Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase
12 de maio de 2023
Aqui, descrevemos um método para transdução de células T humanas com luciferase para facilitar o rastreamento in vivo do tráfego de células T induzido por anticorpos biespecíficos para tumores em estudos para avaliar a eficácia antitumoral e o mecanismo de anticorpos biespecíficos que envolvem células T.
Este método permite que os usuários rastreiem facilmente as células T in vivo para avaliar a cinética de homing e monitorar a persistência das células T. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser repetida em vários momentos no mesmo animal sem a necessidade de sacrifício em citometria de fluxo ou imunohistoquímica. Essa técnica também pode ser modificada para rastrear outros tipos de células imunológicas.
Para cultivar células 293T, preparar um litro de DMEM adicionando 110 mililitros de soro fetal bovino inativado pelo calor e 11 mililitros de estreptomicina com penicilina. Descongelar cinco vezes 10 até a sexta célula 293T e transferi-las para um frasco T175 contendo DMEM. Divida as células de uma a 10 a cada três dias por seis dias antes que as células se tornem mais de 90% confluentes.
Para transfecção, transfira 1,5 mililitros de meio para dois tubos de 50 mililitros usando uma pipeta. Para um tubo, adicione 10 microgramas de plasmídeo VSVG, 20 microgramas de pol de mordaça e 20 microgramas de plasma de escaravelho vermelho ou CBRTDR luciferase plasmídeo e misture. Adicionar 100 microlitros de DNA in vitro transfecção reagente a outro tubo e misturar.
Incubar ambos os tubos à temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfira o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA gota a gota para o tubo contendo os plasmídeos de DNA e misture suavemente com uma pipeta. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos.
Durante a incubação, destacar as células 293T adicionando cinco a 10 mililitros de tripsina a 0,05%. Depois que as células se desprenderem, adicione 10 mililitros de meio e centrifugue a 800 G por cinco minutos. Ressuspenda as células em 1,5 mililitros de meio.
Adicionar o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA e os plasmídeos de DNA às células 293T e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, transferir a suspensão para um balão T175. Adicione 18 mililitros de mídia e incube a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro sem desprender as células e substituí-lo por 18 mililitros de meio fresco. Novamente, incube durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova o sobrenadante viral usando uma pipeta colocada no gelo e centrifuga a 800 G por cinco minutos para peletizar as células e detritos.
Filtre o sobrenadante viral usando um filtro de 0,22 mícron e coloque-o imediatamente no gelo. Para ativação in vitro de células T humanas, adicionar 10 mililitros de PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino ou BSA e dois EDTA milimolares a um tubo estéril de 15 mililitros. Em seguida, para lavar as contas, adicione contas em um tubo e coloque o tubo em um rack magnético.
Após dois minutos, retire o PBS do tubo. Após o preparo do DMEM, adicionar as esferas lavadas e a interleucina-2 ou IL-2 a uma concentração final de 30 unidades internacionais por mililitro. Conte as células T usando um hemocitômetro e coloração com azul de Trypan.
Após a contagem, adicione o número desejado de células T ao meio e inverta suavemente o tubo para misturar. Placa de 2,5 mililitros de meio contendo dois milhões de células T, contas e IL-2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Cultura a 37 graus Celsius em dióxido de carbono umidificado a 5%.
Examinar as células T sob uma objetiva de 20X todos os dias durante três dias para determinar quando transduzir com luciferase. Em seguida, para preparar uma placa de RetroNectina, adicione dois mililitros de 20 microgramas por mililitro de RetroNectina em PBS a um poço de uma placa de seis poços não tratada e incube por duas horas à temperatura ambiente. Aspirar a RetroNectina sem riscar o fundo da placa e adicionar três mililitros de 2% BSA em PBS por poço na placa de seis poços.
Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, para espinoculação, aspirar a BSA e lavar os poços uma vez com três mililitros de PBS. Continue ou substitua por PBS fresco e deixe a placa coberta a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, adicione dois mililitros de sobrenadante viral CBRTDR luciferase por poço e centrífuga a 1.240 G por 90 minutos a 32 graus Celsius. Para a transdução, após a contagem das células T, aspirar o sobrenadante viral e placa dois milhões de células T por poço em seis mililitros de DMEM contendo 30 unidades internacionais por mililitro de IL-2 humana. Examine as células T por dois dias.
