Name: Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em células semelhantes à microglia humana e realize ensaios de fagocitose in vitro com sinaptossomos humanos. Este método simplificado oferece alta pureza e rendimento para estudos de neuroinflamação.

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Os autores agradecem a Michael Ward por fornecer a linha WTC11 hNIL iPSC para diferenciação de neurônios motores e aos Jackson Laboratories por fornecer a linha KOLF2.1J WT clone B03 iPSC usada para diferenciação de micróglias. Também agradecemos a Dorothy Schafer por seu apoio durante a implementação dos protocolos, Anthony Giampetruzzi e John Landers por sua ajuda com o sistema de imagem de células vivas, bem como Hayden Gadd por suas contribuições técnicas durante as revisões e Jonathan Jung por sua colaboração neste estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience da UMASS Chan Medical School e pelo Angel Fund, Inc.

<ol><li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).</li>
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<li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li>
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<li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li>
<li>Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098(2013).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).</li>
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<li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).</li>
<li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).</li>
<li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).</li>
<li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li>
<li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método eficiente para obter células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC em ~6-8 semanas com alta pureza e em um rendimento suficiente para realizar experimentos de imunofluorescência e outros ensaios que requerem um maior número de células. Este protocolo produziu até 1 × 106 iMGs em 1 semana, o que permite a extração de proteínas e RNA e análises a jusante correspondentes (por exemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espectrometria de massa). Dito is...

As microglias são as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel crucial no desenvolvimento do SNC. A micróglia também é importante no cérebro adulto para manter a homeostase e responder ativamente a processos de trauma e doença. Evidências cumulativas mostram que a micróglia é um dos principais contribuintes para a patogênese de múltiplas doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas 1,2. Embora o conhecimento atual sobre a biologia microglial tenha sido predominantemente derivado de modelos de camundongos, estudos recentes têm elucidado diferenças importantes entre a micróglia murina e humana, ressaltando a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para estudar a genética e as funções biológicas da micróglia humana 3,4. O isolamento da micróglia do tecido primário dissecado pode modificar severamente as propriedades da micróglia5, potencialmente confundindo os resultados adquiridos com essas células. O objetivo geral deste método é diferenciar as iPSCs humanas em iMGs, fornecendo assim um sistema de cultura celular para estudar a micróglia humana sob condições basais. Além disso, um ensaio de fagocitose usando um sistema de modelo totalmente humano é incluído aqui como um meio de estudar a funcionalidade dos iMGs, tanto como uma medida de controle de qualidade quanto para avaliar a disfunção de iMG no contexto da doença.
Múltiplos protocolos para diferenciação da micróglia a partir de iPSCs têm surgido recentemente na literatura 6,7,8,9,10. As desvantagens potenciais de alguns protocolos incluem períodos prolongados ou longos de diferenciação, a adição de múltiplos fatores de crescimento e/ou procedimentos experimentais complexos 6,9,10. Aqui, demonstra-se um método de diferenciação "user-friendly" que recapitula aspectos da ontogenia da micróglia por meio da diferenciação de iPSCs em células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Os PMPs são gerados conforme descrito anteriormente, com algumas otimizações aqui apresentadas12. Os PMPs imitam macrófagos derivados de saco vitelino independentes de MYB, que dão origem à micróglia durante o desenvolvimento embrionário, invadindo o cérebro antes do fechamento da barreira hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente PMPs em iMGs, utilizamos um método de monocultura rápido e simplificado baseado em protocolos de Haenseler et al. e Brownjohn et al., com algumas modificações para gerar um método eficiente de diferenciação de micróglias no qual os iMGs expressam robustamente marcadores enriquecidos com microglia 7,8. Este método de diferenciação pode ser reproduzido em laboratórios com experiência na cultura de iPSCs e com objetivos de pesquisa com o objetivo de estudar a biologia da micróglia usando um sistema de modelo humano.
A micróglia derivada da iPSC representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar as funções canônicas microgliais, incluindo a fagocitose. As micróglias são os fagócitos profissionais do cérebro e do SNC, onde limpam detritos celulares, proteínas agregadas e mielina degradada14. A micróglia também atua no remodelamento sináptico por engolfamento de sinapses e na defesa contra infecções externas por meio da fagocitose de patógenos15,16. Neste protocolo, a fagocitose por iMGs é avaliada usando sinaptossomos humanos como material para engolfamento de iMG. Para este fim, uma descrição para isolar sinaptossomos derivados de i3LMNs humanos é descrita. Os sinaptossomos humanos derivados de LMN i3são marcados com um corante sensível ao pH que permite a quantificação de sinaptossomos localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação de fagossomos in vitro. Um ensaio de fagocitose usando microscopia de células vivas é mostrado para monitorar o processo dinâmico de engolfamento da micróglia em tempo real. Este ensaio funcional estabelece uma base para investigar possíveis defeitos na fagocitose microglial na saúde e na doença usando um sistema humano completo.

