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D.G. agradece muito o apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) através dos Centros de Pesquisa Colaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), bem como do Centro Alemão de Pesquisa de Infecção (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
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<li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).</li>
<li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification%2C+Rational+Design+and+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756(2022).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li>
<li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075(2014).</li>
<li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li>
<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li>
<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
<li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).</li>
<li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li>
<li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li>
<li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).</li>
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<li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li>
<li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li>
<li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li>
<li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li>
<li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).</li>
<li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNABarcodes%3A+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li>
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<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
<li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+design%3A+A+Goldilocks+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
</ol>

D.G. é co-fundador da AaviGen GmbH. D.G. e K.R. são inventores de um pedido de patente pendente relacionado à geração de variantes do capsídeo AAV que evade a imunidade. Os demais autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, são descritas as etapas necessárias para a engenharia do capsídeo AAV de exibição de peptídeos e para a triagem de bibliotecas de AAV com código de barras, bem como para a análise bioinformática da composição da biblioteca e do desempenho do capsídeo. Este protocolo se concentra nas etapas que facilitam a análise bioinformática desses tipos de bibliotecas, porque a maioria dos laboratórios de virologia tem atraso em habilidades de programação para corresponder à sua proficiência em técnicas de biologia m...

A terapia de transferência gênica é a introdução de material genético nas células para reparar, substituir ou alterar o material genético celular para prevenir, tratar, curar ou melhorar doenças. A transferência de genes, tanto in vivo quanto ex vivo, depende de diferentes sistemas de entrega, não virais e virais. Os vírus evoluíram naturalmente para transduzir eficientemente suas células-alvo e podem ser usados como vetores de entrega. Dentre os diferentes tipos de vetores virais empregados na terapia gênica, os vírus adenoassociados têm sido cada vez mais utilizados, devido à sua falta de patogenicidade, segurança, baixa imunogenicidade e, principalmente, sua capacidade de sustentar a expressão não integradora a longo prazo 1,2,3. A terapia gênica com AAV produziu conquistas consideráveis na última década; três terapias foram aprovadas pela Agência Europeia de Medicamentos e pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para uso em humanos 3,4. Vários ensaios clínicos também estão em andamento para tratar uma variedade de doenças, como hemofilia, doenças musculares, cardíacas e neurológicas, conforme revisado em outros estudos3. Apesar de décadas de avanço, o campo da terapia gênica tem experimentado uma série de contratempos nos últimos anos4 e, principalmente mortes em ensaios clínicos5 que foram suspensas devido a toxicidades limitantes da dose, particularmente para tecidos maciços, como o músculo, ou de difícil acesso, como océrebro6.