Quando as células estiverem quase confluentes, lave-as suavemente do fundo da placa usando uma pipeta e transfira cada poço para um balão T75 separado. Adicionar nove mililitros de meio para um volume total de 15 mililitros por frasco. No dia seguinte, adicione 15 mililitros de meio e confirme o sucesso da transdução realizando citometria de fluxo.
Após anestesiar o camundongo, com agulha calibre 26, injetar retroorbitalmente 20 milhões de células T em 100 microlitros de meio. Administrar 1.000 unidades de IL-2 recombinante por via subcutânea para apoiar a sobrevivência de células T in vivo. Em seguida, administrar o anticorpo biespecífico retroorbital ou intraperitonealmente.
Para exames de imagem in vivo, administrar 100 microlitros de três miligramas de D-luciferina por injeção retroorbital com uma agulha calibre 26 em um camundongo anestesiado. Para capturar imagens, coloque o mouse na câmara apertada do imageador de tal forma que o flanco que suporta o xenoenxerto esteja voltado para cima em direção à câmera. Usando o painel de controle de aquisição, selecione luminescente, fotografia e sobreposição.
Defina o tempo de exposição para automático, o binning para médio e f-stop para um e adquira imagens. Após a primeira imagem, defina o tempo de exposição para corresponder ao calculado automaticamente para a primeira imagem para que as imagens subsequentes possam ser comparadas diretamente. Tire outro conjunto de imagens com o camundongo em decúbito dorsal para avaliar a presença de células T nos pulmões.
As células T armadas traficavam para o tumor mais rapidamente do que as células T desarmadas, deixando os pulmões dois dias mais cedo. A quantificação da infiltração de células T nos tumores ao longo do tempo foi medida por bioluminescência e expressa como bandos totais ou radiância por pixel integrada sobre o contorno tumoral. O tráfego de células T pode ser monitorado por 28 dias após a injeção das células T transduzidas pela luciferase, permitindo rastrear o homing de células T e a persistência durante todo o tratamento.
O tráfico de células T para xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama humano HER2 positivo em camundongos DKO é mostrado. O tratamento com o anticorpo biespecífico HER2 com uma CF não silenciada não teve efeito sobre o crescimento tumoral em comparação com um anticorpo biespecífico controlado. Em contraste, o tratamento com o anticorpo biespecífico HER2 contendo a mutação N297A isoladamente ou em combinação com uma mutação K322A foi capaz de interromper completamente o crescimento do tumor.
Para os grupos com as mutações silenciadoras, o sinal de luminescência das células T atingiu um pico mais alto no terceiro dia pós-injeção e persistiu em um nível mais alto em comparação com o anticorpo biespecífico controlado e o anticorpo biespecífico HER2 não silenciado. Camundongos portadores de xenoenxertos derivados de pacientes com neuroblastoma demonstraram que a depleção de macrófagos positivos para Ly6C aumentou significativamente o homing de células T para tumores, resultando em diminuição do crescimento tumoral e sobrevida prolongada. O efeito foi mais pronunciado nos xenoenxertos derivados de pacientes com osteossarcoma.
Entre os anticorpos biespecíficos direcionados ao antígeno tumoral STEAP1, o formato IGGL SCFV resultou em significativamente mais infiltração de células T no sexto dia após a primeira dose de células T, que persistiu durante o tratamento. Tais observações não foram previstas por ensaios de citotoxicidade in vitro. Depois de rastrear as células T in vivo, os usuários ainda podem realizar imunohistoquímica para determinar mais especificamente onde as células T estão localizadas dentro do tumor ou outros tecidos normais.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para transduzir células T humanas com luciferase, permitindo o rastreamento in vivo da migração das células T para tumores. Esta técnica é particularmente útil para avaliar a eficácia antitumoral de anticorpos biespecíficos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Imunologia
- Oncologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- O rastreamento de linfócitos T in vivo é fundamental para compreender seu comportamento em ambientes tumorais.
- Os métodos tradicionais frequentemente exigem a eutanásia de animais, limitando estudos longitudinais.
- A transdução por luciferase oferece um método de rastreamento não invasivo.
- Essa técnica pode potencialmente ser adaptada para outros tipos de células imunes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para o rastreamento em tempo real de linfócitos T in vivo.
