aprenda a avaliar a ativação de caspases em células imunes inatas usando macrófagos de medula óssea. Este método permite estudar vias de morte celular como piroptose, apoptose e necroptose em modelos de infecção e câncer.

Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas

Explorar mais vídeos