<table><tbody><tr><td>Anticorpos para análise de imunofluorescência</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-IBA1 anticorpo de coelho</td><td>Wako Chemical USA</td><td>NC9288364</td><td>diluição 1:350</td></tr><tr><td>anticorpo anti-P2RY12 anticorpo de coelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>diluição 1:50</td></tr><tr><td>anticorpo anti-TMEM119 coelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>diluição</td></tr> <tr><td>1:100Anticorpos para análise de Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-Tubulina anticorpo de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td>1:500 diluição</td></tr><tr><td>anti-Sinaptofisina (SYP) anticorpo de coelho</td><td>Abclonal</td><td>A6344</td><td>1:1.000 diluição</td></tr><tr><td>anti-PSD95 anticorpo de camundongo</td><td>Millipore</td><td>MAB1596</td><td>1:500 diluição</td></tr><tr><td>Tampão borato componentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico (100 mM)</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3) BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (75 mM)</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sódio (25 mM)</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Materiais de cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtros de Células</td><td>&nbsp; Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Tratamento para cultura de tecidos</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células, extremidade dupla, lâmina plana e Lâmina estreita, estéril</td><td>CELLTREAT</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>placa de fundo redondo de 96 poços de baixa aderência</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 24 poços Placa de cultura de células multipoços modificada com superfície de fundo plano</td><td>Corning</td><td>353847,</td><td></td></tr> <tr><td>Primaria 6 poços Placa de cultura multipoços modificada com superfície plana transparente de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 96 poços Clear Flat Microplaca inferior</td><td>Corning</td><td>353872</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de dissociação celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>&nbsp; Reagentes</td> de dissociação Corning <td>25058CI</td><td>usados para diferenciação de neurônios motores inferiores</td></tr><tr>Reagentes de dissociação<td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12-605-010</td><td>reagentes de dissociação usados para diferenciação de microglia</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de revestimento para cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR Matriz de Membrana</td><td>Corning&trade;</td><td>354230</td><td>Referido como reagente de revestimento de matriz extracelular</td></tr><tr><td>CellAdhere Laminin-521</td><td>Tecnologia STEMCELL</td><td>77004</td><td>Referido como laminina 521</td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>Reconstituir para 0,1 mg/mL em tampão borato</td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina Sigma</td><td></td><td>&nbsp; P3655</td><td>Reconstituir em 1 mg/mL em tampão borato</td></tr><tr><td>Componentes de iPSC media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kit mTeSR Plus</td><td>Tecnologia STEMCELL</td><td>100-0276</td><td>Para preparar iPSC mídia mixed os componentes para 1x</td></tr><tr><td>Componentes de mídia EB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>PHC9534</td><td>concentração final 50 ng/mL</td></tr><tr><td>iPSC mídia</td><td></td><td></td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>concentração final 10 &micro; M</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>concentração final 20 ng/mL</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>PeproTech</td><td>100-20A</td><td>concentração final 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Componentes do meio base PMP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentração final</td></tr><tr><td>1x Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>concentração final 100 U/mL</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>12001-988</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>Componentes do meio completo PMP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>concentração final 55 &micro; M</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>concentração final 25 ng/mL</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>concentração final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>PMP base media</td><td></td><td></td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>Componentes de iMG base media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>suplemento N2, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>concentração final 100 U/mL</td></tr><tr><td><forte>Componentes do meio completo iMG</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>concentração final 55 &micro; M</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech ou Biologend</td><td>200-34 ou 577904</td><td>concentração final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>iMG meio de base</td><td></td><td></td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>concentração final 5 ng/mL</td></tr><tr><td>TGF-&beta;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>concentração final 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Componentes do meio base de indução</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 com HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>suplemento N2, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>final concentração 1x</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA), 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>Componentes de meios de indução completos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Calbiochem</td><td>565790</td><td>concentração final 0,2 &mu; M e reconstituir reagente estoque a 2 mM em etanol 1:1 e DMSO</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>concentração final 2 &mu; g/mL e reconstituir o reagente estoque a 2 mg/mL em DPBS</td></tr><tr><td>Meio de base de indução</td><td></td><td></td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>inibidor de ROCK Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>concentração final 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Componentes do meio neuronal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td><td>Gibco</td><td>A3653401</td><td>concentração final 1x para meio e suplemento</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>suplemento N2, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA), 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>concentração final 1x</td></tr><tr><td>iPSC linhas usadas neste estudo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLF2.1J: WT clone B03</td><td>The Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WTC11 hNIL National</td><td>Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synaptosome isolation reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Syn-PER Reagente de Extração de Proteína Sináptica</td><td>Thermo Scientific</td><td>87793</td><td>Referido como reagente de lise celular para isolamento de sinaptossomas</td></tr><tr><td> corantes de ensaio de fagocitose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente NucBlue Live Ready</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; R37605</td><td></td></tr><tr><td>PHrodo Red, éster succinimidílico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; P36600</td><td>Referido como corante sensível ao pH</td></tr><tr><td><forte>Outros reagentes de cultura de células</forte></td>Azul de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tripano, solução a 0,4%</td><td>AMRESCO INC</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td>Reconstituir a 40 mM em água estéril</td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma</td><td></td><td>concentração final 10 &micro; M</td></tr><tr><td>DPBS com cálcio e magnésio</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sem cálcio e magnésio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Referido como DPBS</td></tr><tr><td>KnockOut&nbsp; DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>Referido como DMEM-F12 otimizado para o crescimento de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas</td></tr><tr><td>Proteína de camundongo Laminina, Natural</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td>Referido como laminina</td></tr><tr><td><forte>Software e Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Citação 5 imagens de células vivas leitor</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td><td>Biotek</td><td>versão 3.03</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Heat-Shake</td><td>Benchmark</td><td></td><td>refere-se como agitador de tubo</td></tr><tr><td>Sonicator de água</td><td>Elma</td><td>Mode Transsonic 310</td><td></td></tr></tbody></table>