- Avaliar a cinética da homing de linfócitos T para tumores.
- Monitorar a persistência dos linfócitos T ao longo do tempo.
Métodos Utilizados
- Transdução de linfócitos T humanos com luciferase.
- Imagem in vivo para rastrear o movimento dos linfócitos T.
- Avaliação da eficácia de anticorpos biespecíficos.
- Técnicas de cultura celular para células 293T.
Resultados Principais
- O método permite o rastreamento repetido de linfócitos T sem sacrificar o animal.
- Monitoramento eficaz demonstrado no tráfego de linfócitos T para tumores.
- Potencial para adaptação a outros tipos de células imunes.
- Facilita a compreensão do comportamento dos linfócitos T em contextos terapêuticos.
Conclusões
- Essa técnica melhora a capacidade de estudar a dinâmica de células T in vivo.
- Ela fornece informações sobre os mecanismos de ação de anticorpos biespecíficos.
- Aplicações futuras podem se estender a diversos tipos de células imunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O rastreamento quantitativo do tráfego de linfócitos T in vivo representa um ponto crítico no desenvolvimento de anticorpos biespecíficos, permitindo a avaliação direta da homing e persistência de células imunes em modelos de tumores sólidos. Este método fornece confiança preditiva quanto à eficácia terapêutica ao correlacionar a localização dos linfócitos T com os resultados antitumorais, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco nos pipelines de imuno-oncologia. A abordagem melhora a continuidade translacional ao permitir medições repetidas e não terminais ao longo das linhas do tempo de tratamento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos mecanismos de tráfego de linfócitos T em resposta a formatos de anticorpos biespecíficos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao associar características de design do anticorpo à migração de linfócitos T in vivo.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir entre variantes de anticorpos com base na cinética de tráfego.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma leitura quantitativa validada para a infiltração e persistência de linfócitos T em xenoenxertos tumorais.
- Permite avaliação reprodutível e longitudinal da dinâmica de células imunes sem sacrifício de animais.
- Apóia a padronização de ensaios para comparação de candidatos a anticorpos biespecíficos entre estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos com desfechos relevantes da doença em relação ao tráfego imune em tumores sólidos.
- Permite o desenvolvimento de biomarcadores translacionais ao correlacionar sinais de imagem in vivo com a resposta terapêutica.
- Apoia a progressão ajustada ao risco de candidatos com perfis superiores de tráfego e persistência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta em imuno-oncologia, desde estudos mecanicistas iniciais até a seleção de candidatos pré-clínicos, fornecendo uma plataforma reutilizável para avaliação de terapêuticas que envolvem linfócitos T.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a homing e a persistência de linfócitos T para esclarecer o mecanismo de ação de anticorpos biespecíficos.
- Triagem: Fornece dados quantitativos padronizados de tráfego celular para triagem de candidatos.
- Análise: Permite a comparação estatística da cinética de tráfego e da persistência entre diferentes formatos de anticorpos e intervenções.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados pré-clínicos a desfechos clínicos por meio da modelagem da dinâmica de células imunes in vivo.
- Reutilização em Escala: Adaptável para o rastreamento de outros tipos de células imunes ou modalidades terapêuticas em estudos futuros.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na seleção de candidatos ao associar tráfego celular à eficácia.
- Valor Operacional: Reduz o uso de animais e permite medições repetidas e padronizadas entre coortes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados mecanicistas sobre o comportamento das células imunes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de formatos de anticorpos biespecíficos com perfis superiores de tráfego celular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de linfócitos T, transdução viral e imagem in vivo.
- Exige acesso à infraestrutura de imagem por bioluminescência e software analítico.
- A padronização dos parâmetros de imagem é essencial para a comparabilidade entre estudos.
- A adaptação a outros tipos de células imunes pode exigir otimização do protocolo.
- A quantificação do sinal pode ser influenciada pela localização do tumor e profundidade do tecido.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Transfection of 293T Cells with Luciferase and Harvest of Viral Supernatant
3:22
Expansion and Transduction of Activated Human T Cells with Luciferase
6:20
Engraftment of Luciferase‐Transduced T cells in Immunocompromised Mice and In Vivo Imaging
7:41
Results: Evaluating the Anti‐Tumor Efficacy and Mechanism of T Cell‐Engaging Bispecific Antibodies
9:51
Conclusion
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