Os vetores do AAV atualmente utilizados em ensaios clínicos pertencem aos sorotipos naturais, com algumas exceções1. A engenharia AAV oferece a oportunidade de desenvolver vetores com especificidade e eficiência superior de órgãos ou células. Nas últimas duas décadas, várias abordagens têm sido aplicadas com sucesso, tais como exibição de peptídeos, loop-swap, embaralhamento de DNA do capsídeo, PCR propenso a erros e design direcionado, para gerar variantes individuais de AAV ou bibliotecas com propriedades diversas7. Estes são então submetidos a múltiplas rodadas de evolução dirigida para selecionar as variantes dentro deles com as propriedades desejadas, conforme revisado em outro artigo 1,3. De todas as estratégias de evolução do capsídeo, as bibliotecas AAV de exibição de peptídeos têm sido as mais utilizadas, devido a algumas propriedades únicas: são relativamente fáceis de gerar, e podem alcançar alta diversidade e sequenciamento de alto rendimento, o que permite acompanhar sua evolução.
As primeiras bibliotecas de AAV de inserção peptídica bem-sucedidas foram descritas há quase 20 anos. Em um dos primeiros, Perabo et al.8 construíram uma biblioteca de capsídeos AAV2 modificados, na qual um pool de oligonucleotídeos gerados aleatoriamente foi inserido em um plasmídeo em uma posição que corresponde ao aminoácido 587 da proteína VP1 capsídeo, no eixo de três vezes saliente do capsídeo. Usando a co-infecção de adenovírus, a biblioteca de AAV foi evoluída através de várias rodadas de seleção, e as variantes finais redirecionadas mostraram-se capazes de transduzir linhagens celulares refratárias ao AAV2 parental8. Pouco tempo depois, Müller et al.9 introduziram o sistema de duas etapas para a produção de bibliotecas, uma melhoria significativa do protocolo. Inicialmente, a biblioteca de plasmídeos, juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral, são usados para produzir uma biblioteca de AAV que contém capsídeos quiméricos. Esta biblioteca de transporte AAV é usada para infectar células com baixa multiplicidade de infecção (MOI), com o objetivo de introduzir um genoma viral por célula. A co-infecção com adenovírus garante a produção de AAVs com genoma e capsídeo9 correspondentes. Cerca de uma década depois, Dalkara10 usou a evolução dirigida in vivo para criar a variante 7m8. Essa variante possui inserção de 10 aminoácidos (LALGETTRPA), três dos quais atuam como ligantes, e atingem eficientemente a retina externa após injeção intravítrea10. Este capsídeo projetado é uma história de sucesso excepcional, pois é um dos poucos capsídeos projetados a chegar à clínica até agora11.
O campo experimentou um segundo impulso com a introdução de técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS). Duas publicações de Adachi et al.12, em 2014, e de Marsic et al.13, em 2015, mostraram o poder da NGS para rastrear a distribuição de bibliotecas de capsídeos AAV com código de barras com alta precisão. Alguns anos depois, a NGS das regiões com código de barras foi adaptada à região de inserção do peptídeo para acompanhar a evolução do capsídeo. Körbelin et al.14 realizaram uma triagem guiada por NGS para identificar um capsídeo baseado em AAV2 direcionado para a pulmonar. A análise da NGS ajudou a calcular três escores de avaliação: o escore de enriquecimento entre as rodadas de seleção, o escore de especificidade geral para determinar a especificidade tecidual e, finalmente, o escore combinado14. O laboratório Gradinaru15 publicou o sistema de evolução direcionada AAV baseado em recombinação Cre (CREATE) no mesmo ano, o que facilita uma seleção específica do tipo de célula. Neste sistema, a biblioteca capsid carrega um switch Cre-invertible, já que o sinal polyA é flanqueado por dois sites loxP. A biblioteca AAV é então injetada em camundongos Cre, onde o sinal poliA é invertido apenas em células Cre+, fornecendo o molde para a ligação de um primer de PCR reverso com o primer forward dentro do gene do capsídeo. Este resgate por PCR altamente específico possibilitou a identificação do AAV-PHP. Variante B que pode atravessar a barreira hematoencefálica15. Este sistema evoluiu ainda para o M-CREATE (Multiplexed-CREATE), no qual NGS e geração de bibliotecas sintéticas foram integradas no pipeline16.
Uma versão melhorada desse sistema baseada em RNA do laboratório Maguire17, o iTransduce, permite a seleção no nível de DNA de capsídeos que transduzem funcionalmente as células e expressam seus genomas. O genoma viral da biblioteca de exibição de peptídeos compreende um gene Cre sob o controle de um promotor ubíquo e o gene do capsídeo sob o controle do promotor p41. A biblioteca é injetada em ratos que têm um loxP-STOP-loxP a montante de tdTomato. Células transduzidas com variantes do AAV que expressam o genoma viral e, portanto, Cre expressam tdTomato e, em combinação com marcadores celulares, podem ser classificadas e selecionadas17. Da mesma forma, Nonnenmacher et al.18 e Tabebordbar et al.19 colocaram a biblioteca gênica do capsídeo sob o controle de promotores tecido-específicos. Após injeção em diferentes modelos animais, o RNA viral foi usado para isolar as variantes do capsídeo.