células semelhantes à microglia humana: diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas e ensaio de fagocitose de células vivas in vitro usando sinaptossomos humanos

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

A micróglia são as células imunes residentes de origem mielóide que mantêm a homeostase no microambiente cerebral e tornaram-se um jogador-chave em múltiplas doenças neurológicas. Estudar a micróglia humana na saúde e na doença representa um desafio devido ao suprimento extremamente limitado de células humanas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de indivíduos humanos podem ser usadas para contornar essa barreira. Aqui, é demonstrado como diferenciar iPSCs humanas em células semelhantes à micróglia (iMGs) para experimentação in vitro . Esses iMGs exibem as propriedades esperadas e fisiológicas da micróglia, incluindo morfologia semelhante à microglia, expressão de marcadores adequados e fagocitose ativa. Além disso, é fornecida documentação para isolar e marcar substratos de sinaptossomos derivados de neurônios motores inferiores derivados de iPSC humanos (i3LMNs). Um ensaio de imagem longitudinal de células vivas é usado para monitorar o engolfamento de sinaptossomos humanos marcados com um corante sensível ao pH, permitindo investigações da capacidade fagocítica do iMG. Os protocolos aqui descritos são amplamente aplicáveis a diferentes campos que estão investigando a biologia da micróglia humana e a contribuição da micróglia para a doença.

Para gerar iMGs utilizando esse protocolo, é importante começar com iPSCs indiferenciadas que apresentem morfologia de colônia compacta com bordas bem definidas (Figura 2A). As iPSCs dissociadas mantidas conforme descrito na seção de formação de EB formarão agregados esféricos, denominados EBs, que crescerão em tamanho até o dia 4 de diferenciação (Figura 2B). Uma vez que os EBs são coletados e banhados nas condições apropriadas para a geração de PMP, eles se li...

Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

A micróglia derivada de iPS representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar a biologia da micróglia na saúde e na doença. Apresentamos um protocolo simples de diferenciação de micróglias que requer o uso mínimo de fatores de crescimento e alcança alta pureza e rendimento. Além disso, demonstramos um ensaio de fagocitose totalmente humanizado.As células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC são muito sensíveis à evaporação do meio. Você deve evitar usar os poços no canto da placa de cultura celular e encher todos os poços vazios com água para melhorar a sobrevivência. Uma vez que as células-tronco pluripotentes induzidas, ou iPSCs, tenham atingido 80% de confluência, dissociar as colônias lavando com um mililitro de DPBS e adicionando um mililitro de um reagente de dissociação por dois minutos a 37 graus Celsius.Desaloje as colônias usando um elevador de células raspando várias vezes para criar uma única suspensão celular. Recolha a suspensão e transfira-a para um tubo cónico de 15 mililitros contendo nove mililitros de DPBS. Em seguida, centrifugar as células a 500 vezes g por um minuto, remover o sobrenadante e ressuspender em um mililitro do meio do Corpo Embrionário, ou EB.Tome 10 microlitros de células e dilua um a dois com azul de tripano. Conte as células em um hemocitômetro e, com base na contagem de células, dilua o estoque de células para uma diluição final de 10.000 células por 100 microlitros. Para células de revestimento, adicione 100 microlitros das células diluídas por poço em uma placa de fundo redondo de 96 poços de baixa aderência.Centrifugar a placa a 125 vezes g durante três minutos e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante quatro dias. No segundo dia, usando uma pipeta multicanal, substitua o antigo meio meio EB por um meio novo. Para gerar Precursores Primitivos de Macrófagos, ou PMPs, cubra os poços de uma placa de seis poços adicionando um mililitro de solução de revestimento Matrigel gelada.Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas, ou durante a noite. No quarto dia de diferenciação do EB, usando uma ponta de pipeta de um mililitro, transfira os EBs para os poços revestidos de Matrigel. Pipeta para cima e para baixo para desalojar os EBs do poço.Em seguida, mantenha a placa inclinada para permitir que os EBs se estabeleçam na borda do poço. Uma vez que todos os EBs tenham se estabilizado, pipete suavemente e substitua o meio antigo, mantendo o EB na borda do poço com três mililitros de meio completo PMP recém-preparado. Distribua uniformemente as células nos poços embaralhando manualmente a placa de um lado para o outro e de trás para frente.Em seguida, incube a placa por sete dias para permitir que os EBs se fixem ao fundo do poço. Após sete dias, inspecione os EBs sob um microscópio de campo de luz com quatro vezes de ampliação para garantir que eles estejam presos ao fundo dos poços. Realize uma meia troca média e, no dia 21, substitua o meio completo por três mililitros de meio completo PMP.No dia 28, procure por células redondas referidas como PMPs no sobrenadante. Em seguida, colete o meio contendo os PMPs usando uma pipeta de 10 mililitros e pipetter automático sem perturbar os EBs. Transfira os PMPs no meio para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugar os PMPs coletados a 200 vezes g por quatro minutos e aspirar o sobrenadante antes de ressussuscitá-los em um a dois mililitros de células semelhantes a micróglias, ou meio basal IMG. Em seguida, conte as células no hemocitômetro conforme descrito anteriormente. Centrifugar o resto das células e diluir os PMPs para a concentração desejada.Em seguida, prenda as células a uma densidade de 10 a quintas células por centímetro quadrado em placas tratadas com cultura celular usando meio completo IMG recém-preparado. Para o ensaio de fagocitose de células vivas, placa 20 a 30 vezes 10 para o quarto PMPs em uma placa de 96 poços e 100 microlitros de IMG meio completo e siga o processo de diferenciação por 10 dias. No dia do ensaio, remova 40 microlitros de meio por poço e adicione 10 microlitros da solução de coloração nuclear.Incube a placa por duas horas. Descongele os sinaptossomos rotulados no gelo e sonice suavemente usando um sonicador de água por um minuto. Novamente, coloque imediatamente os sinaptossomos no gelo.Diluir os sinaptossomos marcados em meio completo IMG a um microlitro de sinaptossomos por 50 microlitros de meio. Para controle negativo, preparar 60 micromolares de citocalasina D em meio completo IMG para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Em seguida, adicione 10 microlitros desta solução a cada poço para uma concentração final de 10 micromolares e incube por 30 minutos.Retire a placa da incubadora e incube a 10 graus Celsius por 10 minutos. Mantenha a placa no gelo e adicione 50 microlitros de meio contendo sinaptossomos. Centrifugar a placa a 270 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius e manter a placa no gelo até a aquisição da imagem.Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados. Em seguida, selecione uma lente objetiva 20X. Em seguida, ajuste o foco, o diodo emissor de luz, ou LED, a intensidade, o tempo de integração e o ganho dos canais de campo brilhante e azul.A fluorescência dos sinaptossomos deve ser insignificante no momento inicial. Selecione o número de telhas individuais a serem adquiridas em uma montagem por poço. Adquira 16 telhas no centro do poço, imaginando aproximadamente 5% da área total do poço.Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens. Em seguida, abra o software de análise. Em seguida, abra o experimento que contém as imagens e clique no ícone Redução de dados.No menu, escolha Costura de imagem em Processamento de imagem para criar uma imagem completa dos quatro por quatro blocos individuais na montagem com os parâmetros descritos no manuscrito do texto. Defina um limite de intensidade usando os canais DAPI e RFP para essas imagens. Abra uma imagem e clique em Analisar.Em Análise, selecione Análise Celular e, em Canal de Detecção, escolha uma imagem costurada nos canais DAPI ou RFP. Em seguida, vá para a guia Máscara e Contagem Primária e estabeleça um valor limite e valores de tamanho de objeto que selecionem corretamente os núcleos de célula no canal DAPI ou o sinal de sinaptossomo no canal RFP. Para contar o número de núcleos, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise de Imagem, selecione Análise Celular.Novamente, vá para a guia Máscara Primária e Contagem e, em Canal, selecione as imagens costuradas DAPI e use os parâmetros descritos no manuscrito do texto. Em seguida, vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Contagem de Células. Em seguida, para obter a área do sinal do sinaptossomo, vá para o menu Redução de Dados e, em Análise, selecione Análise Celular.Novamente, vá para a guia Máscara Primária e Contagem e, em Canal, selecione Imagens costuradas por RFP e use os parâmetros detalhados no manuscrito do texto. Em seguida, vá para a guia Métricas Calculadas e selecione Área de Soma de Objetos. Na guia Redução de Dados, clique em OK para permitir que o software analise todas as imagens adquiridas.Depois que as imagens forem analisadas, exporte os valores de Área de Soma de Objetos e Contagem de Células para cada ponto de tempo. Em seguida, divida a Área de Soma do Objeto pela Contagem de Células para calcular a área normalizada por ponto de tempo. Se comparando vários tratamentos, ou genótipos, calcule o índice de fagocitose usando a equação dada.As iPSCs indiferenciadas apresentam morfologia de colônia compacta com bordas bem definidas. As iPSCs dissociadas formaram agregados esféricos denominados EBs e crescem em tamanho até o quarto dia de diferenciação. Quando os EBs são banhados para geração de PMP, eles se ligam às placas revestidas de Matrigel, e uma camada de células se espalha e envolve os agregados esféricos.No dia 28, células redondas com uma grande relação citoplasma/núcleo aparecem na suspensão. Recomenda-se fortemente a cultura de iPSCs em placas revestidas com laminina 521 em vez de Matrigel, devido ao maior rendimento de PMP em placas revestidas com laminina 521. Após a exposição dos PMPs ao meio IMG, as células adquirem uma morfologia semelhante à microglia com um pequeno citoplasma na presença de processos alongados.Além disso, a identidade da micróglia foi verificada por coloração imunofluorescente. Tipicamente, mais de 95% das células expressam IB1 e aproximadamente 90% das células expressam P2RY12 e TMEM119. A análise de Western blot confirmou que a iPSC derivou neurônios motores inferiores para marcadores sinápticos expressos por sinaptossomos, sinaptofisina e proteína de densidade pós-sináptica 95.No controle em relação ao ponto de tempo inicial, por 10 horas, o sinal fluorescente vermelho foi robusto, pois a maioria dos sinaptossomos havia sido engolida e estava localizada em compartimentos intracelulares ácidos. Nos IMGs tratados com Cytochalasin D, uma forte redução do sinal vermelho por zero e 10 horas indicou que o sinal detectado resulta de eventos fagocíticos. A área dos sinaptossomos engolidos aumentou com o tempo até 16 horas.No entanto, a área de sinal vermelho das células tratadas com Cytochalasin D não aumentou com o tempo. As células semelhantes à Microglia derivadas do iPS podem ser usadas para várias aplicações, incluindo fagocitose e resposta inflamatória no estudo de doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas.

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Neste vídeo, realizamos o ensaio de fagocitose microglial para neuroblastoma usando células-tronco pluripotentes induzidas. O ensaio ajuda a avaliar o comprometimento da função microglial em doenças neurodegenerativas.

Ensaio de fagocitose microglial: um ensaio in vitro para estabelecer o modelo de fagocitose microglial para células de neuroblastoma usando macrófagos iPSC

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Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células semelhantes à microglia

Fonte: Funes, S., et. al., Células semelhantes à microglia humana: diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas e ensaio de fagocitose de células vivas in vitro usando sinaptossomos humanos. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a capacidade fagocítica de células semelhantes à microglia usando sinaptossomos marcados com corante fluorescente sensível ao pH.

Ensaio de fagocitose de células vivas de células semelhantes à microglia usando sinaptossomos humanos

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Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

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