Uma abordagem de imagem intravital fluorescente para estudar a dinâmica de sinalização de cálcio induzida por carga em osteócitos de camundongos

Este protocolo fornece uma maneira de observar osteócitos embutidos in vivo, representando um importante avanço no estudo da mecanobiologia óssea. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de observar eventos em nível celular e molecular em osteócitos in vivo, mantendo seu arranjo espacial 3D nativo, fluxo sanguíneo e condições endócrinas, e superando as limitações tipicamente impostas pela experimentação celular in vitro. Esta técnica é projetada para investigação científica básica em modelos de camundongos. Eles ainda não se estendem à terapia ou diagnóstico, mas oferecem a oportunidade de insights que definem a próxima geração de tratamentos ósseos.

[Narrador] Para começar, faça uma incisão com bisturi através da derme entre o segundo e o terceiro metatarsos, começando na extremidade distal e progredindo proximalmente ao longo do comprimento dos ossos. Usando uma pinça, abra o local da cirurgia puxando a pele em direção às bordas medial ou lateral. Ressecção os tendões extensores usando uma tesoura de Vannas reta para expor o terceiro metatarso. Insira o pino de fulcro central do dispositivo de carga metatarsal no pequeno espaço na extremidade distal onde o terceiro metatarso encontra a falange proximal. Em seguida, mova o pino proximalmente até que ele fique no meio da diáfise do terceiro metatarso. Tome cuidado especial para garantir uma interface direta entre o osso e o pino, excluindo qualquer músculo e fáscia. Segure o tornozelo com uma pinça e coloque o pé no banho-maria cheio de DPBS. Prenda a pata no lugar com o suporte de carga e conecte o suporte ao arranjo da célula de carga do atuador. Pegue cuidadosamente a configuração do dispositivo de carregamento com o mouse e coloque-o na plataforma do microscópio. Comece com a objetiva de baixa ampliação no modo de epifluorescência para localizar e centralizar a diáfise média do osso. Depois que uma região de interesse for localizada, mude para uma ampliação objetiva de imersão em água mais alta e mude a óptica para dois fótons. Defina a densidade de pixels usando as configurações de controle de área de Galvo/Ressonância. Para evitar o branqueamento da foto, reduza a potência usando a opção de controle de energia e aumente a amplificação PMT nas configurações de controle do scanner Galvo/Resonance. Identifique a superfície do osso no modo de dois fótons procurando a autofluorescência do periósteo fibroso no canal verde que usa um filtro passa-banda centrado em 525 nanômetros. Se houver um movimento visível do osso durante o carregamento, selecione uma região de interesse diferente ao longo das direções Y ou Z para garantir que ela esteja diretamente sobre o pino de apoio central. Se o movimento persistir, ajuste a posição cirúrgica do pino manualmente sob o terceiro metatarso. Realize imagens de pilha Z com carregamento de acordo com o projeto experimental para registrar os eventos de sinalização morfométrica e, em seguida, imagens da série T com carregamento para registrar os eventos de sinalização induzidos por carga dinâmica. Uma imagem de dois fótons de plano único de osteócitos metatarsais expressando GCaMp6f in vivo é mostrada aqui. A expressão endógena de construtos repórteres de cálcio fornece um alvo fluorescente sem a necessidade de incubação. A projeção 3D Z de osteócitos in vivo capturados com microscopia de dois fótons é apresentada nesta figura. O corte transversal no plano XY e um corte sagital mostram a profundidade da pilha Z. A imagem representativa mostra um exemplo de curso de tempo do sinal fluorescente GCaMp6f de um osteócito incorporado. Em repouso, flutuações ruidosas de baixo nível são exibidas. Com o carregamento, as flutuações de cálcio aumentam em magnitude e regularidade, muitas vezes ocorrendo em sintonia com o carregamento aplicado.

Este método abre caminho para os pesquisadores responderem a perguntas funcionais sobre a mecanobiologia dos osteócitos in vivo que antes só eram possíveis in vitro ou ex vivo.