Uma abordagem alternativa é usar código de barras para marcar bibliotecas de capsídeos. O laboratório de Björklund20 usou essa abordagem para bibliotecas de capsídeos de inserção de peptídeos de código de barras e desenvolveu a evolução vetorial AAV racional com código de barras (BRAVE). Em um plasmídeo, o Rep2Cap é clonado ao lado de um transgene marcado com código de barras e repetições terminais invertidas (ITR), com expressão de proteína fluorescente amarela (YFP). Usando sítios loxP entre o final da tampa e o início do código de barras, uma recombinação de Cre in vitro gera um fragmento pequeno o suficiente para NGS, permitindo assim a associação da inserção do peptídeo com o código de barras único (look-up table, LUT). A produção de AAV é realizada utilizando a biblioteca de plasmídeos e os códigos de barras expressos no RNAm são triados após aplicação in vivo , novamente com NGS20. Quando as bibliotecas do capsídeo compreendem variantes de todo o gene do capsídeo (ou seja, bibliotecas embaralhadas), o sequenciamento de leitura longa precisa ser usado. Vários grupos têm usado códigos de barras para marcar essas diversas bibliotecas, o que permite NGS com maior profundidade de leitura. O laboratório Kay21 marcou bibliotecas embaralhadas de capsídeos altamente diversos com códigos de barras a jusante do sinal poliA da tampa . Em uma primeira etapa, uma biblioteca de plasmídeos com código de barras foi gerada, e a biblioteca de genes do capsídeo embaralhada foi clonada nela. Em seguida, uma combinação de MiSeq (leitura curta, maior profundidade de leitura) e PacBio (leitura longa, menor profundidade de leitura), NGS e sequenciamento de Sanger foram usados para gerar sua LUT21. Em 2019, Ogden e colegas do laboratório da Igreja22 delinearam a aptidão do capsídeo AAV2 para múltiplas funções usando bibliotecas que tinham mutações de ponto único, inserções e exclusões em todas as posições, o que finalmente permitiu o design guiado por máquina. Para a geração da biblioteca, fragmentos menores do gene do capsídeo foram sintetizados, marcados com um código de barras, sequenciados de próxima geração e, em seguida, clonados no gene completo do capsídeo. Os dados de NGS foram usados para gerar uma LUT. A biblioteca foi então triada utilizando-se apenas os códigos de barras e o sequenciamento de leitura curta, o que, por sua vez, permite maior profundidade de leitura22.
As bibliotecas com código de barras têm sido predominantemente usadas para selecionar um conjunto de variantes conhecidas, naturais e projetadas após várias rodadas de seleção de bibliotecas de capsídeos ou independentes de um estudo de evolução de capsídeos. A vantagem de tais bibliotecas é a oportunidade de rastrear vários capsídeos, reduzindo o número de animais e minimizando a variação entre os animais. Os primeiros estudos que introduziram essa tecnologia no campo dos AAV foram publicados há quase uma década. O laboratório Nakai 12 marcou 191 mutantes duplos de alanina cobrindo aminoácidos 356 a 736 no VP1 de AAV9 com um par de códigos de barras de12 nucleotídeos. Usando NGS, a biblioteca foi triada in vivo para ligação de galactose e outras propriedades12. Marsic e colaboradores delinearam a biodistribuição de variantes do AAV usando também uma análise de barra dupla 1 ano depois13. Um estudo mais recente em primatas não humanos comparou a biodistribuição no sistema nervoso central de 29 capsídeos utilizando diferentes vias de parto23. Nosso laboratório publicou recentemente telas de biblioteca AAV com código de barras de 183 variantes que incluíam AAVs naturais e projetados. Essas telas no nível de DNA e RNA levaram à identificação de uma variante altamente miotrópica do AAV24 em camundongos, bem como outras exibindo uma alta especificidade do tipo celular no cérebro de camundongos25.
Aqui, descrevemos a metodologia usada neste trabalho e a expandimos para incluir a triagem de bibliotecas de exibição de peptídeos AAV. Isso compreende a geração de bibliotecas de exibição de peptídeos AAV2, um método de PCR digital em gotículas (dd-PCR) para quantificação e, finalmente, um pipeline NGS para analisar as variantes do AAV, baseado em parte no trabalho de Weinmann e colaboradores24. Finalmente, uma descrição da geração de bibliotecas AAV com código de barras e do pipeline NGS usado na mesma publicação é fornecida.

<table><tbody><tr><td>Primer de amplificação</td><td>ELLA Biotech (Munique, Alemanha)</td> <td>-</td> <td>Síntese de segunda fita de inserção de oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA)</td> <td>5067-1504</td><td>Validação de fragmentos de DNA</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA)</td> Validação de fragmentos de <td>DNA</td> <td>G2938C</td></tr><tr><td>AllPrep DNA / RNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>80204</td><td>Extração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>Reagentes Agilent DNA 1000</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EUA)</td><td>5067-1504</td><td>Preparação da biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Sistema de bioanalisador Agilent 2100 Agilent</td><td>Technologies (Santa Clara, CA, EUA)</td><td>G2938C</td><td>Preparação da biblioteca NGS</td></tr><tr><td>BC-SEQ FW:&nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, EUA)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&nbsp;</td><td>Preparação da Biblioteca NGS</td></tr><tr><td>BC-seq rv:&nbsp; &nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, EUA)</td><td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&nbsp;</td><td>Preparação da Biblioteca NGS</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, EUA)</td><td>44-420-3250ML</td><td>Extração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA)</td><td>R0143</td><td>Digestão de inserto de fita dupla</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1851196</td><td>ciclador dd-PCR</td></tr><tr><td>dNTPS&nbsp;</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA)</td><td>N0447S</td><td>Preparação da biblioteca NGS</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sem dUTP)</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1863024</td><td>dd-PCR supermix</td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas para sondas</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1863005</td><td>óleo de geração de gotículas dd-PCR</td></tr><tr><td>Cartuchos DG8 para gerador de gotículas QX100 / QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1864008</td><td>Cartucho de geração de gotículas dd-PCR</td></tr><tr><td>DG8 Suporte de cartucho</td><td>Bio-Rad (Hércules, CA, EUA)</td><td>1863051</td><td>suporte de cartucho dd-PCR</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas DG8 Junta</td><td>Bio-Rad (Hércules, CA, EUA)</td><td>1863009</td><td>tampa dd-PCR para cartucho</td></tr><tr><td>de placas ddPCR de 96 poços, semi-contornada</td><td>Bio-Rad (Hércules, CA, EUA)</td><td>12001925</td><td>placa dd-PCR de 96 poços</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME Eletrocompetente Células</td><td>Lucigen (Middleton, WI, EUA)</td><td>60081-1</td><td>Células eletrocompetentes</td></tr><tr><td>Cuvetes de eletroporação, 1mm</td><td>Biozym Scientific (Oldendorf, Alemanha)</td><td>748050</td> Mistura de primer/sonda <td>GAPDH de eletroporação</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Taqman qPCR primer</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1652660</td><td>Kit</td></tr> de <tr><td>transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td> por eletroporação <td>Applied Biosystems (Waltham, MA, EUA)</td><td>4368814</td><td>ITR_fw de transcrição reversa de cDNA</td></tr><tr><td></td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>primer ITR_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>Primer CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>sonda Illumina NextSeq 500 sistema</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, EUA)</td><td>SY-415-1001</td><td>NGS Library sequenciamento</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td><td>Roche AG (Basel, Suíça)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>Preparação de amostras NGS</td></tr><tr><td>MagnaBot 96 Dispositivo de Separação Magnética</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, EUA)</td><td>V8151</td><td>Preparação de amostras para biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>ND-2000</td><td>Digestão de inserto de fita dupla</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, EUA)</td><td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC</td><td>TC NGS primer</td></tr><tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, EUA)</td><td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT</td><td>C NGS primer</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 ciclos)</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, EUA)</td><td>FC-404-2005</td><td>Sequenciamento de biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Sistema de Biblioteca Ovation para Kit de Amostras de Baixa Complexidade&nbsp;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, EUA)</td><td>9092-256</td><td>NGS Preparação da biblioteca</td></tr><tr><td>PX1 Seladora de Placas&nbsp;</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1814000</td><td>seladora de placas dd-PCR</td></tr><tr><td>Folha Perfurável Heat Seal</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, EUA)</td><td>1814040</td><td>folha de vedação dd-PCR</td></tr><tr><td>Phusion DNA-Polimerase de alta fidelidade</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>F530S</td><td>Síntese de segunda fita de inserção de oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>PEI MAX - Cloridrato de polietilenomina linear de grau de transfecção (MW 40.000)</td><td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, EUA)</td><td>24765-1G</td><td>Preparação da biblioteca AAV</td></tr><tr><td>Sistema de Purificação Seletiva de Tamanho</td><td>ProNex Promega GmbH (Madison, WI, EUA)</td><td>NG2002</td><td>Preparação de amostras para biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polimerase&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>F549L</td><td>NGS Preparação da biblioteca</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche AG (Basel, Suíça)</td><td>5963117103</td><td>extração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>vetor ITR-Rep2Cap2-ITR. Local de inserção do peptídeo dentro do Cap2 ORF, fabricado/preparado no laboratório&nbsp;</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas QX200</td><td>Bio-Rad (Hércules, CA, EUA)</td><td>1864002</td><td>gerador de gotículas dd-PCR</td></tr><tr><td>Leitor de gotículas QX200</td><td>Bio-Rad (Hércules, CA, EUA)</td><td>1864003</td><td>análise de gotículas dd-PCR</td></tr><tr><td>Kit de remoção de nucleotídeos QIAquick</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>28306</td><td>Síntese de segunda fita de purificação de inserção de oligonucleotídeos</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>28704</td><td>Purificação de vetores de plasmídeo</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>12162</td><td>Preparação de DNA da biblioteca de plasmídeos</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Kit de purificação</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>28104</td><td>Preparação de amostra para biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, EUA)</td><td>Q32857</td><td>Preparação da biblioteca NGS</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>Q32851</td><td>Preparação da biblioteca NGS</td></tr><tr><td>QuantiFast PCR Master Mix</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda</td><td>)1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>primer rep_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>primer rep_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>sonda dd-PCR</td></tr><tr><td>DNase livre de RNase</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>79254</td><td>Extração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA)</td><td>R0123</td><td>Digestão do vetor</td></tr><tr><td>5 mm, aço Grânulos</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>69989</td><td>Extração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>TRIMER-oligonucleotídeos</td><td>ELLA Biotech (Munique, Alemanha)</td><td>-</td><td>Oligonucleotídeo degenerado</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA)</td><td>M0202L</td><td>Ligação da biblioteca de plasmídeos</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (Venlo, Holanda)</td><td>85600</td><td>Extração de DNA/RNA</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>primer YFP_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>primer YFP_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, EUA)</td><td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>sonda dd-PCR</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentrador-5 (Tampado)</td><td>Pesquisa Zymo (Irvine, CA, EUA)</td><td>D4013</td><td>Purificação de vetores e ligaduras</td></tr></tbody></table>

isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (aav)

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Os vetores de liberação gênica derivados do vírus adenoassociado (AAV) são uma das ferramentas mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas, evidenciada por dados clínicos encorajadores e pela aprovação de várias terapias gênicas com AAV. Duas razões principais para o sucesso dos vetores AAV são (i) o isolamento prévio de vários sorotipos virais naturais com propriedades distintas, e (ii) o subsequente estabelecimento de tecnologias poderosas para sua engenharia molecular e reaproveitamento em alto rendimento. Aumentando ainda mais o potencial dessas técnicas são recentemente implementadas estratégias para a codificação de barras-capsídeos AAV selecionados no nível de DNA e RNA, permitindo sua estratificação in vivo abrangente e paralela em todos os principais órgãos e tipos celulares em um único animal. Aqui, apresentamos um pipeline básico que engloba esse conjunto de vias complementares, usando a exibição de peptídeos AAV para representar o arsenal diversificado de tecnologias de engenharia de capsídeos disponíveis. Assim, primeiro descrevemos as etapas fundamentais para a geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV para a seleção in vivo de candidatos com propriedades desejadas, seguido por uma demonstração de como codificar as variantes de capsídeos mais interessantes para triagem secundária in vivo. Em seguida, exemplificamos a metodologia para a criação de bibliotecas para sequenciamento de próxima geração (NGS), incluindo amplificação de código de barras e ligadura de adaptador, antes de concluir com uma visão geral das etapas mais críticas durante a análise de dados NGS. Como os protocolos relatados aqui são versáteis e adaptáveis, os pesquisadores podem facilmente aproveitá-los para enriquecer as variantes ideais do capsídeo AAV em seu modelo de doença favorito e para aplicações de terapia gênica.

Geração de uma biblioteca de exibição de peptídeos AAV2. Como um primeiro passo para a seleção de AAVs projetados, a geração de uma biblioteca de plasmídeos é descrita. A inserção peptídica é produzida usando primers degenerados. Reduzir a combinação de códons naqueles de 64 para 20 tem as vantagens de eliminar os códons de parada e facilitar a análise de NGS, reduzindo a diversidade de bibliotecas no DNA, mas não o nível de proteínas. A inserção do oligonucleotídeo é adquirida como DNA de fita simples ...

Geração de biblioteca de exibição de peptídeos AAV e posterior validação através do código de barras de candidatos com novas propriedades para a criação de AAVs de próxima geração.

Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Este protocolo fecha uma lacuna significativa entre a evolução natural dos vírus e seu uso como vetores recombinantes para a terapia gênica humana, permitindo sua engenharia, diversificação e estratificação. Essa técnica permite a triagem paralela de alto rendimento para vírus novos, isolados ou projetados associados a adenovírus, em curto AAV, variantes, economizando assim em números de animais, trabalho, custo e tempo. As variantes do capsídeo AVV identificadas podem aumentar a eficácia e a especificidade da administração de transgenes terapêuticos baseada em AAV, reduzindo assim a dose viral necessária.Isso poderia melhorar a segurança e a aplicabilidade da terapia gênica. A mesma abordagem também poderia ser usada para a engenharia de capsídeos ou promotores de outros veículos de entrega de genes, o que melhora nossa compreensão de sua biologia e seu uso em terapia gênica. Ajudando a demonstrar o procedimento estarão os estudantes de doutorado Jonas Becker e Jixin Liu, as pós-docs Joanna Szumska e Margarita Zayas, bem como as assistentes de pesquisa Emma Gerstmann e Ellen Widtke do meu laboratório.Comece analisando os dados de sequenciamento NGS com Python 3 e Biopython. A análise da NGS é composta por duas etapas. Para a primeira etapa, pesquise os arquivos de sequência em busca de sequências que satisfaçam critérios específicos, como sequências de flanco, comprimento e localização usando o script um e um arquivo de configuração que forneça as informações necessárias.Para a segunda etapa, traduza as sequências extraídas começando na sequência AGWGGC usando o script número dois e a configuração e zuordnung. txt que fornece as informações necessárias. Prepare duas pastas:script e dados.Copie os arquivos compactados Gzip resultantes do sequenciamento para a pasta de dados. Em seguida, copie o Python e os arquivos de configuração para a pasta de script, conforme descrito no manuscrito de texto. Antes de executar os scripts, abra o zuordnung.txt e adicione duas colunas separadas por tabulação. Digite os nomes dos arquivos Gzip na coluna um e o nome final desejado na coluna dois. Altere as variáveis no arquivo de configuração conforme descrito no manuscrito de texto.Usando o comando específico, inicie a detecção e extração da sequência variante. A saída serão arquivos TXT com as sequências de DNA extraídas e seus números de leituras. O cabeçalho deste arquivo contém dados estatísticos e esses dados serão transferidos para os seguintes arquivos.Esses dados TXT serão o arquivo de entrada para o script número dois no qual as sequências de DNA são traduzidas, classificadas e analisadas. Usando o comando específico, inicie a tradução PV e análise dos arquivos de saída de texto do script um, conforme descrito no manuscrito de texto. Os arquivos de saída do script número dois serão nomeados usando a segunda coluna da tabela de pesquisa em zuordnung.txt com extensões baseadas no tipo de análise. Certifique-se de que os três arquivos de saída contenham dados estatísticos nas primeiras linhas e uma primeira coluna com o índice de cada sequência de DNA dos arquivos de texto de entrada. As colunas restantes devem consistir na sequência de DNA, número de leituras, leitura direta ou reversa e sequência peptídica traduzida.As sequências inválidas devem ter NA e não são válidas nas duas últimas colunas. Visualize os arquivos de saída usando o software disponível com base nas necessidades do usuário. Para realizar a análise dos dados de sequenciamento NGS usando código personalizado em Python 3, o fluxo de trabalho compreende a detecção de sequências de código de barras guiadas por sequências de flanco, seu comprimento e localização, bem como a análise de enriquecimento e distribuição de código de barras sobre o conjunto de tecidos.Prepare duas pastas:script e dados. Copie os arquivos compactados Gzip resultantes do sequenciamento para a pasta de dados. Em seguida, copie o python e os arquivos de configuração para a pasta de script, conforme descrito no manuscrito de texto.Antes de executar o script, crie dois arquivos de texto delimitados por tabulação:o capsidvariance. txt com as sequências de código de barras atribuídas a nomes de variantes de capsídeo AAV e a contaminação. TXT com sequências de código de barras que vêm de possível contaminação.Finalmente, edite o arquivo de configuração para incluir as informações do caminho para a pasta com dados de sequenciamento, sequência de regiões de flanco dos códigos de barras, sua posição e tamanho da janela para detecção de código de barras. Execute o script de detecção de código de barras com os caminhos e arquivos de configuração fornecidos usando o respectivo comando. A saída da execução deste comando serão arquivos TXT com recontagens por variante do capsid e o número total de leituras recuperadas dos dados brutos.Avaliar a distribuição do capsídeo AAV com código de barras entre tecidos ou órgãos, na zuordnung. txt, atribua o nome de cada arquivo de texto obtido da execução de detecção de código de barras a um nome de tecido ou órgão. Adicione os nomes dos arquivos de texto na primeira coluna e os nomes de tecidos ou órgãos correspondentes na atribuição delimitada pela guia.Crie um órgão. TXT com a lista de nomes para órgãos dentro e fora do alvo, que correspondem aos nomes dados na atribuição zuordnung. arquivo txt.Em seguida, crie normalization_organ. txt e normalization_variant. Arquivos de texto delimitados pela guia TXT com valores normalizados para todas as variantes do Capsid e todos os órgãos e tecidos.Na primeira coluna com o normalization_organ. txt, escreva os nomes dados para cada órgão, e a segunda coluna com valores de normalização para o tecido correspondente. Preencha a primeira coluna do normalization_variant.TXT com a lista de nomes de capsid e a segunda coluna com os valores normalizados das contagens de leitura para cada capsid na biblioteca em pool. Edite o arquivo de configuração especificando os caminhos completos para todos os arquivos adicionais e execute o script de análise de código de barras usando esse comando específico. O script de análise de código de barras produz vários arquivos, como os arquivos de texto com concentração relativa ou valores RC de distribuição de capsídeo dentro de diferentes tecidos com base em várias etapas de normalização descritas anteriormente, e o arquivo de planilha que combina dados de arquivo de texto em dados de matriz mesclada.Visualize os dados e realize a análise de agrupamento dos dados matriciais conforme descrito no manuscrito do texto. O script irá inserir a concentração relativa. xls e gerar dois gráficos de mapa de calor de cluster hierárquico e análise de componentes principais.Para modificar gráficos ou parâmetros PNG, abra o script R e siga as instruções na seção de comentários. As regiões quantificadas do gene AAV2 rep mostraram que 99,2% foram positivas para ITR, sugerindo que os capsídeos AAV continham todo o genoma viral. Nos três conjuntos, as leituras extraídas com base em sequências de assinaturas específicas da biblioteca representaram cerca de 94% do total de leituras, indicando boa qualidade.Destes, mais de 99% eram leituras PV válidas e mais de 99% das leituras PV válidas eram únicas, sugerindo que a biblioteca estava equilibrada com alta diversidade interna. Os dois principais ramos da hierarquia do mapa de calor refletiram a diferença na eficiência de transdução das variantes do capsídeo. O ramo esquerdo com a maioria das variantes do capsídeo incluiu todos os capsídeos que mostraram um alto valor de concentração relativa na maioria dos tecidos.Além da especificidade hepática surpreendentemente alta, três outros capsídeos exibiram especificidade no diafragma, músculo esquelético, bíceps e cérebro. O ramo direito do agrupamento hierárquico incluiu as variantes do capsídeo com menor eficiência de transdução mais evidente no duodeno e pâncreas. A análise de componentes principais para o subgrupo original forma o grupo de variantes do capsídeo com alta especificidade hepática e descreve o tropismo muscular excepcional do capsídeo VAR60.Ao tentar este protocolo, você precisa prestar atenção aos erros de digitação. A sintaxe também é diferente se você estiver usando o prompt de comando do Windows em comparação com o Linux. Após a identificação de novas variantes do AAV, o potencial terapêutico e translacional precisa ser verificado em um modelo animal falecido ou maior.Essa técnica permite uma comparação direta lado a lado de variantes do AAV em condições idênticas e é extremamente versátil, abrindo caminho para sua tradução em animais de grande porte, ou mesmo em humanos.

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós demonstramos a base técnica para projetar e evoluir molecularmente sintéticos virais adeno-associados (AAV) vetores de terapia genética através de DNA da família baralhar. Além disso, fornecer orientações gerais e exemplos representativos para a selecção ea análise de individuais cápsides quiméricos com propriedades melhoradas sobre células alvo em cultura ou em ratinhos.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e validação de boas práticas laboratoriais na detecção aderente de vetores virais adenoassociados em lágrimas humanas por reação em cadeia da polimerase digital em gotículas em apoio ao desenvolvimento clínico de vetores de terapia gênica.

Um ensaio de reação em cadeia da polimerase digital validável em gotículas para a detecção de vetores virais adenoassociados em estudos de biosshedding de lágrimas

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

A quantificação precisa das cópias do genoma do vetor do vírus adeno-associado (AAV) é crítica, mas um protocolo padronizado ainda não foi estabelecido. Este protocolo descreve um método validado para preparar amostras de AAV purificadas e conduzir a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd_PCR) para quantificar de forma confiável o título do genoma viral.

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Esse protocolo visa introduzir um método para produzir e purificar biomiméticos extracelulares derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) para terapia gênica. A nanovesícula é confinada com bicamadas lipídicas derivadas da MSC e encapsula AAVs recombinantes que carregam o gene de interesse no lúmen. Essa nanovesícula oferece um vetor aprimorado para a entrega de genes in vivo .

Desenvolvimento de Nanovesículas Envolvidas em Membrana por Células-Tronco Mesenquimatosas para Entrega Aprimorada de Genes

Aprenda a isolar vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV). Este método permite a triagem em alta vazão de variantes de AAV para aumentar a eficácia e especificidade na entrega de transgenes terapêuticos, reduzindo a dose viral necessária e melhorando a segurança da terapia gênica.

Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV) (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)

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